专利名称：液相色谱－串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法
技术领域：
本发明涉及人参中真菌毒素含量的测定方法，具体涉及采用液相色谱-串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法。
背景技术：
真菌毒素(Mycotoxin)，也称霉菌毒素，是真菌产生的次级代谢产物，一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。由于真菌的寄生和真菌毒素的产生，严重影响农作物的产量，降低农产品和饲料品质，造成巨大经济损失。人或动物摄入被真菌毒素污染的农、畜产品，或通过吸入及皮肤接触真菌毒素可引发多种中毒症状。如致幻，催吐，出血症，皮炎，中枢神经受损，甚至死亡。动物试验和流行病学的调查结果还证实，许多真菌毒素还可在体内积累后产生致癌、致畸、致突变、类激素中毒，白细胞缺乏症等，对机体造成永久性损害(参 见张艺兵等，农产品中真菌毒素的检测分析[M]北京化学工业出版社，2006)。目前研究关注的真菌毒素主要集中在黄曲霉毒素(aflatoxin)，赭曲霉毒素(0A),呕吐毒素(DON),伏马毒素(FUM),玉米赤霉烯酮(ZEN), T-2毒素及展青霉素(PAT)等。随着对真菌毒素�：Φ纳钊胙芯浚谥鸾ト鲜兜狡涠陨缁峋煤腿死嘟】翟斐傻难现赝玻鞴砸┢肥称分姓婢舅氐姆植技凹觳庖捕加枰粤思蟮墓刈ⅲ乇鹗桥访思懊拦确⒋锕腋嵌源松瓒搜细竦南蘖抗娑�。食品方面，我国已相继出台了很多有关真菌毒素的法定标准(参见GB2715-2005食品中真菌毒素限量[S]和GB2761-2005食品中真菌毒素限量[S])，但在药品领域，除中国药典收载了黄曲霉毒素的检测方法(参见中国人民共和国药典2010年版[S])外，尚无其他标准出台。而已有的食品标准均为针对单一的真菌毒素进行检测，尚无同时检测多成分残留的标准出台。因此，急需开发药品特别是人参中真菌毒素多成分残留的高效测定方法。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种采用液相色谱-串联质谱测定人参中真菌毒素含量的方法。该方法可用于人参中真菌毒素残留的筛查，为拟定药品中真菌毒素的标准提供技术服务。本发明通过如下技术方案实现提供一种用于测定人参中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(I)用HLB柱对待测人参样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种真菌毒
素的含量。根据本发明的一个优选的实施方式，所述真菌毒素包括黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A ;其中所述黄曲霉毒素包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述HLB柱在预处理人參样品前先用甲醇洗脱，再用水洗脱。根据本发明的一个优选的实施方式，所述人參样品的预处理包括用甲醇提取待测人參样品，上HLB柱并收集流出HLB柱的溶液的步骤；或包括用甲醇提取待测人參样品，上HLB柱并用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液的步骤。根据本发明的ー个特别优选的实施方式，人參样品的预处理包括精密称取人參样品粉末，精密加入甲醇溶液，超声处理，离心，滤过，精密吸取上清液，用水稀释，摇匀，取稀释后的溶液通过已经处理好的HLB柱，直至有适量空气通过，收集流出HLB柱的溶液，用氮气缓慢吹干，精密加入甲醇溶液使溶解，即得；或在样品上HLB柱后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气缓慢吹干后，精密加入甲醇溶液使溶解，离心，取上清液，即得。根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色 谱条件为采用C18柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。优选地，所述C18柱的粒径为I. 7 5 μ m,柱内径2. I 4. 6mm,柱长为5 IOcm,更优选为ACQUITY UPLC BEH C18柱；B相的浓度为O. 01 O. 05%，优选O. 01% (体积);A B体积比为5 95%: 95 5%，优选流速为O. 2 O. 4ml/min，优选O. 3ml/min。根据本发明的一个优选的实施方式，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100 120伏、碰撞池能量为-48 53伏。本发明方法还包括用各种真菌霉素的标准品绘制标准曲线，并由此计算人參样品中各种真菌霉素的含量。本发明方法为首次应用于人參中真菌毒素多成分残留的检测与分析。本发明方法在药品真菌毒素的多成分残留的检测中，可以有效排除干扰、保证待测物的稳定。该测定分析方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于人參或类似药材中真菌毒素的多成分残留测定。本发明方法通过液相色谱-串连质谱对人參样品进行进样分析，检测人參中多种真菌毒素的残留量，分析成本低、同时又減少了假阳性，提高了測定的准确性，有较强的实用性。该方法对人參中真菌毒素多成分残留的检测具有重要指导意义，对新药等关键技术有良好的指导意义，可应用于新药研发质控等多个方面。该方法可有效应用于国家标准的制订、企业新药的研发、企业现有产品质控方法的提升。
图I为负离子模式的混合标准品溶液(I)的总离子流图；图2为负离子模式的混合标准品溶液(2)的总离子流图；图3为正离子模式的混合标准品溶液(2)的总离子流图；图4为负离子模式的供试品溶液⑴的总离子流图；图5为负离子模式的供试品溶液(2)的总离子流图；图6为正离子模式的供试品溶液(2)的总离子流图；图7为负离子模式的加样回收供试品溶液(I)的总离子流图；图8为负离子模式的加样回收供试品溶液(2)的总离子流图9为正离子模式的加样回收供试品溶液(2)的总离子流图。
具体实施例方式实施例II、材料与方法I. I主要仪器与试剂API 4000串联四极杆质谱仪(美国应用生物系统公司)，ACQUITY UltraPerformance LC液相色谱仪(美国Waters公司)，MIKRO 200R离心机(德国Hettich公司)，超纯水机(美国Millipore公司)。黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A标准品(美国SUPELC0公司);こ臆、甲酸、甲酸铵均为色谱纯。HLB浄化柱(Waters公司)。I. 2实验方法I. 2. I色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18 (I. 7 μ m，2. I X 100mm);以 100 % 甲醇为流动相 A 相，以O. 01%甲酸为流动相B相，流速O. 3ml/min ;按下表进行梯度洗脱表I、流动相梯度
权利要求
1.用于测定人參中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)用HLB柱对待测人參样品进行预处理； (2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人參样品中ー种或多种真菌毒素的含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、T-2毒素、伏马毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素或赭曲霉毒素A。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述黄曲霉毒素选自黄曲霉毒素B1、黄曲霉韋素B2、黄曲霉韋素G1或黄曲霉韋素G2。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述HLB柱在预处理人參样品前先用甲醇洗脱，再用水洗脱。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中待测人參样品的预处理包括用甲醇提取待测人參样品，上HLB柱并收集流出HLB柱的溶液的步骤；或包括用甲醇提取待测人參样品，上HLB柱并用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液的步骤。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中待测人參样品的预处理包括精密称取人參样品粉末，精密加入甲醇溶液，超声处理，离心，滤过，精密吸取上清液，用水稀释，摇匀，取稀释后的溶液通过已经处理好的HLB柱，直至有适量空气通过，收集流出HLB柱的溶液，用氮气吹干，精密加入甲醇溶液使溶解；或在样品上HLB柱后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气吹干后，精密加入甲醇溶液使溶解，离心，取上清液。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的色谱条件为采用C18柱，流动相由A相和B相组成，A相为甲醇，B相为甲酸，采用梯度洗脱。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相色谱-串连质谱法的质谱条件为采用电喷雾离子源，采用正负离子模式进行数据采集，去簇电压为-100 120伏、碰撞池能量为-48 53伏。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述C18柱的粒径为I.7 5 μ m，柱内径.2.I 4. 6mm,柱长为5 10cm。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述C18柱为ACQUITYUPLC BEH C18柱。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为O.01 O. 05%。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中B相的浓度为0.01%。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其中A B体积比为5 95% 95 .5%。
14.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,其中流动相的流速为O.2 O. 4ml/min。
全文摘要
本发明公开一种液相色谱-串连质谱法测定人参中真菌毒素含量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)对待测人参样品进行预处理；(2)通过液相色谱-串连质谱法测定经预处理后的人参样品中一种或多种真菌毒素的含量。该测定方法灵敏度高、专属性强、准确度好，可用于人参或类似药材中真菌毒素的多成分残留测定。
文档编号G01N30/72GK102692469SQ20111006738
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月21日 优先权日2011年3月21日
发明者于建, 吴赵云, 夏晶, 孙健, 孟茜, 季申, 张甦, 张道广, 李丽敏, 毛丹, 毛秀红, 王少敏, 王枚博, 王柯, 王欣美, 简龙海, 胡青, 苗水, 许勇, 郏征伟, 郑荣, 钟吉强, 陆继伟, 陈铭, 陈静 申请人:上海市食品药品检验所
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