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专利名称：使用多功能生物素类似物的生物分子标记的制作方法
使用多功能生物素类似物的生物分子标记本发明涉及生物素类似物，以及使用其标记靶结构和生物分子，例如体内或体外的肽和蛋白的方法对细胞信号通路中蛋白表达、定位和/或构象变化的追踪需要创造在体内用对具有荧光基团或其他有用的探针的蛋白进行位点特异性标记的通用工具。传统的化学方法依赖于半胱氨酸或赖氨酸侧链的亲核性，但对于体内应用太过混杂。基因方法，例如与绿色荧光蛋白(GFP)融合，携带了大量负荷(GFP含有238个氨基酸)，并且在变色范围和分光镜读出的性质上很有限。最近几年，引进了许多用于把小分子探针位点特异性地加到具有特定的肽序列的蛋白上的方法，包括 TetraCys/FlAsH 体系(B. A. Griffin, S. R. dams, R. Y. Tsien, Science, 1998，281，269-272)，HexaHis 标记(S. Lata, Μ. Gavutis, R. Tampe, J. Piehler, JACS，2006， 128,2365-2372),以及 polyAsp 标签(H. Nonaka，S. Tsukiji, A. Ojida, I. Hamachi, JACS, 2007，129，15777-157779)。多种酶介导的标记体系也被报道，包括那些使用分选酶A/ SorTag 的(M. W. Popp, J. M. Antos, G. M. Grotenbreg, E. Spooner, H. L. Ploegh, Nature Chem. Biol. 2007,3, 707-708 ；Τ.Tanaka,Τ. Yamamoo,S. Tsukiji,Τ. Nagmune,CemBioChem, 2008,9, 802-807)，使用转谷氨酰胺酶 /Q-tag 的(C. W. Lin, Α. Y. Ting, JACS, 2006，128，4542-4543)， 使用生物素连接酶的(I. Chen，Μ. Howarth, W. Lin, Α. Y. Ting, Nature Methods，2005，2， 99-104 ；M. Howarth, K. Takao, Y. Hyashi, A. Y. Ting, PNAS，2005，102,7583-7588 ；M. Howarth et al. Nature Methods，2006，3，267-273)以及使用硫辛酸连接酶的(M. Fernandez-Suarez et al. Nature Biotech. 2007,25,1483-1487 ；H.Baruh, S.Puthebveeti1, Y.A.Choi, S. Shah, Α. Y. Ting, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008，47，7018—7021)。许多天然酶演变了底物特异性标记以实现其生物学功能。一个实例是大肠杆菌酶生物素连接酶(BirA)，其参与将来源于重碳酸盐的CO2转化为有机酸以形成多种细胞代谢物(Chapman-Smith et al. J. Nutr. 129 :477S_484S，1999)。其在细菌中只有一种天然底物生物素羧基载体蛋白(BCCP)，其使赖氨酸122生物素化以使其准备被重碳酸盐羧化。 Schatz等使用肽筛选确定了能够被识别并且被BirA酶促生物素化的最小的，15个氨基酸的月太·歹IJ (Schatz et al. Biotechnology 11 1138-1143,1993 ；Beckett et al. Protein Sci. 8 921-929,1999.)。上述 15 个氨基酸的序列 TTNWVAQAFKMTFDP (SEQ. ID No. 19)是最有效的从噬菌体展示文库中发酵生物素连接酶的15个氨基酸受体肽序列(I. Chen，Y.-Α. Choi and A. Y. Ting，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，6619)。将这个被称为〃 Avi_Tag 〃 的改性序列引入感兴趣的蛋白从而在体外或活菌中进行位点特异性生物素化的纯化的BirA和克隆载体是有售的。(Avidity，Boulder, Colo. USA)是一个源自肺炎克雷伯菌BCCP的72 个氨基酸的序列，由Irwitrogen以商品名BioEase 提供。BioEase 表达体系提供了一种表达、纯化以及检测生物素化重组蛋白的方法。BioEase 载体包括一个源自肺炎克雷伯菌草酰乙酸脱羧酶的72个氨基酸的序列，其能够在体外指导特定赖氨酸残基的生物素化。载体上制得的蛋白被表达为带有这个序列的融合蛋白。生物素(维生素H或B7)以及其类似物在以前也被描述涉及在体内或体外标记肽和蛋白。已知BirA能高选择性地连接酮生物素到包括在特定的15个氨基酸序列中的赖氨酸的 α-氨基上(Chen et al Nature Meth. 2005,2,99-104 ；McNeill et al. Organic Lett. 2006 8，4593-4595)。使用酮生物素的问题在于在缺乏酶BirA时，酮基也相对活泼， 导致其与生物素连接酶或反应体系中的其它蛋白上的赖氨酸侧链反应。而且，该化合物被发现产生一个抑制BirA连接产率到 50%的产物。其它的生物素类似物也被制备出来。除其他外，Ting还等制备了，特别是脱硫生物素叠氮化物、顺-N-炔丙基生物素、以及反-N-炔丙基生物素，并且将这些作为来源于多 f ·禾中白勺白勺(Human, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,Pyrococcus horikoshii,Trypanosoma cruzi,Glardia Iambiia,Methanococcus jannaschii 禾口 Escherichia coli (BirA)(Slavoff et al.J.Am. Chem. Soc. ,2008,130, 1160)。据证明，酿酒酵母酶可以使用顺-N-炔丙基生物素，而超嗜热古菌酶可以使用脱硫生物素和顺-N-炔丙基生物素作为底物。然而，这些类似物没有以与天然生物素同样的水平加成到15-氨基酸受体肽上。此外，由于生物素上的正交基团的位置，可以预料这些生物素类似物对抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素标记抗体或其它与抗生物素连接的蛋白仅具有低亲合力。一旦与适合的反应物反应，这些分子可能表现出对这些蛋白更低的亲合力。本发明的一个目的是提供一种新的生物素类似物，其为生物素连接酶的底物，并且以可接受的，理想的与天然生物素接近的效率水平，加成到特定的肽上。本发明进一步的目的在于提供一种新的生物素类似物，其具有可接受的，优选可逆的，与抗生物素蛋白、链霉亲和素、或它们的其它突变体或同系物的结合亲合力。本发明更进一步的目的在于提供一种新的生物素类似物，其与到目前为止制备的生物素类似物相比通过更少的步骤和/或更高的产率更容易地合成。本发明的另一个目的在于提供一种采用新的生物素类似物作为亲和标签或进一步连接分子探针的共价连接特异性位点标记靶生物分子结构，例如蛋白质和肽的方法。因此，本发明的第一方面提供了一种生物素类似物，其包含天然生物素的脲环，以及至少一个经修饰的噻吩环或一个经修饰的侧链，其具有功能性端基以及位于侧链其它位置的至少一个生物正交性化学反应基团。优选地，所述生物素类似物具有天然生物素未经修饰的噻吩环，仅具有一个经修饰的侧链，其具有功能性端基以及位于侧链其它位置的至少一个生物正交性化学反应基团。然而，可以意识到，噻吩环的硫可以被选自CH2、O、NH和C = O的其它基团所取代，例如， 当经修饰的戊酸侧链中的功能性基团与存在于噻吩环的硫原子不稳定时。作为选择的，所述类似物可以包含具有经修饰的戊酸侧链的脱硫生物素。优选地，所述功能性端基选自包括羧酸、醇、醛、胺、硫醇和卤素的组。天然生物素的结构如下
权利要求
1.一种新的生物素类似物，包含天然生物素的脲环、任选地包含被修饰的噻吩环以及一个被修饰的侧链，其具有一个功能性端基和位于侧链其它位置的至少一个生物正交性化学反应基团。
2.如权利要求1所述的新的生物素类似物，其中功能性端基选自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和卤素组成的组。
3.如权利要求1或权利要求2所述的生物素类似物，其中至少一个生物正交性化学反应基团选自由叠氮化物、炔、烯、杂环基团、二烯基团和/或一个或多个选自S、N、Se、P和0 的杂原子组成的组。
4.如权利要求1、权利要求2或权利要求3所述的生物素类似物，其中反应基团位于生物素类似物戊酸侧链上，或是戊酸侧链的一部分，或取代了戊酸侧链。
5.如前述权利要求之一所述的生物素类似物，其中生物素类似物中噻吩环的硫环被其它基团所取代，其它基团选自由CH2、0、NH和C = 0的组。
6.如权利要求1至4任一项所述的生物素类似物，其中所述生物素类似物为具有被修饰侧链的去硫生物素。
7.如权利要求3所述的生物素类似物，其具有如下通式
8.如权利要求7所述的生物素类似物，其中功能性端基选自由羧酸、醛、醇、胺、硫醇和卤素组成的组。
9.如权利要求7或权利要求8所述的生物素类似物，其中生物正交反应基团位于戊酸侧链1至5的任一位点。
10.如权利要求9所述的生物素类似物，其中生物正交反应基团在生物素类似物戊酸侧链的2位点上提供。
11.如权利要求7、8或9所述的生物素类似物，其中R选自以下侧链
12.如权利要求7至10任一项所述的生物素类似物，其中保留了所述类似物戊酸侧链的5-碳骨架。
13.如权利要求7至10任一项所述的生物素类似物，其中戊酸侧链的骨架含有1至10 个碳原子。
14.如权利要求12或13所述的生物素类似物，其中戊酸侧链的骨架包括ー个或多个杂 原子，杂原子选自由硫、氮、硒、磷或氧组成的組。
15.一种新的生物素类似物，具有结构
16.一种新的生物素类似物，具有结构
17.一种新的生物素类似物，具有结构
18.一种新的生物素类似物，具有结构
19.一种新的生物素类似物，具有结构
20.一种新的生物素类似物，具有结构
21.如前述任一项权利要求所述的生物素类似物，进一步地被修饰，在端基结合活性酯形成中间体化合物。
22.如权利要求21所述的生物素类似物，具有以下通式
23.如前述任一项权利要求所述的生物素类似物，其以中等至高的亲合力与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、或它们的同族体，和/或抗生物素抗体和/或合成的生物素受体结I=I ο
24.如权利要求23所述的生物素类似物，其中所述类似物可以通过环境的变化或被更紧密的结合配体取代而从其与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或抗生物素抗体中释放。
25.如权利要求4至24中任一项所述的生物素类似物，其中所述生物素类似物的戊酸侧链包括在生物素类似物的双环核心和端基以及生物正交基团之间具有可断裂的连接体。
26.被如前任一项权利要求所述的生物素类似物标记的特定的靶结构。
27.如权利要求26所述的特定的靶结构，其中所述靶结构通过标准耦合化学连接到生物素类似物上。
28.如权利要求26所述的特定的靶结构，其中所述靶结构为蛋白或肽，并且包括作为生物素类似物连接到蛋白或肽的底物的受体肽。
29.如权利要求28所述的特定的靶结构，其中所述受体肽为源自大肠杆菌或其突变体或同族体之一的生物素连接酶的底物。
30.如权利要求28或权利要求29所述的特定的靶结构，其中所述受体肽通过肽键或可断开的键或连接体融合到靶蛋白上。
31.如权利要求4至25中任一项所述的生物素类似物，或当依赖于权利要求4至25 时，如权利要求26至30中任一项的特定的靶结构，其中所述类似物被修饰的戊酸侧链上的生物正交功能基与反应性基团反应，从而进一步将所述类似物或靶结构功能化。
32.如权利要求31所述的生物素类似物或特定的靶结构，其中所述生物素类似物具有被直接检测的方法，包括荧光试剂、冷光试剂、核磁共振造影剂、正电子发射成像试剂、磷光试剂的活化或催化取代。
33.如权利要求31所述的生物素类似物或特定的靶结构，其中所述生物素类似物被间接检测的标签标记，所述标签选自由酶、酶的底物、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、配体、亲和分子、发色体底物、蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂质组成的组。
34.标记靶结构的方法，包括通过作为生物素连接酶底物的受体肽连接根据权利要求 1至25之一的生物素类似物与靶结构的步骤。
35.如权利要求34所述的方法，进一步包含所述类似物的戊酸侧链上的生物正交功能基与反应基团的反应，以进一步将所述类似物或靶结构功能化，所述反应发生在靶蛋白与受体肽和/或生物素类似物连接之前或之后。
36.如权利要求34或35所述的方法，其发生在体外或体内。
37.如权利要求34、35或36所述的方法，其中所述靶结构为细胞表面蛋白。
38.如权利要求34至37任一项所述的方法，其中靶蛋白在细胞内表达生物素连接酶。
39.如权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述细胞为原核的或真核的细胞。
全文摘要
新的生物素类似物，例如2-叠氮生物素，包含天然生物素的脲环和任选地包含被修饰的噻吩环，一个被修饰的侧链，其具有功能性端基，优选选自由羧酸、胺、醇、硫醇、醛和卤素组成的组，以及位于侧链其它位置的至少一个生物正交性化学反应基团。所述类似物被用于标记靶结构和生物分子，例如体内或体外的肽和蛋白。
文档编号G01N33/50GK102439014SQ201080022171
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月22日 优先权日2009年3月20日
发明者威廉·C·德鲁, 尼尔·R·托马斯, 杨·永青 申请人:诺丁汉大学