专利名称：：显微镜照明方法及显微镜的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种显微镜照明方法，一种用于显微镜照明方法的发光�？椋⒐饽？榈挠猛荆约耙恢钟糜谠谕干涔饬潦映≌彰骰蛘呷肷涔庥庹彰髦蟹治鲅返南晕⒕�。
背景技术：
：在细胞诊断学和病理学中，通常在透射光亮视场照明中通过显微镜分析着色样品。由显微镜分析得到的样品颜色是用于诊断的一个重要标准。在其他的显微镜分析中，例如，通过相差(phasecontrast)或者微分干涉差(DIC,differentialinterferencecontrast)等对照方法，样品颜色的重要性大大降低。在这类对照方法中，分析无着色样品，而无着色样品在透射光亮视场显微镜检查中主要呈现为透明状。随后，这些对照方法用于使样品的相性质更为明显。荧光显微术也是一种已知的分析方法。在该方法中，待分析样品通过入射光照明光束路径被照亮，该入射光照明光束路径穿过激发滤光片。激发光导致被荧光色素着色的物体中产生荧光，被辐射的荧光确定样品最终的显微图像。在过去较长的时间内，这些显微术方法已经众所周知。关于进一步细节可以参考现有技术。最近几十年，卤素灯已经用作显微镜中的照明工具，例如，用于透射光亮视场照明。卤素灯发射的光主要对应于黑体的连续光谱。通常，热保护滤光片也内置在包含有卤素灯的发光�？橹校⑶掖蟠蠼档头⑸涞姆涞暮焱夥段АＮ詹Ａ�(2mm厚的KGl)通常被用作热保护滤光片。最终照明的连续光谱使得用户可以进行可靠的颜色评估。在以特殊光源进行照明的情况下，显色指数(CRI)对于颜色评估非常重要。这可以理解为光度值(photometricvalue),光度值可用于描述相等相关的色温度的光源的显色性的质量。高达5000K的色温度，从相应的色温度的黑体中发射的光被用作评估着色(rendering)质量的参考。高于5000K的色温度,类似日光的光谱分布被用作评估着色质量的参考。例如，为了计算家用白炽灯泡(自身是黑体的良好的近似体)的显色性，使用具有2700K温度的黑体的光谱。任何光源，其光谱接近在可见光波长范围内相等(相关)的色温度的黑体的光谱，可以获得100的显色指数。与白炽灯泡类似的卤素灯能够获得高达100的显色指数。在显微术中，卤素灯越来越多地由发光二级管(下文中称为LED)取代，LED具有已知的优点。该优点包括在较低的电能损耗下的较大光辐射以及更长的使用寿命。对于透射光照明，主要使用白光LED。在白光标准的LED中，蓝光、紫光或者紫外LED与光致发光材料结合。通常使用与黄色发光材料结合的蓝光LED。也可以使用包括多种不同的发光材料(通常为红光、绿光和蓝光)的紫外LED。根据加法混色原理，白光由这种类型的LED产生。以这种方式制造的部件具有良好的显色性，显色指数在70与90之间。然而，白光LED不能发射连续光谱。基于蓝光LED的白光LED具有在蓝色光谱范围内(在约450nm处)的强发射，在蓝绿光谱范围内(在约500nm处)的最小值，以及在至更高波长范围内的较宽发射，在约550nm处的发射最大值,该发射最大值在约650nm处显著衰减。根据LED的类型,在500nm处的强度最小值与在450nm处的强度最大值的比典型地为约10-20%。以这种类型的非连续光谱作为样品照明，颜色评估更加困难，并且与通过卤素灯的显微镜照明情况中所得到的经验值不同。以上介绍了荧光显微术中存在的特定问题。如果在如上所述的透射光亮视场显微术的情况中，也有荧光显微术的可能性，则发明人发现以下效应。用于荧光激发的激发光中的大部分沿着透射光照明轴线穿过样品且到达透射光照明源。如果在这种情况下使用白光LED，蓝色激发光导致白光LED中的黄-绿转换染料的激发，使得接下来黄-绿光沿着透射光照明轴线到达样品。这在荧光图像中被看做破坏性背景，并且能够与来自样品的实际荧光大部分重叠。即使在关闭白光LED时该效应仍然存在。
发明内容因此，本发明的目的在于在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中通过显微镜改善对样品的分析，以及降低荧光图像中的破坏性辐射。根据权利要求1，本发明涉及一种通过显微镜照明样品的方法，在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中分析该样品。本发明进一步涉及一种用于该方法的发光�？椋婕案梅⒐饽？榈挠猛荆⑶易詈笊婕耙恢趾鲜实南晕⒕�。在各个从属权利要求、下述描述以及附图中能够发现本发明的有利配置和优势。根据本发明，提出了使用白光LED作为透射光亮视场照明的光源；当启动入射光荧光照明器件时，在透射光亮视场照明器件的照明光束路径中的位置主动启动快门；且当启动透射光亮视场照明器件时，主动禁用快门。“在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置主动启动快门”的表述意欲包括将快门设置在透射光照明轴线上或者将快门引入至透射光照明轴线内，以充分发挥快门的屏蔽功能，从而完全阻挡通向光通道的照明轴。也可以想出永久设置在透射光照明轴线上并且可以被启动和禁用的机电或光电式快门。“启动”是指中断照明光束路径；“禁用”是指光通道在设置的快门的位置畅通无阻。快门是或者可以设置在样品与白光LED之间的透射光照明轴线上。已知的快门特别包括不需挡板(screen)开口即可枢轴转入和转出的挡板、能够在具有挡板开口的位置与不具有挡板开口的位置之间切换的(尤其是电子式切换的)虹膜挡板、以及最后其他形式的电光式快门，例如透射显示器(可以在最大透射率模式和最小透射率模式之间切换)。虽然在先前常规的透射光照明使用卤素灯作为光源的情况下，将快门用于光源的快速启动和禁用是很有利的，但是自从使用LED作为光源之后，由于LED可以快速开关，快门的该用途就过时了。在本发明中，虽然为了完全不同的目的，这种快门又被集成在所示发光配置的情况的照明系统中。根据本发明，在入射光荧光照明过程中，该快门在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置主动引入或启动。需指出的是，即使当透射光照明的光源(即白光LED)被关闭时，快门也可以在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置引入或启动。由于如前所述，在样品的荧光激发过程中，荧光照明的(蓝色)激发光中的大部分穿过样品，并且沿着透射光照明轴线到达白光LED(即使当白光LED关闭时，在白光LED中荧光照明的(蓝色)激发光中的大部分也激发黄-绿转换染料从而产生黄-绿光)，所以设置在样品与白光LED之间的透射光照明轴线上的快门可以完全阻止该机制，并且有效阻止在白光LED中的黄-绿转换染料的激发。根据本发明，可以完全消除由黄-绿光产生的荧光图像中的破坏性背景。启动在白光LED的直接上游位置的快门是有利的。“直接上游”意欲指在快门和白光LED之间没有设置其他物体，并且快门设置在最大限度接近白光LED的位置，以阻挡任何从白光LED中发射的或者撞击在白光LED上的光束。在快门的这种近距离设置中，快门尺寸可以减小至与白光LED的芯片的实际尺寸相当。由于快门可以迅速地被移动和操作而不需要移动大块物体，小尺寸的机械快门(以将要枢轴转入的挡板为例)是具有优势的。这也最终实现了通过不用维修和快捷的方式启动和禁用快门。快门尺寸可以选择为至少等同于白光LED的芯片尺寸的两倍。然后根据快门尺寸，将其设置在透射光照明轴线上距离白光LED合适距离的位置，以使快门完全阻挡或屏蔽透射光亮视场照明的照明光束路径。在这种设置中，还确保来自入射光荧光照明的传播激发光不会继续向前沿着透射光照明轴线至透射光亮视场照明的白光LED。通过机械主动耦合而自动启动或禁用快门是有利的。当启动入射光荧光照明器件时，入射光荧光照明器件被机械地、可操作地连接至快门，然后快门自动启动。相反地，当启动透射光亮视场照明器件时，通过相应的机械主动耦合而自动禁用快门。通常地，当关闭入射光荧光照明器件时，快门的主动禁用可以可选地发生。通过主动启动或禁用快门的马达操作快门是有利的。为了该目的，可以在马达轴上固定例如勺或浆状物。马达然后在“快门启动”和“快门禁用”的两个端点位置之间产生小的旋转运动。如下面结合根据本发明的显微镜的描述，通过控制设备的控制更具优势。本发明进一步涉及一种用于照明显微镜中的样品的发光模块，其中显微镜中的样品可以在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中进行分析。发光�？榘ò坠釲ED，作为透射光亮视场照明的光源；和快门，快门被设置使得在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置可以被启动和禁用。如同现有的，发光�？榭梢杂胂晕⒕迪嗔樱择詈显谕干涔饬潦映≌彰鞯恼彰鞴馐肪吨小９赜诜⒐饽？榈挠欣渲茫梢圆慰忌鲜鼋岷细荼痉⒚鞯姆椒ǖ南喙孛枋�。更多的配置结合下面将要描述的根据本发明的显微镜进行描述。基于本发明特定方面的所有配置也意欲应用到每个其他方面的事实进行参考。根据本发明的发光�？榭梢杂绕溆糜谏鲜龅母荼痉⒚鞯姆椒�。最后，本发明涉及一种用于在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中分析样品的显微镜，通过简单地切换该显微镜的相应的照明单元，该显微镜可以提供两个选择，或至少二者择一的选择。为了该目的，该显微镜包括透射光亮视场照明器件和入射光荧光照明器件。白光LED作为透射光亮视场照明器件的光源。在入射光荧光照明中分析样品过程中，快门还可以在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置被主动启动；在透射光亮视场照明中分析样品过程中，快门可以被主动禁用。关于这种类型的显微镜的优点和可能的配置，可以大体参考以上描述。特别有利地，提供了一种发光�？椋菽芍辽俨糠滞干涔庹彰髌骷�。这种类型的发光�？橛欣匕ò坠釲ED和快门。可选地，将用于校准透射光照明光束路径的照明光学部件也容纳在发光�？橹�。以常规的方式，发光模块可以与显微镜相连接，以I禹合在透射光照明光束路径中。如上所述，有利地，通过马达操作快门，马达有利地也容纳在发光�？橹�。根据本发明的方法在这种类型的显微镜中通过控制设备来实施特别具有优势。为了该目的，控制设备一方面与入射光荧光照明器件相连接，另一方面与透射光亮视场照明器件相连接，尤其是与发光�？橄嗔�。以这种方式，控制设备可以记录入射光荧光照明器件的启动，并且因此启动快门，特别是马达操作式快门。当入射光荧光照明器件禁用时，或者可选地，仅当透射光亮视场照明器件的白光LED启动时，控制设备可以禁用该特别的马达操作式快门。当然，上述控制机理也可以应用于非马达操作式快门，例如前面提到的光电式快门。显而易见，在不偏离本发明范围的前提下，上述特征以及下面将要描述的特征不仅能够用于分别陈述的组合，而且可以用于其他组合或独立使用。通过实施例在附图中示意性地示出了本发明，并且结合附图在下文中详细描述本发明。图I示出了根据本发明的显微镜的配置。附图标记列表I-显微镜2-入射光荧光照明器件3-透射光亮视场照明器件4-白光LED5-照明光学部件6-快门7-透射光照明轴线8-偏转镜9-载物台(microscopetable)10-样品11-物镜12-荧光滤光块13-分束器14-激发滤光片15-阻挡滤光片16-入射光照明轴线17-入射光照明光源18-光轴19-目镜20-调焦旋钮21-照相机端口(cameraport)22-照相机23-镜头筒24-支架25-发光�？�27-控制设备28-马达具体实施例图I示出了根据本发明的显微镜的配置。唯一的图I是根据本发明的具有其主要部件的显微镜I的配置示意图，显微镜I被设计用于在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中分析样品10，这两种照明方式通常是可替换的。入射光荧光照明器件2包括以下部件入射光照明光源17，例如水银荧光灯；和荧光滤光块12，设置在入射光照明轴线16上。荧光滤光块12包括激发滤光片14，和在入射光照明光的传播方向上设置于激发滤光片14后的分束器13。激发滤光片14用于选择一个或多个适合用于激发样品10中的荧光的波长范围。分束器13将通过激发滤光片14发送的激发光朝向样品10偏转。荧光滤光块12中进一步设置有阻挡滤光片15。阻挡滤光片15确保仅样品10发射的荧光到达观察者，并且因而阻挡激发光。透射光亮视场照明器件3包括以下部件作为光源的白光LED4;设置在白光LED4之后的照明光学部件5，用于校准照明光；以及最后设置在样品10下方的偏转镜8。快门6也能够设置在透射光照明轴线7上，快门6设置在白光LED4和样品10之间，特别地，快门6设置在白光LED4和偏转镜8之间，特别有利地在白光LED4的直接上游，即在这种情况下位于白光LED4和照明光学部件5之间。在示出的情况中，快门6位于透射光照明轴线7上的白光LED4的直接上游，从而可以完全屏蔽来自白光LED4的光。在如图I所示的实施例中，透射光亮视场照明器件3的一些部件也容纳在发光�？�25中。这些部件特别地包括白光LED4和快门6。在马达操作式快门的情况下，有利地马达28也容纳在发光�？�25中。在不出的情况中，照明光学部件5也容纳在发光�？�25中。发光�？�25与显微镜I通过合适形状的界面连接，用于将透射光照明光束路径耦合至显微镜I中。显微镜I的另外的已知部件包括载物台9，在载物台9上布置样本10，载物台9在z方向(与光轴18平行)通过设置在显微镜的支架24上的调焦旋钮20实现可调节，以用于调焦。进一步示出了显微镜物镜11、显微镜镜头筒23和目镜19，并且最后连接了照相机22的照相机端口21。物镜11可以是物镜旋转台的部件，物镜旋转台承载多个不同的物镜。镜头筒23内部包括偏光棱镜(为简明起见未示出)，用于将显微镜的光束路径向观察者和照相机22偏转。由入射光荧光照明器件2产生的入射光照明光束路径具有轴线16且沿着图I所示的箭头传播。该路径最初穿过激发滤光片14，以通过分束器13被偏转向样品10。在样品10中激发荧光，但是大部分激发光实际穿过样品10并沿着透射光照明轴线7传播进入透射光亮视场照明器件3。经由偏转镜8，激发光沿着透射光照明轴线7到达发光�？�25，即，特别是经由照明光学部件5到达白光LED4。特别地，对于荧光滤光块12用于蓝光激发(例如对于FITC或者GFP等荧光色素)的情况，蓝色激发光极其适合激发白光LED4中的转换染料，使该染料发射黄-绿范围的光。所发射的光(如图I中箭头所示)沿着透射光照明轴线7朝向偏转镜8传播，然后从偏转镜8继续到达样品10。黄-绿光从样品10继续经由物镜11到达荧光滤光块12，并且能够穿过阻挡滤光片15并因而到达目镜19或者照相机22。没有应对措施，作为荧光图像中的黄-绿光背景，这种效应以高度破坏性方式变得明显。由于设置了可以启动的快门6，如果在荧光照明的过程中启动快门6以完全屏蔽白光LED4，即保护它不受蓝色激发光的辐射，使得可以消除荧光图像中的黄-绿光背景。为了该目的，在荧光照明的情况中，在透射光照明轴线7上设置快门6。理想地，提供用于控制的控制设备27，控制设备27与入射光荧光照明器件2可操作性地连接，且通常与透射光亮视场照明器件3连接，尤其与发光�？�25连接。结果，可以检测入射光荧光照明器件2的光源17的启动。然后，控制设备27启动马达28，马达28操作快门6。马达28被提供具有用于在透射光照明轴线7上定位快门6的信号。通过这种方式，避免白光LED4受到穿过样品10的蓝色激发光的辐射。另一方面，即使当白光LED4启动时，透射光束路径沿着快门6下游的透射光照明轴线7的传播显然不再可能。控制设备27进一步地与发光�？�25连接，尤其是与白光LED4连接，或者专门为白光LED4提供的控制系统连接。结果，可以检测白光LED4的启动。例如，当白光LED4启动时，通过至马达28的相应的信号将快门6从透射光照明轴线7移开，从而使透射光照明光束路径畅通无阻。在另外的选择中，仅当白光LED4开启和光源17关闭时进行上述操作。如果快门6从透射光照明轴线7移开，透射光照明光束路径可以经由照明光学部件5和偏转镜8传播至样品10。当快门6设置在白光LED4的直接上游时，如图I所示，可以限制快门的尺寸，即例如将勺状挡板的尺寸限制为白光LED4上的发光芯片的尺寸或白光LED4上的发光芯片的尺寸的2倍，特别地，至少为白光LED4上的发光芯片的I.I至I.5倍。这因而允许非常小的有效快门面，使其易于被马达28操作。可选地，替代快门6和马达28的设置，能够提供电光式透射显示器，电光式透射显示器例如直接由控制设备27启动。在该显示器上，在“快门禁用”功能中，打开用于透射光照明光束路径的无阻碍通道的相应开口，而该区域在“快门启动”功能中被变为不透明。权利要求1.一种用于照明显微镜(I)中样品(10)的方法，通过透射光亮视场照明器件或者入射光荧光照明器件照明所述样品(10)，其中，使用白光LED(4)作为所述透射光亮视场照明的光源，其中，当启动所述入射光荧光照明器件时，在所述透射光亮视场照明器件的照明光束路径中的位置主动启动快门(6)，其中，当启动所述透射光亮视场照明器件时，主动禁用所述快门(6)。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，在所述白光LED(4)的直接上游位置启动所述快门(6)。3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，通过机械主动耦合自动启动或禁用所述快门(6)。4.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，通过自动启动和禁用所述快门(6)的马达(28)来操作所述快门(6)。5.一种用于照明显微镜(I)中样品(10)的发光�？�(25)，通过透射光亮视场照明器件或者入射光荧光照明器件分析所述样品(10)，所述发光模块(25)包括白光LED(4)，作为所述透射光亮视场照明器件的光源；和快门出)，其中，所述快门(6)被设置使得在所述透射光亮视场照明器件的照明光束路径中的位置被主动启动和禁用。6.如权利要求5所述的发光�？椋涮卣髟谟冢隹烀�(6)设置在所述白光LED(4)的直接上游。7.如权利要求6所述的发光�？椋涮卣髟谟冢峁┯糜诓僮魉隹烀�(6)的马达(28)以主动启动和禁用所述快门(6)。8.如权利要求5至7中任一项所述的发光�？橛糜谡彰飨晕⒕�(I)中样品(10)的用途，通过透射光亮视场照明器件或者入射光荧光照明器件照明所述样品(10)，其中，使用所述白光LED(4)作为所述透射光亮视场照明的光源，其中，当启动所述入射光荧光照明器件时，在所述透射光亮视场照明器件的照明光束路径中的位置主动启动所述快门￠)，且当启动所述透射光亮视场照明器件时，主动禁用所述快门(6)。9.一种用于在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中分析样品(10)的显微镜(1)，包括透射光亮视场照明器件(3)，和入射光荧光照明器件(2)，其中，提供白光LED(4)作为所述透射光亮视场照明器件的光源，其中，快门(6)设置在所述透射光亮视场照明器件(3)的照明光束路径中的位置，从而当启动所述入射光荧光照明器件时，主动启动所述快门￠)，且当启动所述透射光亮视场照明器件时，主动禁用所述快门(6)。10.如权利要求9所述的显微镜(1)，其特征在于，所述白光LED(4)和所述快门(6)设置在发光�？�(25)中，将所述发光模块(25)与显微镜(I)连接以将所述透射光亮视场照明器件(3)的照明光束路径耦合至所述显微镜(I)中。11.如权利要求10所述的显微镜(I)，其特征在于，控制设备(27)与所述透射光亮视场照明器件(3)的发光�？�(25)以及所述入射光荧光照明器件(2)可操作性地连接，以使当操作所述入射光荧光照明器件(2)时，主动启动所述快门￠)，且当操作所述透射光亮视场照明器件(3)时，主动禁用所述快门(6)。12.如权利要求11所述的显微镜(I)，其特征在于，所述控制设备(27)与容纳在所述发光�？�(25)内的马达(28)可操作性地连接，以主动启动和禁用所述马达操作式快门(6)。全文摘要本发明涉及一种显微镜照明方法及显微镜。根据本发明的用于照明显微镜(1)中样品(10)的方法，在透射光亮视场照明或者入射光荧光照明中分析样品(10)，其中，使用白光LED(4)作为透射光亮视场照明的光源；在入射光荧光照明过程中，在透射光亮视场照明的照明光束路径中的位置启动快门(6)；在透射光亮视场照明过程中，禁用快门(6)。文档编号G01N21/64GK102902053SQ20121026409公开日2013年1月30日申请日期2012年7月27日优先权日2011年7月27日发明者阿尔布雷克特·韦斯申请人:莱卡微系统Cms有限责任公司
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