专利名称：一种苦皮藤素原药及其制备方法和质量检测方法
技术领域：
本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种苦皮藤素原药及其水悬浮剂，以及它的制备方法和质量检测方法。
背景技术：
苦皮藤(Celastrus angulatus MaXim)亦叫苦树皮、菜药,属卫矛科南蛇藤属植物。在我国长江、黄河流域各省区分布很广。其根皮和叶子一直被民间作为杀虫药使用，也可以入药用来治疗疗疮肿疼，具有清热解毒功能，其中根皮的杀虫作用最好[中国科学院西北植物研究所.秦岭植物志1981，北京科学出版社]。苦皮藤的杀虫有效成分为分离得到的一系列4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物，对害虫具有毒杀、拒食和麻醉作用，可用来防治蔬菜上的菜青虫、稻苞虫、水稻的粘虫、芫菁叶蜂幼虫、贮粮害虫玉米象等[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[Μ].化学工业出版社，2010]。目前文献报道的苦皮藤的提取方法均为溶剂回流法，提取溶剂包括石油醚、苯、丙酮、乙醚、甲苯、甲醇、乙醇等；其中工业化生产大多采用苯[朱文丽，等.苦皮藤根皮的化学成分.中国实验方剂学杂志，2011，17 (13) ,271-276.]。虽然乙醇为环保溶剂，但与其他溶剂提取物或原药相比，苦皮藤乙醇提取物(或用乙醇提取获得的原药)化学成分极其复杂、多样，含有大量黄酮、卫矛醇、三萜等其他成分，4-0Η- β - 二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物含量很低(如苦皮素A含量O. 5%左右)，溶解性较差，难于制成相应剂型。因此，苦皮藤基本不采用乙醇提取。苦皮藤醇提取物的品质不在于某个单一活性成分，其效果是多个活性成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称苦皮藤素。苦皮藤素化学成分非常复杂，含有以苦皮素Α、苦皮素B为主的多种杀虫成分。目前，苦皮藤素提取物或原药中苦皮藤素组分的检测方法一是测定苦皮藤素提取物或原药水解后产生的苯甲酸，操作步骤极其复杂，结果不可靠，可行性差；二是仅对其中一个组分苦皮素A(或苦皮藤素V)进行定量分析[吴文君，等·植物杀虫剂O. 2%苦皮藤素乳油的研究与开发· Pesticides (农药)，2001，40 (3) : 17 ； 卢桂荣，等.RP-HPLC法测定苦皮藤素中苦皮素A的含量.河南科学，2007，25 (3):395.]，这种针对单一成分进行定量分析的质量检测模式不能有效控制苦皮藤素提取物的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制苦皮藤产品质量的迫切要求。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安，等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志，2002，11 (I) :46.]。目前关于苦皮藤素提取物或原药的产品及其指纹图谱检测未见报道。I⑶核磁共振碳谱偶联(I⑶13C NMR coupling)指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000，31 (11):868-870.]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技术)提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。因此，若能开发出新的苦皮藤素原药产品，并开发出利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术对相关苦皮藤素原药产品进行检测的方法，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。
发明内容
为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明的目的在于，提供一种醇提苦皮藤素原药及其水悬浮剂。本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水悬浮剂的制备方法。本发明的另一目的在于，提供一种所述苦皮藤素原药及其水悬浮剂的质量检测方法。为实现上述目的，本发明提供的一种苦皮藤素原药，其中含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A2. 5^4. 0%,苦皮素B3. (Γ5. 0%,苦皮素C、苦皮素F和苦皮素Pl. 5 3. 0%，苦皮素Gl. 5 3. 0%，苦皮藤素IV0. 05 I. 00%,苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素XIX3. 5 5. 5%,苦皮素 Hl. 0 2· 0%。本发明苦皮藤素原药中的所述活性成分均为4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。其中，苦皮素C的质量百分含量为O. 5 2.0%，苦皮素F的质量百分含量为O. 5^1. 0%，苦皮素P的质量百分含量为O. 05、. 75%，苦皮素E的质量百分含量为O. Γ . 0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为O. 2^0. 7%，苦皮藤素III的质量百分含量为O. 5^1. 0%，苦皮素J的质量百分含量为O. 3^2. 5%。本发明所述苦皮藤原药中各活性成分(4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)总的质量百分含量不小于13%。优选15%。进一步地，苦皮藤原药中各活性成分总的质量百分含量为15. 25^17. 05%。本发明所述苦皮藤素原药为固体状。本发明提供的苦皮藤素原药的制备方法包括称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为2飞倍的乙醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取f 2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩成滤液，取此滤液，加体积为广2倍的沉淀剂，沉淀12 24小时，离心后得到沉淀，即所述苦皮藤素原药。进一步地，苦皮藤根或/和皮粉碎后过1(Γ24目筛其中，所述乙醇的质量比为90 95%。进一步地，浓缩的滤液的密度为I. (Tl. 2，优选I. 08^1. 13。其中，所述沉淀剂为水或为5 30%乙醇，优选1(Γ30%乙醇。这里的百分数“％”为
质量比。苦皮藤根或/和皮中的活性成分，除了本发明苦皮藤素原药所述的成分外，还包括苦皮素U、X、苦皮藤素II、苦皮藤素VII ；celangulatinC等4_0Η_β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物和黄酮、生物碱、三萜等活性成分。本发明提供的苦皮藤素原药，可以制成水悬浮剂、可湿性粉剂、水乳剂等各种剂型用于植物源农药杀虫剂。本发明提供的一种苦皮藤素水悬浮剂，包含所述苦皮藤素原药。本发明提供的所述苦皮藤素水悬浮剂，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药1(Γ20份，润湿分散剂3 7份，增稠剂2 3份，防冻剂3飞份，消泡剂O. 2^0. 5份。本发明提供的所述苦皮藤素水悬浮剂，优选地，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药16 17份，润湿分散剂5. 5飞份，增稠剂2. 5^3. O份，防冻剂4飞份，消泡剂O. 3^0. 5份。其中，所述润湿分散剂选自亚甲基二萘磺酸钠(ΝΝ0)，烷基萘磺酸缩聚物的钠盐(MorwetD425)，木质素磺酸钠(木钠)，亚甲基双甲基萘磺酸钠(MF)，聚羧酸盐类(GYD)，烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯(农乳2000#)，十二烷基苯磺酸钙(农乳500#)，苯乙基苯酚聚氧乙烯醚(农乳601#)，烷基芳基聚氧丙烯聚氧乙烯醚(农乳33#)，苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚(农乳1601#)和蓖麻油聚氧乙烯醚(BY125)等中的一种或多种。优选亚甲基二萘磺酸钠，烷基萘磺酸缩聚物的钠盐和烷基芳基聚氧丙烯聚氧乙烯醚中的一种或多种。其中，所述增稠剂选自阿拉伯胶，黄原胶，羟甲基纤维素，聚乙烯醇，聚乙烯醇吡咯烷酮、硅酸镁铝和膨润土中的一种或多种。优选膨润土，黄原胶和羟甲基纤维素中的一种或多种。其中，所述防冻剂选自乙二醇，丙二醇，丙三醇，二甘醇，三甘醇，聚乙二醇，尿素和无机盐类中的一种或多种。优选乙二醇。其中，所述消泡剂为有机硅酮类，C8^C10脂肪醇类，CltTC2tl脂肪族羧酸及其脂类，酯-醚型化合物或椰子油EO-PO聚合物等。优选有机硅。本发明提供的一种苦皮藤素水悬浮剂，还包括溶剂。其中，溶剂为水，加水至100%。本发明所述的苦皮藤素水悬浮剂，其中的辅料，即润湿分散剂、增稠剂、防冻剂、消泡剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。本发明所述苦皮藤素水悬浮剂中各活性成分(4-ΟΗ-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)的总的质量百分含量不小于2%。进一步地，苦皮藤水悬浮剂中各活性成分总的质量百分含量为2. 3^3. 0%。更进一步地，品种为陕西宝鸡的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为
2.5^2. 9%，品种为陕西华县的苦皮藤原药中活性成分总的质量百分含量为2. 6^3. 0%。本发明提供的所述苦皮藤素水悬浮剂的制备方法，包括将所述苦皮藤素原药与润湿分散剂、增稠剂、防冻剂、消泡剂以及溶剂按所述比例混合，即得。本发明提供的所述苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤I)对所述苦皮藤素原药进行处理，得到含有活性成分组的苦皮藤素原药特征提取物；2)对所述苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量；4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。其中，步骤I)中，苦皮藤素原药特征提取物的处理方法，包括称取所述苦皮藤素原药，加入体积为6 12倍量的氯仿，6(T80°C下回流或超声提取2(T40min，过滤后于6(T70°C下减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素原药特征提取物。苦皮藤素原药特征提取物检测方法如下取苦皮藤素原药特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。其中，步骤2)中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为C_15，其化学位移为5c60. 0^66. O0进一步地，选择C-9和/或C-I作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮素P，其(C-9或C-I)化学位移为70. 6 72. 6。其中，步骤2)中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量。其中，所述定量分析手段为高效液相色谱(HPLC)法。进一步地，HPLC法的条件为色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为甲醇乙腈:水=(35 45) : (15 25) : (35 45)的混合溶剂，流速为lmL/min，检测波长为242nm。甲醇乙腈水优选40:20:40。其中，所述标准参照品为苦皮素B。本发明主要测定的是苦皮藤素原药中4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的含量。其中，苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为W1为步骤3)用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量(质量百分含量);M1为所述某一活性成分对应的标准参照品的分子量；Ii1为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中所述某一活性成分对应的标准参照品的特征峰峰强度；Wn为苦皮藤素原药中某一活性成分的质量百分含量；Mn为某一活性成分的分子量；hn为由IGD核磁共振碳谱指纹图谱测定的苦皮藤素原药特征提取物中某一活性成分的特征峰峰强度。通过偶联公式还可计算苦皮藤素原药中主要活性成分的系数和总系数。进一步地，所述系数的计算公式为
权利要求
1.一种苦皮藤素原药,含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A2. 5^4. 0%,苦皮素B3. 0 5· 0%，苦皮素C、苦皮素F和苦皮素Pl. 5 3. 0%，苦皮素Gl. 5 3. 0%，苦皮藤素IV0. 05 I. 00%,苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素XIX3. 5 5. 5%，苦皮素Hl. 0 2· 0% ;所述活性成分均为4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2.根据权利要求I的苦皮藤素原药，其特征在于，其中苦皮素C的质量百分含量为O. 5^2. 0%，苦皮素F的质量百分含量为O. 5^1. 0%，苦皮素P的质量百分含量为O. 05、. 75%，苦皮素E的质量百分含量为O. ri. 0%，苦皮藤素XIX的质量百分含量为O. 2^0. 7%，苦皮藤素III的质量百分含量为O. 5^1. 0%，苦皮素J的质量百分含量为O. 3^2. 5%。
3.根据权利要求I或2所述的苦皮藤素原药，其特征在于，4-ΟΗ-β- 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量不小于13% ;优选为15. 25^17. 05%。
4.权利要求Γ3任意一项所述苦皮藤素原药的制备方法，包括称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用体积为2飞倍的乙醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取f 2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩成滤液，取此滤液，加体积为广2倍的沉淀剂，沉淀12 24小时，离心后得到沉淀，即得苦皮藤素原药；所述沉淀剂为水或为5 30%乙醇。
5.—种苦皮藤素水悬浮剂,包含权利要求1 3任意一项所述的苦皮藤素原药。
6.根据权利要求5所述的苦皮藤素水悬浮剂，其特征在于，包括以下重量份的成分所述苦皮藤素原药1(Γ20份，润湿分散剂3 7份，增稠剂2 3份，防冻剂3飞份，消泡剂O. 2^0. 5份；优选地，所述苦皮藤素原药16 17份，润湿分散剂5. 5飞份，增稠剂2. 5^3. O份，防冻剂4飞份，消泡剂O. 3 O. 5份。
7.根据权利要求6所述的苦皮藤素水悬浮剂，其特征在于，所述润湿分散剂选自亚甲基二萘磺酸钠，烷基萘磺酸缩聚物的钠盐，木质素磺酸钠，亚甲基双甲基萘磺酸钠，聚羧酸盐类，烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯，十二烷基苯磺酸钙，苯乙基苯酚聚氧乙烯醚，烷基芳基聚氧丙烯聚氧乙烯醚，苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚和蓖麻油聚氧乙烯醚中的一种或多种；所述增稠剂选自阿拉伯胶，黄原胶，羟甲基纤维素，聚乙烯醇，聚乙烯醇吡咯烷酮、硅酸镁铝和膨润土中的一种或多种；所述防冻剂选自乙二醇，丙二醇，丙三醇，二甘醇，三甘醇，聚乙二醇，尿素和无机盐类中的一种或多种；所述消泡剂为有机硅酮类，C8^C10脂肪醇类，CltTc2tl脂肪族羧酸及其脂类，酯-醚型化合物或椰子油EO-PO聚合物。
8.根据权利要求5 7任意一项所述的苦皮藤素水悬浮剂，其特征在于，该苦皮藤素水悬浮剂中4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量不小于2% ；优选为2. 3 3. 0%。
9.一种权利要求f 3任意一项所述苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤1)对所述苦皮藤素原药进行提�。玫胶谢钚猿煞肿榈目嗥ぬ偎卦┨卣魈崛∥铮�2)对苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量；4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤素原药中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述苦皮藤素原药特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤素原药，加入体积为6 12倍量的氯仿，6(T80°C下回流或超声提取2(T40min，过滤后于6(T70°C下减压浓缩，回收溶剂至干，即得苦皮藤素原药特征提取物。
11.根据权利要求9或10所述的质量检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为C-15，其化学位移为Sc 60.0飞6.0，选择09和/或C-I作为特征峰进一步区别苦皮素C、苦皮素F和苦皮素P，其化学位移为70. 6 72. 6。
12.根据权利要求I任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量；所述定量分析手段为高效液相色谱法。
13.根据权利要求扩12任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述标准参照品为苦皮素B。
14.根据权利要求扩13任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
15.根据权利要求14所述的质量检测方法，其特征在于，计算苦皮藤素原药中各活性成分的系数和总系数的公式为
16.一种权利要求51任意一项所述苦皮藤素水悬浮剂的质量检测方法，利用权利要求扩15任意一项所述方法检测得到苦皮藤素原药中某各活性成分的含量，再利用以下公式推算出苦皮藤素水悬浮剂中各活性成分的质量百分含量=Xn=X1Fn;其中Xn为苦皮藤素水悬浮剂中某一活性成分质量百分含量；X1为用定量分析手段测定得到的苦皮藤素水悬浮剂中某一活性成分对应的标准参照品的绝对含量；Fn为权利要求15所述的苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准参照品质量百分含量的比值系数；苦皮藤素水悬浮剂中活性成分组的含量为各活性成分Xn相加之和；该苦皮藤素水悬浮剂由苦皮藤素原药制备得到。
全文摘要
本发明涉及一种苦皮藤素原药及其水悬浮剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分苦皮素A 2.5~4.0%，苦皮素B 3.0~5.0%，苦皮素C、苦皮素F和苦皮素P 1.5~3.0%，苦皮素G 1.5~3.0%，苦皮藤素IV0.05~1.00%，苦皮素A、苦皮素E和苦皮藤素XIX 3.5~5.5%，苦皮素H 1.0~2.0%。该苦皮藤素原药采用沉淀剂沉淀的方法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。本发明的苦皮藤素原药含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。
文档编号G01N24/08GK102907426SQ20121037628
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张海燕, 赵天增, 董建军, 刘雨晴, 郭唯, 于立芹, 范毅, 常霞, 王伟, 王涛, 魏悦 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司, 河南省生物技术开发中心
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