专利名称：一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法
技术领域：
本发明涉及动物疫病检测方法技术领域，具体的讲是一种基于流式微球技术分型 检测禽流感病毒方法。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza, Al)，俗称鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类感 染性疾病综合症。1878年，在意大利鸡群中首次发现该病毒。自从1997年在香港发现人类 也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。现在该病几乎遍布世界各 地，对世界养禽业的发展，甚至对人类的健康都造成了严重威胁。禽流感特别是H5和H7亚 型高致病性禽流感(HPAI)已经被国际兽医局(OIE)定为A类烈性传染�。诶飞显斐� 过巨大的灾难。和其他禽流感病毒检测的方法相比较，本发明的优势还在于进行检测的同 时可以对禽流感病毒进行分型。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法。它的技术 方案为一、设计并合成禽流感病毒的通用型和亚型特异性探针，并进行氨基化修饰；二、将氨基化修饰探针通过化学交联方法偶联至不同的微球；三、合成禽流感病毒通用型和不同亚型的特异性引物，并进行生物素化修饰；四、提取待测样本RNA，在包含所述引物的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到 样本cDNA ；五、将cDNA高温或加入变性液使之变性；六、将变性cDNA与杂交液加入包含氨基化修饰的微球溶液中，进行杂交反应；七、再将量子点标记的链酶亲和素交联液加入反应，后通过流式微球技术检测，判 断待测样本是否含有禽流感病毒以及确定病毒的分型。该发明的优点是(1)通量高目前有100种微球可供研究使用。(2)检测所需样 本量少，本技术只需ι μ L的PCR产物进行检测。(3)快速本技术对单个微球进行检测，不 存在本底影响，基本上不需洗涤，因此所需时间短。(4)可靠性高本技术是对多个荧光信 号进行单独检测后，用配套软件进行统计分析。是结果更加精确、可靠。(5)重复性好不 同种类的微球进行标记后混合，分成小份用于检测个标本，各小份性质完全一致。
具体实施例方式本发明的检测步骤如下1.微球-氨基化探针偶联取1. 25Χ IO6个微球为一批次，在1. 5mL离心管中，将微球置换到MES缓冲液(MES， 0. 1Μ，ρΗ4. 5)中，加入优化量的氨基化探针，加入一定量的EDC溶液，避光振摇常温反应0. 5小时，再加入等量的EDC溶液，避光振摇常温反应0. 5小时，用Tween 20和SDS溶液洗涤微 球。最后，用PH8. 0的TE溶液储存微球-氨基化探针偶联物。2. RT-PCR 扩增提取待测样本RNA，在包含禽流感病毒通用型和不同亚型的生物素化特异性引物 的RT-PCR反应液中进行RT-PCR扩增得到样本cDNA ；3. cDNA 变性将cDNA高温或加入变性液使之变性；4.微球-氨基化探针-变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合物的形成在96孔滤膜板中，同时加入微球-氨基化探针偶联物、变性cDNA，与杂交液室温避 光振摇反应2-3小时，进行杂交反应，抽滤掉板上孔中反应液，其中多余的变性cDNA随反应 液被抽滤掉，与微球_氨基化探针偶联物结合的变性cDNA留在孔中；然后加入量子点标记 链酶亲和素，室温避光振摇反应0. 5-1小时，量子点标记链酶亲和素与孔中变性cDNA特异 性结合，形成微球_氨基化探针_变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合体。5.荧光检测将96孔滤膜板上孔内溶液转移至管中上流式细胞仪进行检测，该检测方法的测 定原理是通过检测结合到微球上的氨基化探针_变性cDNA-量子点标记链酶亲和素复合体 的荧光强度实现对待侧物的检测。检测标本的同时，将空白PCR产物作为正常对照。计算 正常对照平均荧光强度的均值，将标本平均荧光强度与之比较并计算比率。以上实施方式仅用于帮助本领域技术人员更加全面的理解本发明，但并不对本发 明做任何限制。凡依照本发明的内容所做出的任何本领域等同的替换均属于本发明保护的 范围之内。
权利要求
一种基于流式荧光编码微球技术的用于禽流感病毒多亚型同步检测的RT-PCR一流式微球检测方法，其特征在于以具有功能化基团的聚苯乙烯荧光编码微球作为固相载体，将禽流感病毒亚型特异性探针以形成共价键方式包被到固相载体上，形成微球-包被探针偶联物，与不同亚型禽流感病毒生物素标记引物扩增获得的RT-PCR产物发生特异性反应，再与量子点标记的链酶亲和素反应，使用流式分析系统对反应产物中逐一通过检测区的微球所负载的多种荧光信号进行检测，通过与阴性样本对比，判断样本是否为阳性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于微球-包被探针偶联物的形成过程， 在96孔滤膜板内的微球_包被探针偶联物的体系中加入带有生物素的待测病毒的RT-PCR 产物，进行杂交反应，RT-PCR产物再与量子点标记链酶亲和素特异性结合而形成基于微球 的荧光杂交复合体。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于基于微球的荧光杂交复合体的形成 是以量子点作为荧光标记物，用量子点标记链酶亲和素，加入的微球-包被探针偶联物、带 有生物素的待测病毒RT-PCR产物反应完后，加入量子点标记链酶亲和素反应形成微球-包 被探针偶联物_病毒RT-PCR产物-量子点标记链酶亲和素的荧光杂交复合体。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于根据内部包埋荧光染料比例的不同 对微球进行编码，不同的荧光编码微球连接不同亚型禽流感病毒的探针，加入病毒RT-PCR 产物，可同步检测同一样品中多型禽流感病毒，或者同步检测多个样品中不同型禽流感病
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所说的用流式系统对逐一流过检 测区的微球所负载的荧光信号进行检测，是指检测系统的两束激光光源发射波长分别为 488nm和635nm，一束通过判定微球内包埋的染料比例从而对待测物进行种类定性分析，另 一束通过测定微球上反应连接的荧光探针强度从而判断待测物含量多少。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于定性检测使用阴性、阳性对照样本为 参照，根据待测病毒的平均荧光强度比率来定性，平均荧光强度比率大于或等于阴性检测 值的2. 1倍时为阳性，小于时为阴性。
全文摘要
本发明提供一种基于流式微球技术分型检测禽流感病毒方法，它包括以下步骤一、根据公布的禽流感病毒核酸序列设计禽流感病毒的亚型特异性探针和引物；二、设计和合成用于RT-PCR扩增不同亚型禽流感病毒特异性片段的探针与引物，用化学交联法将探针交联于相应荧光微球，以禽流感病毒提取核酸为模板，RT-PCR扩增后与荧光微球进行杂交，检测荧光信号进行分型；三、通过实验条件的优化，建立了特异性强、敏感性高、实用可靠的禽流感病毒检测及分型检测用的流式微球技术。
文档编号G01N21/64GK101880733SQ201010245670
公开日2010年11月10日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者张帆, 李锦丰, 薛强, 邹明强 申请人:中国检验检疫科学研究院
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