专利名称：一种人工湿地填料生物膜活性的测定方法
技术领域：
本发明涉及人工湿地领域，具体说，涉及到人工湿地填料生物膜活性的测定。
背景技术：
人工湿地系统中有机物的吸附、降解和转化主要是由生物膜完成的，生物膜的生 物活性直接影响人工湿地系统的处理效率。因此如何判断生物膜活性的高低，以便及时调节人工湿地系统的操作条件，使之达到最佳的运行状态，是十分重要的。在现阶段用于生物膜活性的测定方法主要有各种生物酶活性测定法和耗氧速率法，但是这些方法应用于人工湿地填料生物膜的活性测定时，有很多弊端(I)生物酶活性测定法这种方法的原理是让微生物的酶与底物在一定温度下作用一段时间，通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止(也叫中止反应法)。加入试剂进行化学反应显色测出底物和产物的变化。由于酶活性受温度、溶解氧浓度、电子受体浓度、酸碱度的影响很大，在人工湿地系统操作环境波动较大的情况下，测出的结果很不稳定，很多情况下缺乏前后可比性。另外，由于人工湿地填料及其表面微生物膜在测定时容易脱落，混淆色度，易造成测定结果的不可靠性。(2)生物膜耗氧速率测定法该方法的原理是认为在微生物的代谢过程中，氧作为好氧微生物的电子受体而被利用，因而耗氧速率直接反映了微生物的代谢速率。但是在生物膜工艺中，由生物膜的最里层到最外层，依次为厌氧区、缺氧区、有氧区，相对应分布着厌氧微生物、兼性微生物、好氧微生物，并且湿地环境中厌氧微生物和兼性微生物的数量远远大于好氧微生物；因此只测定氧的消耗速率，而忽视厌氧微生物和兼性微生物所需电子受体(通常为硝酸根、硫酸根、铁离子)的浓度变化，不能全面准确地反映生物膜的代谢能力，也即不能反映生物膜的真实活性。因此，对于人工湿地环境下应用的填料生物膜活性，需要考虑其菌群特点，提出新的快捷方便的测定方法。
发明内容
本发明克服了现有技术存在的不足，提供了一种有效、准确、快捷的人工湿地填料生物膜活性测定方法，其测定原理是根据生物膜中微生物(好氧菌、兼性菌、厌氧菌混合)在新陈代谢中对电子受体消耗，反映生物膜的活性，在单位时间内不同类别的电子受体消耗越多，说明生物膜中的微生物活性越高。而且，本发明的方法不仅限于人工湿地的生物膜活性测定，其他任何非纯好氧条件下的生物膜活性的测定，都可以推广应用。本发明提供了一种生物膜活性测定方法，所述方法包括步骤I)将挂有生物膜的人工湿地填料与硝酸根、硫酸根、三价铁离子、饱和充氧水混合；2)测量上述混合物的初始溶解氧含量，并在经过一段时间后测量所述混合物的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度和终三价铁离子浓度，并测量亚硝酸根浓度；
3)将生物膜填料取出、干燥并称质量；4)利用上述生物膜填料的质量、初始溶解氧含量、初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度，以及上述测量的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度、终三价铁离子浓度和亚硝酸根浓度计算单位时间内生物膜代谢消耗氧分子、硝酸根、硫酸根和铁离子过程所转移的电子摩尔数，并由这三个值计算所述生物膜的代谢活性。好氧菌在呼吸中消耗的电子受体是氧分子，厌氧菌在呼吸代谢中消耗的常见电子受体是硝酸根(N03_)、硫酸根(S042_)、三价铁离子[Fe3+]，兼性菌具有两套呼吸系统，既能消耗氧分子，又可以利用其他3种厌氧菌常用的电子受体，所以采用同时监测单位时间内溶解氧(DO)含量、硝酸根(NO3-)、硫酸根(SO/—)、三价铁离子[Fe3+]浓度变化来反映生物膜的活性，具有较好的准确性。另外还需指出，有些厌氧或兼性菌可以利用C02、H2气体作为呼吸过程中的电子受体(也即呼吸作用会使其在样品中含量降低)，但是这两种气体同时又是微生物的代谢产物(也即对有机物的分解会使其在样品中含量升高)，因此其浓度变化不是单纯来自微生物的呼吸代谢，故不建议采用这两种气体浓度的变化来反映生物膜的活性。本发明弥补了传统方法测定人工湿地填料生物膜活性的弊端，具有以下优点(I)本方法使用的仪器、实验器材、测定方法均属于常规方法，不需特殊培训，相对比较简单，操作简单方便；(2)与酶活性的方法相比，本方法测定结果稳定；(3)由于充分考虑到湿地环境中氧的分布特点，全面考虑了不同代谢途径微生物的呼吸过程，本方法测定结果比其他传统方法更加准确、可靠，结果更有说服力；(4)本方法的应用范围广，不仅限于人工湿 地的生物膜活性测定，其他任何非纯好氧条件下的生物膜活性的测定，都可以推广应用。
下面将结合附图对本发明具体实施方案结果进行详细描述图I是人工湿地沸石填料挂膜期间生物膜活性的测定。其中显示随着挂膜时间的延长，生物膜的活性越来越高，单位时间内的电子受体代谢速率由O. 38mmole/g. h，上升到第8天的2. 99mmol e/g. h,有上升到14天的5. 35mmol e/g. h。这与常规挂膜试验中对生物膜活性变化的判断是一致的，即在挂膜后的20天内，生物膜的厚度会逐渐增加，生物膜的活性也逐步增强。但是本实施实例中具有明显的上升规律，受其他因素干扰小，因此趋势非常明显。图2是沸石、陶粒挂膜22天时生物膜活性的测定结果。其中显示在2种人工湿地填料挂膜22天时的生物膜活性，陶粒的明显要高于沸石的，前者为9. 6mmole/g. h，沸石的为 6. 4mmo1 e/g. h。图3是沸石、陶粒挂膜22天时不同电子受体对生物膜代谢活性的贡献率。其中显示陶粒、沸石填料生物膜在呼吸代谢过程中，不同电子受体的贡献率大小均为硫酸根>硝酸根>氧气>铁离子，且硫酸根的贡献率占绝对优势。说明人工湿地的生物膜是以厌氧呼吸为主的，因此只测定溶解氧变化不能准确反映整体的生物膜活性的变化趋势。
具体实施例方式参考以下具体实施方案和其中包括的实施例的详细说明以及附图和它们的前文和下文的描述可以更容易地理解所公开的方法在对本发明的方法公开和描述之前，除非另有说明，应理解它们并不限于具体的方法，或者除非另有说明，它们并不限于具体的试剂，因为所述具体的方法、技术或试剂当然是可变的。还应理解，本文使用的技术仅仅是用于描述具体的实施方案，并不意欲进行限制。本发明中为了清楚表示或者用于方便在公式中表示而使用或定义的编号和符号仅仅是为了说明的目的，不是意欲进行限制。下文所述的实施方案，在互不冲突的情况下，可以互相组合形成一个新的技术方案，该新技术方案在本发明的范围内。例如，公开具体实施方案A和B，那么包含实施方案A和B所有技术特征的技术方案C也应认为被公开。本发明提供了一种生物膜活性测定方法，所述方法包括步骤I)将挂有生物膜的人工湿地填料与硝酸根、硫酸根、三价铁离子、饱和充氧水混合；2)测量上述混合物的初始溶解氧含量，并在经过一段时间后测量所述混合物的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度和终三价铁离子浓度，并测量亚硝酸根浓度；3)将生物膜填料取出、干燥并称质量；4)利用上述生物膜填料的质量、初始溶解氧含量、初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度，以及上述测量的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度、终三价铁离子浓度和亚硝酸根浓度计算单位时间内生物膜代谢消耗氧分子、硝酸根、硫酸根和铁离子过程所转移的电子摩尔数，并由这三个值计算所述生物膜的代谢活性。在一个实施方案中，在本发明的方法的步骤I)后，还包括测量所述混合物的硝酸根、硫酸根和三价铁离子的浓度作为所述混合物的初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度。这样做可以减少仪器误差对计算结果的影响，使结果更加准确。在本发明的一个具体实施方案中，所述硝酸根可以是可溶性硝酸盐，例如选自NaN03> KNO3等，考虑到经济性一般会选用NaNO3 ;硫酸根可以是可溶性硫酸盐，例如选自Na2SO4, K2SO4和MgSO4，虑到经济性一般会选用Na2SO4 ;三价铁离子可以是可溶性三价铁盐，例如选自FeCl3和Fe2 (SO4) 3，但是考虑到经济性及计算方便一般选用FeCl3。在一个具体实施方案中，硝酸根、硫酸根和三价铁离子的初始浓度范围在浓度O. 2-lmol/L。考虑到微生物的呼吸速率以及对盐度的耐受度，一般不会选用大于lmol/L的浓度，但浓度低于O. 2mol/L有电子受体供应不足的弊端，而影响微生物的正常新陈代谢。在本发明方法的步骤I)中，在一个具体实施方案中，所述已经挂有生物膜的人工湿地填料与所述混合物的质量体积比是10-50 250。这种比例是考虑到生物膜呼吸代谢过程中的耗氧速率，确保在测定时间段内不会出现水中溶解氧供应不足的现象。在本发明方法的步骤I)中，在一个具体实施方案中，所述混合物被预曝气充氧饱和。预曝气是为了保证水中有充足的溶解氧，以供测试生物膜在测定时间段内的好氧呼吸消耗。在一个具体实施方案中，将挂有生物膜的人工湿地填料、硝酸根、硫酸根、三价铁离子混合后加入预曝气充氧饱和的无菌水。在本发明方法的步骤2)中，在一个具体实施方案中，该步骤在隔绝空气的状态下进行。该方法可以避免外界空气中的氧气进入测试体系中，或者水中氧气溢出，从而不能保证测定的溶解氧减少的结果完全是好氧微生物呼吸代谢所消耗的。在一个具体实施方案中，将盛所述混合物的容器用预曝气充氧饱和的无菌水加满，排出其中的空气并密封。在一个具体实施方案中，为防止测定过程空气中氧气与液体混合物氧气之间的交换，将缠有生料带的溶解氧(DO)仪探头插入容器中，使探头与容器口达到密封状态，且使容器内无气泡。在本发明的方法的步骤2)中，在一个具体实施方案中，所述一段时间为O. 5-10小时，优选1-5小时。在本发明的方法中，在一个具体实施方案中，测定硝酸根、硫酸根、三价铁离子和亚硝酸根按照标准方法进行测定。例如参照《水和废水监测分析方法第四版》。例如，在一个具体实施方案中，N03_测定方法为酚二磺酸光度法，SO42-为铬酸钡光度法，Fe3+为邻菲啰 呤分光光度法。 在本发明中，硝酸根的电子转移可大致分为2部分，转化为亚硝酸根和完全转化为氮气。在本发明的方法的步骤3)中，在一个具体实施方案中，将生物膜填料取出，放置于105°C烘干24h后称重。在本发明的方法的步骤4)中，在一个具体实施方案中，计算单位时间内生物膜代谢消耗氧分子、硝酸根、硫酸根和铁离子过程所转移的电子摩尔数分别按如下进行单位时间内生物膜代谢消耗氧分子过程所转移的电子摩尔数
权利要求
1.一种生物膜活性测定方法，所述方法包括步骤 1)将挂有生物膜的人工湿地填料与硝酸根、硫酸根、三价铁离子、饱和充氧水混合； 2)测量上述混合物的初始溶解氧含量，并在经过一段时间后测量所述混合物的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度和终三价铁离子浓度，并测量亚硝酸根浓度； 3)将所述生物膜填料取出、干燥并称质量； 4)利用上述生物膜填料的质量、初始溶解氧含量、初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度，以及上述测量的终溶解氧含量、终硝酸根浓度、终硫酸根浓度、终三价铁离子浓度和亚硝酸根浓度计算单位时间内生物膜代谢消耗氧分子、硝酸根、硫酸根和铁离子过程所转移的电子摩尔数，并由这三个值计算所述生物膜的代谢活性。
2.根据权利要求I所述的方法，其中在步骤I)后，还包括 测量所述混合物的硝酸根、硫酸根和三价铁离子的浓度作为所述混合物的初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中所述步骤2)在隔绝空气的状态下进行。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤4)中 所述单位时间内生物膜代谢消耗氧分子过程所转移的电子摩尔数
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中 由所述单位时间内生物膜代谢消耗氧分子、硝酸根、硫酸根和铁离子过程所转移电子摩尔数计算所述生物膜的代谢活性按如下公式进行 生物膜代谢活性=N (O2) +N (硝酸根)1+N (硝酸根)2+N (硫酸根)+N (铁离子)。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤I)之后和步骤2)之前包括将所述混合物预曝气充氧饱和的步骤。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中硝酸根选自NaNO3和KNO3,硫酸根选自Na2SO4' K2SO4 和 MgSO4,三价铁离子选自 FeCl3 和 Fe2 (SO4)30
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述初始硝酸根浓度、初始硫酸根浓度和初始三价铁离子浓度均为O. 2-lmol/L。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述一段时间为O.5-10小时。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述所述已经挂有生物膜的人工湿地填料与步骤I)所得混合物的质量体积比是10-50 250。
全文摘要
本发明公开一种人工湿地填料生物膜活性的测定方法。根据人工湿地填料生物膜好氧微生物、厌氧微生物、兼性微生物新陈代谢特征，采用同时监测这3大类微生物在呼吸代谢中的常用电子受体浓度的变化来反映其生物膜活性的高低。即发明了测定单位时间内溶解氧(DO)含量、硝酸根(NO3-)、硫酸根(SO42-)、三价铁离子[Fe(III)]浓度变化来综合反映生物膜的活性的方法，提供了计算公式，具有可靠的理论依据。该方法结果更准确、稳定、受干扰�。僮骷虻タ旖荩诩际跎峡尚校蒙虾侠怼�
文档编号G01N31/00GK102636613SQ20121007744
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者叶春, 姜怡, 李春华 申请人:叶春, 姜怡, 李春华
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