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专利名称：硒诊断/测定试剂盒及硒的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的 方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
硒是生物必需的微量元素，植物硒是人类和动物获取硒的主要来源，人 体过多的摄入硒能引起硒中毒。硒元素可使人体内的过氧化物分解，保护 细胞膜、心、肾、肺、眼等；可清除人体的自由基，抗衰老，增强人体免 疫功能，可抑制多种致癌物质，人体缺硒会诱发心血管疾病和癌症。
结合国内外有关硒的各种检测方法.其中常用的测定方法如原子吸收 光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法 (ICP-AES)等；原子吸收光谱(AAS)作为元素特效检测器与GC联用已成为微 量元素分析的主要方法。另外还有，应用液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS) 鉴定硒化合物。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用硒依赖性的酶比色法 (Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技 术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光 度的变化，得以测定硒浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方 法的硒诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行硒浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明硒浓度测定方法原理如下
谷胱甘肽二硫+ 2水谷胱甘肽过氧化物酶/Se
2谷胱甘肽+过氧化氢 过氧化氢+甘油酸磷酸甘油-3-磷酸氧化酶甘油-3-磷酸
+氧
甘油-3-磷酸+辅酶 甘油-3-磷酸脱氢酶甘油酸磷酸+
还原型辅酶
这种方法利用硒依赖性的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase; EC 1.11,1.9)酶(偶)联甘油-3-磷酸氧化酶(Glycerophosphate oxidase; EC 1.1.3.21)、甘油-3-磷酸脱氢酶(glycerophosphate dehydrogenase; EC 1.1.1.8; EC 1丄1.9; EC 1丄1.177)酶促反应速率比色法/终点法。谷胱甘肽过氧化 物酶酶解谷胱甘肽二硫反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合甘油-3-磷酸 氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nrn处没有吸收峰) 还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶 在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程 度/速度，可以测算硒的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明硒诊断/测定试剂盒较 为理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
甘油-3-磷酸氧化酶 12000 U/L
甘油-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
谷胱甘肽二硫 10mmol/L 甘油酸磷酸 12mmol/L 本发明的硒诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、 甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、 甘油-3-磷酸脱氢酶。 辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、 谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒 可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直 接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶。 辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、 谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定硒浓度的方法，其辅酶可以是 NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的硒诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 500 mmol/L
辅酶
谷胱甘肽过氧化物酶
甘油-3-磷酸氧化酶
甘油-3-磷酸脱氢酶
谷胱甘肽二硫
甘油酸磷酸
3 mmol/L 10000U/L 12000 U/L 12000 U/L 10 mmol/L 12 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂的 体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左 右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大 小。
实施例二
本实施例的硒诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂 辅酶
谷胱甘肽二硫 甘油酸磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
谷胱甘肽过氧化物酶 甘油-3-磷酸氧化酶
500 mmol/L 10000U/L 12000U/L
甘油-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用'在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测硒样品与试剂1、 试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大 小。
实施例三
本实施例的硒诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶
谷胱甘肽二硫 甘油酸磷酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
甘油-3-磷酸氧化酶 甘油-3-磷酸脱氢酶
3 mmol/L 10 mmol/L 12 mmol/L
画mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
100 mmol/L 500 mmol/L
10谷胱甘肽过氧化物酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定硒浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37i:，反应时间10 分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测 硒样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5,反应方向为正反 应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大 小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析 仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015; 吸光度时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(RX).99)线形范围可 达0.5mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±6%;试剂测试 的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3%;试剂的灵敏度可达0.064 ± 0.032 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便 于推广应用。
权利要求
1. 一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法的硒的浓度测定方法，其方法原理如下谷胱甘肽二硫+2水 <u>谷胱甘肽过氧化物酶/Se</u> 2谷胱甘肽+过氧化氢过氧化氢+甘油酸磷酸 <u>甘油-3-磷酸氧化酶</u> 甘油-3-磷酸 +氧甘油-3-磷酸+辅酶 <u>甘油-3-磷酸脱氢酶</u> 甘油酸磷酸+ 还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出硒的浓度大小测定结果。
2. —种硒诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L辅酶1——6 mmol/L谷胱甘肽过氧化物酶1000-——80000 U/L甘油-3-磷酸氧化酶1000-——80000 U/L甘油-3-磷酸脱氢酶1000-——80000 U/L谷胱甘肽二硫1——50 mmol/L甘油酸磷酸1一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸组成；试剂2,由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷胱甘肽过氧化物酶组成。辅酶、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述硒诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂l一000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用硒依赖性的酶比色法及酶联法技术的硒诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定硒浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、谷胱甘肽二硫、甘油酸磷酸、谷胱甘肽过氧化物酶、甘油-3-磷酸氧化酶、甘油-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出硒的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464331SQ20071019212
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司