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专利名称：血液25-羟基维生素d3腺癌检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，尤其是涉及一种血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
早在100多年前，维生素D作为维持骨骼健康的基本成分而被发现后便广泛用于监测佝偻病、软骨症等骨性疾病的发生。目前，研究者又发现维生素D还和其它多种慢性疾病相关，尤其是癌症。I、维生素D来源与代谢维生素D(Vitamin D，VitD)是脂溶性类固醇衍生物，有五种形式，与健康关系较密切的是VitD2和VitD3。其中，前者来源于酵母细胞中的麦角固醇，后者则来源于动物皮下 7-脱氢胆固醇。通常只要我们每天接受充足的阳光，就可以获得满足人体90%的VitD3需求量， 而一些食物如牛奶、鱼肝油等则会补给VitD2和VitD3，以满足人体余下的10%需求。然而 VitD是没有活性的，在人体内与VitD结合蛋白或脂蛋白结合运送到肝脏，经VitD-25-羟化酶(也称为CYP27A1，CYP3A4, CYP2R1, CYP2J3)催化形成25_(0H)VitD。它是血浆中维生素 D的主要循环形式，常作为评估个体VitD营养状况的检测指标(最佳参考值为75-150nmol/ L，尽管许多实验室采用的参考值为50-250nmol/L)。但25-(OH) VitD无生物活性，需在 25-(OH) VitD-I α -羟化酶作用下，代谢成具有生物活性的1，25_(0H) 2VitD来发挥效应。 研究发现25-(0H)2VitD_l α -羟化酶不仅存在于肾中，也存在于前列腺、乳腺、直肠等多种细胞中，故VitD主要通过两条途径在体内发挥作用一条是内分泌途径，通过血液中的l，25-(0H)2VitD调节全身性的钙稳定状态；另一条是自分泌或旁分泌途径，通过局部的1，25-(0H)2VitD和维生素D受体发挥作用，且不依赖全身性的钙稳定状态，涉及细胞增殖、分化以及免疫调节等。此外，l，25-(0H)2VitD的存在能诱导25-(0H)VitD-24-羟化酶 (CYP24)的表达，从而催化25-(OH) VitD和1，25-(OH) 2VitD形成水溶、无活性的胆骨化醇外排出去。2、维生素D在癌症预防中的分子机制维生素D 受体(vitamin D receptor, VDR),作为 1，25-(OH) 2VitD 的受体,不仅存在于肾、甲状旁腺中调节钙磷平衡，在前列腺，直肠，乳腺，胰腺，免疫系统的各种细胞及其恶性细胞中也均表达。1，25- (OH) 2VitD与VDR结合后，促使VDR与RXR形成异二聚体，最终所形成的复合物作用于祀基因上的维生素D反应元件(vitamin D - responsive elements, VDREs)，调节靶基因的表达。
目前，研究人员(Sreeram V. Ramagopalan, Andreas Heger, Antonio J. Berlangaj et al. A ChlP-seq defined genome-wide map of vitamin D receptor binding:Associations with disease and evolution. Genome Res，2010，20:1352-1360) 发现，维生素D可以直接或间接地影响229个基因的活性。这些基因已经被证明与一系列疾病有关，其中最引人瞩目的就是与癌症发生发展相关的基因表达调节。例如，抑制细胞由 G期向S期转变的蛋白Rb，pl07和pl30等；抑制EGFR及其介导的细胞生长调节信号通路； 降低抗凋亡因子(Bcl-2，Bcl-XL)表达，增加促凋亡因子(Bax，Bak)的表达等来促进恶性细胞凋亡；调节VEGF和E-cadherin等表达，抑制血管生成，阻止恶性细胞转移；并抑制与癌症形成相关的炎症反应等，从而降低癌症的罹病风险。3、维生素D与腺癌流行病学研究1980年代，Cedric Garland和Frank Garland两兄弟通过比较美国不同地理上的直肠癌致死率和阳光照射量，首次提出紫外照射和VitD在降低癌症风险中的角色。随后， 更多流行病学研究开始聚焦于癌症发生率/死亡率与VitD之间的关系。目前，VitD的这一重要作用在多种腺癌中已经广泛接受，其中尤属乳腺癌、结肠癌、前列腺癌研究最多。一项预期和回复性流行病学研究表明25-(OH) VitD水平在50nmol/L以下时，乳腺癌，结肠癌，以及前列腺癌的患病风险增至30% 50%。Grant调查发现，欧洲乳腺癌中25% 死亡率是由于居住在高纬度地区缺失维 生素D造成的。而乳腺癌血清中25-(0H)VitD水平在130nmol/L时，与其含量在25nmol/L相比，以及结肠癌中25-(OH) VitD水平在85nmol/L 与15nmol/L相比时，两种腺癌发生风险均降低50%。一项前瞻性研究表明，在1954个男性对象中维生素D摄入量与结肠癌风险呈直接关系(即当维生素D摄入量为6 94IU/天， 相对风险为I. O ;维生素D摄入量为233 652IU/天，相对风险为O. 53，P < O. 05)。一项八年的追踪研究则发现妇女参与者血清中25-(OH) VitD的基本水平低于30nmol/L时其结肠癌发生风险升高25%[3]。William B. Grant [10]综合多篇研究数据分析表明VitD与乳腺癌和结肠癌的剂量-反应关系呈J形，25-(OH) VitD的最佳量似乎是lOOnmol/L以上，而其水平升至250nmol/L时，对于癌症的作用可能发挥更大。另有研究对比室外工作与室内工作的男性，发现前者患前列腺癌相对晚3 5年，因为室外男性的VitD水平要高于室内工作男性。综合表明25-(OH) VitD水品在lOOnmol/L以上时，乳腺癌，结肠癌，直肠癌发生风险会降低。因此，依据个体阳光照射，年龄，性别，体重以及VitD基本水平，建议每日补充 2000-4000IUVitD可以维持 25-(OH) VitD水品在 100nmol/L 以上(JoEllen Welsh. Cellular and molecular effects of vitamin D on carcinogenesis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2011, doi : 10. 1016/ j. abb. 2011. 10. 019)。VitD对于不同癌症的发生率和致死率的效应是不同的。近来一 篇综述(E. R.Bertone-Johnson,Vitamin D and breast cancer, Ann. Epidemiol. 2009，19(2009)462-467)表明，有很多因素会引起VitD效应的不同，其中包括年龄，女性绝经状况，肿瘤特征以及VDR基因多态性。研究发现VDR基因上Fok I ff与FF 基因型相比，乳腺癌患病风险显著的增加了 14% (Raimondi S，Johansson H, Maisonneuve P, Gandini S:Review and meta-analysis on vitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinogenesis, 2009, 30:1170 - 1180)o 另有方差分析表明 BsmI Bb 与 bb 基因型相比，其前列腺癌患病风险显著的降低了 17%。显然，无论维生素D水平缺失或基因变异，l，25-(0H)2VitD对于细胞生长的正常调控都受到了抑制，促进了恶性细胞生长，从而提高了腺癌的发生风险。4、维生素D在腺癌中的临床应用4. I腺癌生物标记物
世界卫生组织指出，如能早期诊断并及时治疗，95%的肿瘤将可以治愈。这使得生物标记物的发现成为癌症研究的主流。随着新兴的基因组学、蛋白组学技术的飞速发展，如 DNA和组织微矩阵、SELDI-T0F、质谱、ELISA、RT-PCR、FISH等，许多有应用前景的腺癌分子标志物被发现。依据其生物化学和免疫学特性大致分为以下几种(I)基因类标志物微卫星不稳定，DNA超甲基化以及单核苷酸多态性等基因不稳定性是致癌作用的一个基本因素，造成一些癌基因及其产物的异常表达，作为个体差异， 有助于作为癌症风险评估，检测及拟定治疗方案的分子标记物。目前人们已发现近100 种与肿瘤发生、发展相关的癌基因及其产物，部分已应用于肿瘤标志物，涉及原癌基因(如 Her-2)和抑癌基因(如BRCAl, MTSl )，它们在多数癌症中都呈现异常表达，是较佳的广谱肿瘤分子标记物。另外，一些转移相关基因(如μι23)和凋亡相关基因(如Bcl-2)则与癌症侵袭、凋亡相关，可作为预后指标。MLH1，MSH2或者MSH6这些基因错配突变而引起的微卫星不稳定证明与直肠癌预后相关，但由于直肠癌标志物的低特异性以及微卫星不稳定性，其使用并不广泛。(2)酶类标记物酶及同工酶是最早出现和使用的肿瘤标志物之一，表现为在肿瘤发生过程中，与细胞分化或增生相关组织特异性酶或同工酶类量或(和)活性改变。例如前列腺特异性抗原PSA、人类腺体激肽释放酶2(hk2)、基质金属蛋白酶MMPs、溶酶体半胱氨酸蛋白酶Cath印SinB和L，丝氨酸蛋白酶类uPA和其抑制剂PAI-1，2等。(3)抗原类标记物主要分为肿瘤抗原(CEA、PCNA、Ki-67等)以及糖类抗原 (CA125、CA15-3 等)。(4)激素及其受体类标记物如降钙素Calcitonin、雌激素受体ER以及孕酮受体 PR、胸腺素 thymosin β -15 等。(5)其它蛋白类如骨桥蛋白0ΡΝ，在转移性乳腺癌，前列腺癌以及肺癌病人的血液中呈高水平表达，可作为腺癌预后标志物。近来，FDA批准了一些新的基于尿液的生物标记物，其中包括核基质蛋白ΝΜΡ22，作为膀胱癌的诊断标记。这些肿瘤标志物在腺癌发生风险评估、诊断、判断预后、评价疗效和高危人群随访观察等方面都发挥着较大的实用价值。4. 2VitD检测在腺癌诊断中的应用目前已经命名的肿瘤标志物已有100多种，临床应用的标志物达到20左右，但因单项肿瘤标志物敏感度和特异度较低，无法准确诊断肿瘤和预测预后。国内外研究表明，多肿瘤标志物联合动态检测是提高肿瘤诊断可行性策略。因此，我们旨在发现更多的生物标记物，希望使诊断结果更加可靠。综上VitD与腺癌的流行病学概述以及与癌症相关的分子机制研究来看，VitD与多种腺癌的发生发展有着不可切割的关系。而VitD作为个体物质代谢所必需的小分子有机化合物，与基因和蛋白类等大分子类标记物相比在体内代谢生成的无活性的25-(0H)VitD半衰期为2周，比较稳定，相对而言更能实时的反映人体状况，具有较好的指示性；研究人员发现将血液中的VitD代谢物储存于24°C、 72h 仍保持完整(Bruce W Hollis. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr, 2008，88 (suppl) : 507S - 10S),故保证了样品储存时其稳定性；检测实验中避免了基因或蛋白污染、降解等造成的结果偏差，具有可靠地预测性；同时也简化了样本处理步骤，易于检测；且在多种腺癌中其水平都呈现明显变化，有一定的敏感性；因此，若将VitD作为癌症发生风险的预测因子之一将推动癌症的诊断治疗发展更迈进一步。VitD在体内并不稳定，会代谢成25- (OH) VitD和1，25- (OH) 2VitD。血清中25- (OH) VitD半衰期为2周，在人体内水平稳定，而1，25- (OH) 2VitD半衰期为15h，是VitD的活性形式，受多种因素调控，在许多靶组织中都会产生，即使VitD缺失，I, 25-(OH) 2VitD水平也常处于正常或增高状态，所以用它来决定VitD是否缺失是没有意义的，(Michael F. Holick. High Prevalence of Vitamin D Inadequacy and Implications for Health. Mayo Clin Proc, 2006, 81 (3) :353-373)故临床上以血清中1，25-(OH) VitD含量作为个体VitD状况的晴雨表。目前，检测人体内25_(0H)VitD方法主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验方法液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，高效液相色谱技术(HPLC)。这两种方法都可分别检测25-(0H) VitD2和25-(0H) VitD3含量，具有高重复性，通常将HPLC作为“黄金标准” 方法。但这些方法繁琐费时，要求样本相对大，需要专业培训的技术人员准确操作，且LC-MS 无法区分25-(0H)VitD3和其非活性同分异构体，而这个问题在新生儿含量检测时尤其需要注意，因此并不适用于临床实验室。免疫学方法放射免疫测定(RIA)、竞争蛋白结合测定(CPBA)、放射受体测定(RRA)和酶联免疫测定(EIA)，由于具有灵敏、快速、特异、简便等优点，在市场上应用已成为一种必然的趋势，如罗氏Elecsys25-羟基维生素D3，检测使用了抗VitD3多克隆抗体，诊断成人体内维生素VitD3是否充足，与其它临床数据结合，作为辅助手段来判定骨代谢状况。
然而目前的检测方法都只应用于临床上评价个体骨质疾病发生情况，故我们希望研究一个用以预测腺癌发生风险的25-(OH) VitD检测方法。基于免疫学灵敏，快速，特异， 简便等特点，本实验室建立一种可定量检测25-(0H)VitD3的免疫学方法。25-(0H)VitD3是一种脂溶性小分子化合物，结构简单，属于半抗原，不具备免疫原性，需将其连接到大分子蛋白质载体上，才能制备人工完全抗原。故本实验室制备出25-轻基维生素D3-半琥拍酸酯-BSA抗原，已用其制备出多克隆抗体，目前正进行单克隆抗体的制备，期待未来能装配成可供临床应用的25-(0H)VitD3检测试剂盒，用以估测腺癌的发生风险性，使其成为检测腺癌病人的第一道门槛。目前，越来越多的研究表明，25-羟基维生素D3可以作为腺癌的一项指标，但是， 目前，一套可行的将25-羟基维生素D检测应用到腺癌检测的商品化产品仍然比较缺乏。大多数技术载体蛋白与25-羟基半琥珀酸酯偶联的过程使用了水相，相比有机相来说，偶联的效率不高，操作过程复杂，抗原的免疫效果较差。在维生素D的检测方面也有商品化的产品，例如罗氏25-羟基维生素D3电化学发光免疫测定“ECLIA”，英国idas25_羟基维生素D检测试剂盒(酶联免疫法)，试剂盒用于维生素D缺乏状况的评估，并且尚未进行关于腺癌方面的诊断性的研究的说明。

发明内容
本发明的目的在于提供一种血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒及其制备方法。所述血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒包括不同浓度的校准品(校准品记为CAL):含25-羟基维生素D3的人血清。所述25-羟基维生素 D3 浓度可米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板(抗体的酶标板记为AbPLAT):孔内包被抗-25羟基维生素D3的抗体，所述酶标板可采用12X8条，包装到带干燥剂的锡箔袋中。标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3(标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素 D3 记为 VD3+HRP)。质控品(质控品记为CTRL):含25-羟基维生素D3和叠氮化钠的人血清冻干品，所述叠氮化钠的百分含量为O. 07% O. 09%。底物显色液包括底物A (底物A记为SUBSA)和底物B (底物B记为SUBSB)，所述底物A为四甲基联苯胺与醋酸钠混合溶液，所述底物B为过氧化氢的水溶液。反应终止液(反应终止液记为STOP):采用O. 35 O. 5M的氢氯酸。
冲洗液(冲洗液记为WASHBUF):采用含有吐温_20的磷酸盐缓冲液，所述吐温_20 的百分含量为O. 1%。所述血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤I)配制不同浓度的校准品(校准品记为CAL):含25-羟基维生素D3的人血清,25-轻基维生素 D3 浓度分别为，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)制备包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板，具体方法如下(I)用0. 05M pH9. O的碳酸盐包被缓冲液将抗_25羟基维生素D3的抗体稀释至含量为I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每个96孔酶标板的反应孔中加0. Iml抗-25羟基维生素D3的抗体混合液， 4°C过夜。(3)次日，弃去孔内溶液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲水溶洗3次，每次3min。3)制备标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，具体方法如下(I)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于Iml蒸馏水中，再加入0. 2ml 0. IM高碘酸钠水溶液，得混合溶液；(2)将混合溶液装入透析袋中，对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，取出醛基化辣根过氧化酶溶液，再加入20 μ I 0. 2Μ ρΗ9. 5碳酸盐缓冲水溶液，调节pH值至
9.O 9. 5，然后加入IOmg 25-羟基维生素D3半琥珀酸酯在Iml 0. OlM碳酸盐缓冲水溶液中；(3)加入0. Iml 4mg/ml硼氢化钠水溶液，混匀，再置4°C 2h后装入透析袋中， 对0. 15MpH7. 4磷酸盐缓冲水溶液透析，4°C过夜后，加入等体积饱和硫酸铵，置4°C Ih, 再3000rpm离心0. 5h，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5ml
0.15M pH7. 4的磷酸盐缓冲水溶液中；(4)将步骤(3)得到的溶液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液(0. 15M，pH7. 4)透析， 去除铵离子后，10，OOOrpm离心30min去除沉淀，上清液即为标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，分装后，冰冻保存；4)配制质控品(质控品记为CTRL):将25-羟基维生素D3溶解到人血清，冷冻干燥后，称重。为便于长期储存，按照0.07% 0.09%百分含量加入叠氮化钠；
5)配制底物A:称取TMB 17. 2mg(固体)，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸钠缓冲液(O. 1M, pH5. 5) 66ml ；6)配制底物B :取一水合柠檬酸2. lg、无水磷酸氢二钠2. 82g和O. 75%的过氧化氢尿素O. 64ml,用双蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反应终止液(反应终止液记为STOP):取O. 5M的氢氯酸水溶液。8)配制冲洗液(冲洗液记为WASHBUF):取含有吐温_20的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20的百分含量为O. 1%。本发明的有益效果如下本发明采用一系列的化学修饰，最终将25-羟基维生素D3修饰为25-羟基维生素 D3半琥珀酸脂。通过改良碳二亚胺法与蛋白载体BSA蛋白偶联，最终由半抗原变为完全抗原。并且结合酶联免疫吸附测定的方法开发出血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒。本发明的实际应用是用于临床上癌症的检测，并且癌症的血液学检测到目前为止仍然是个技术难题，商品化血液检测产品的开发也是具有极其重要的意义。



图I为血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒实施例的结构组成示意图。图2为未偶联25-羟基维生素D的BSA的MALDI-T0F质谱图。图3为25-羟基维生素D在有机相中偶联BSA的MALDI-T0F质谱图。图4为25-羟基维生素D在水相中偶联BSA的MALDI-T0F质谱图。在图2 4中，横坐标为荷质比m/z，纵坐标为强度Intensity。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。参见图1，所述血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒实施例包括I、不同浓度的校准品(校准品记为CAL):含25-羟基维生素D3的人血清，25-羟基维生素 D3 浓度分别为 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L，分别记为 CAL-I, CAL-2，CAL-3，CAL-4，CAL-5，CAL-6，CAL-7。2、包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板(抗体的酶标板记为AbPLAT):孔内包被抗-25羟基维生素D3的抗体，酶标板12X8条，包装到带干燥剂的锡箔袋中。3、标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3(标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3记为VD3+HRP)。4、质控品(质控品记为CTRL,简与为C):含25-轻基维生素D3和置氣化纳的人血清冻干品，所述叠氮化钠的百分含量为0. 07% 0. 09%。5、底物显色液包括底物A (底物A记为SUBSA)和底物B (底物B记为SUBSB)，所述底物A为四甲基联苯胺与醋酸钠混合溶液，所述底物B为过氧化氢的水溶液。6、反应终止液(反应终止液记为STOP) 0. 35 0. 5M的氢氯酸。7、冲洗液(冲洗液记为WASHBUF):含有吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20的百分含量为0. 1%。所述不同浓度的校准品、包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板、标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3、质控品、底物显色液、反应终止液和冲洗液设在盒体H内。以下给出血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒的制备方法I)配制不同浓度的校准品(校准品记为CAL):含25-羟基维生素D3的人血清,25-轻基维生素 D3 浓度分别为，Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L,330nmol/L。2)制备包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板，具体方法如下(I)用O. 05M pH9. O的碳酸盐包被缓冲液将抗_25羟基维生素D3的抗体稀释至含量为I 10 μ g / ml的混合液。(2)在每个96孔酶标板的反应孔中加O. Iml抗-25羟基维生素D3的抗体混合液， 4°C过夜。(3)次日，弃去孔内溶液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲水溶洗3次，每次3min。 3)制备标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，具体方法如下(I)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于Iml蒸馏水中，再加入O. 2ml O. IM高碘酸钠水溶液，得混合溶液；(2)将混合溶液装入透析袋中，对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，取出醛基化辣根过氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸盐缓冲水溶液，调节pH值至
9.O 9. 5，然后加入IOmg 25-羟基维生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸盐缓冲水溶液中；(3)加入O. Iml 4mg/ml硼氢化钠水溶液，混匀，再置4°C 2h后装入透析袋中， 对O. 15MpH7. 4磷酸盐缓冲水溶液透析，4°C过夜后，加入等体积饱和硫酸铵，置4°C Ih, 再3000rpm离心O. 5h，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5ml
O.15M pH7. 4的磷酸盐缓冲水溶液中；(4)将步骤(3)得到的溶液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液(O. 15M，pH7. 4)透析， 去除铵离子后，10，OOOrpm离心30min去除沉淀，上清液即为标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，分装后，冰冻保存；4)配制质控品(质控品记为CTRL):将25-羟基维生素D3溶解到人血清，冷冻干燥后，称重。为便于长期储存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入叠氮化钠；5)配制底物A :称取TMB 17. 2mg(固体)，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸钠缓冲液(O. 1M, ph5. 5) 66ml ；6)配制底物B :取一水合柠檬酸2. lg、无水磷酸氢二钠2. 82g和O. 75%的过氧化氢尿素O. 64ml,用双蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反应终止液(反应终止液记为STOP):取O. 5M的氢氯酸水溶液。8)配制冲洗液(冲洗液记为WASHBUF):取含有吐温_20的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20的百分含量为O. 1%。实施例I25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸酯-BSA的合成本合成方法中，化学活化25-羟基维生素D3的3位，并与作为载体的BSA蛋白偶联。这个合成经过25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯和25-羟基-维生素D3-3-半琥珀酰亚胺酯等中间步骤。25-羟基维生素D3结构式如下
权利要求
1.血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒，其特征在于包括不同浓度的校准品含25-羟基维生素D3的人血清；包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板孔内包被抗-25羟基维生素D3的抗体；标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3 ；质控品含25-羟基维生素D3和叠氮化钠的人血清冻干品，所述叠氮化钠的百分含量为 O. 07% O. 09% ；底物显色液包括底物A和底物B，所述底物A为四甲基联苯胺与醋酸钠混合溶液，所述底物B为过氧化氢的水溶液；反应终止液采用O. 35 O. 5M的氢氯酸； 冲洗液采用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20的百分含量为O. 1%。
2.如权利要求I所述的血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒，其特征在于所述 25-轻基维生素 D3 浓度米用 Onmol/L, 6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L。
3.如权利要求I所述的血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒，其特征在于所述酶标板采用12X8条，包装到带干燥剂的锡箔袋中。
4.如权利要求I所述的血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)配制不同浓度的校准品含25-羟基维生素D3的人血清，25-羟基维生素D3浓度分别为，Onmol/L，6nmol/L, 18nmol/L, 30nmol/L, 50nmol/L, 180nmol/L, 330nmol/L ；2)制备包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板，具体方法如下(1)用O.05M pH9. O的碳酸盐包被缓冲液将抗-25羟基维生素D3的抗体稀释至含量为 I 10 μ g / ml的混合液；(2)在每个96孔酶标板的反应孔中加O.Iml抗-25羟基维生素D3的抗体混合液，4°C 过夜；(3)次日，弃去孔内溶液，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲水溶洗3次，每次3min；3)制备标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，具体方法如下(1)称取5mg辣根过氧化物酶溶解于Iml蒸馏水中，再加入O.2ml O. IM高碘酸钠水溶液，得混合溶液；(2)将混合溶液装入透析袋中，对ImMpH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，取出醛基化辣根过氧化酶溶液，再加入20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸盐缓冲水溶液，调节pH值至9. O 9. 5，然后加入IOmg 25-羟基维生素D3半琥珀酸酯在Iml O. OlM碳酸盐缓冲水溶液中；(3)加入O.Iml 4mg/ml硼氢化钠水溶液，混勻，再置4°C 2h后装入透析袋中，对O.15MpH7. 4磷酸盐缓冲水溶液透析，4°C过夜后，加入等体积饱和硫酸铵，置4°C Ih,再 3000rpm离心O. 5h，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵水溶液洗，最后沉淀物溶于2. 5mlO.15M pH7. 4的磷酸盐缓冲水溶液中；(4)将步骤(3)得到的溶液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析，去除铵离子后， 10，OOOrpm离心30min去除沉淀，上清液即为标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3，分装后，冰冻保存；4)配制质控品将25-羟基维生素D3溶解到人血清，冷冻干燥后，称重。为便于长期储存，按照O. 07% O. 09%百分含量加入叠氮化钠；5)配制底物A:称取TMB 17. 2mg，加DMSO Iml溶解，然后加入醋酸钠缓冲液66ml ；6)配制底物B:取一水合柠 檬酸2. lg、无水磷酸氢二钠2. 82g和O. 75%的过氧化氢尿素O. 64ml,用双蒸水定容至100ml, pH4. 5 5. O ;7)配制反应终止液(反应终止液记为STOP):取O.5M的氢氯酸水溶液；8)配制冲洗液取含有吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述吐温-20的百分含量为O.1%。
全文摘要
血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒及其制备方法，涉及一种检测试剂盒。试剂盒包括不同浓度的校准品、包被有25-羟基维生素D3的抗体的酶标板、标有辣根过氧化物酶的25-羟基维生素D3、质控品、底物显色液、反应终止液和冲洗液。采用一系列的化学修饰，最终将25-羟基维生素D3修饰为25-羟基维生素D3半琥珀酸脂。通过改良碳二亚胺法与蛋白载体BSA蛋白偶联，最终由半抗原变为完全抗原。并且结合酶联免疫吸附测定的方法开发出血液25-羟基维生素D3腺癌检测试剂盒。可用于临床上癌症的检测。
文档编号G01N33/82GK102692514SQ20121020688
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者万巍巍, 叶辉铭, 吕晓楠, 曾骥孟, 蔡良良, 郑立谋 申请人:厦门大学