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肝损伤新诊断标志物调钙素的elisa检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明“肝损伤新诊断标志物调钙素的ELISA检测试剂盒”，属于生物领域。本发明提供了一株新的小鼠杂交瘤细胞系GB118，保藏号为CGMCC：6909。该细胞系能够产生高效价，特异性，灵敏性好的单克隆抗体。本发明基于该单克隆抗体，从纯化抗体，优化反应条件等方面建立了用于检测调钙素蛋白的ELISA方法和试剂盒。实验数据表明，本发明提供的试剂盒和检测方法，具有良好的灵敏性，稳定性和特异性，能够很好地运用于调钙素蛋白的检测以及调钙素蛋白与肝损伤的相关关系中的研究。
【专利说明】肝损伤新诊断标志物调钙素的ELISA检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学检测试剂，特别是一种检测肝损伤患者血清中调钙素水平的 ELISA检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]肝脏炎症是各种原因损伤肝脏的共同后果，尤以各种病毒感染、药物损伤等因素 多见。我国是HBV感染的高流行区，乙肝表面抗原阳性率为7.18%，而HCV感染者大约为 3800万，近年来由于生活方式改变等多种因素的影响，酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病 等亦有明显增多。HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌，是主要的疾病死亡原 因之一。因此，病毒性肝炎仍然是严重威胁我国广大人民群众健康的最主要传染病之一。
[0003]肝脏炎症损伤程度对确定患者的诊断和治疗非常重要，例如对于慢性乙肝炎患 者，肝脏炎症是进行抗病毒治疗的重要指征。目前，临床上广泛应用的肝脏损伤血清学 指标主要是谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)。多项研究表明,血清转氨酶水平与肝脏炎症程度常常不一致。在 转氨酶正常的慢性无症状HBV感染者中，肝组织完全正常的仅占极少数，大约90%左右的 感染者有不同程度的肝组织炎症及纤维化。王福生等发现在86例血清ALT持续正常、HbeAg 阴性的慢性乙肝感染者，组织病理均表现为不同程度的炎症，其中达G2级以上者站16.3%。 而何金秋等发现在46例ALT正常的慢乙肝患者中，有20例(43.5%)患者肝组织炎症分级 达G2级以上，而38例ALT轻度升高(1-2倍正常值上限)的患者中，28例(73.7%)达到G2 级以上。由此可见，ALT和AST作为目前仅有的肝脏炎症指标，其临床意义具有一定的局限 性。基于这一点共识，临床医生常常需要对患者进行肝活检病理组织学检查，以明确肝脏炎 症的真实情况。但该检查为创伤性检查，患者不愿接受，并且由于难以重复进行，不适合作 为诊断和疗效判断的常规手段。此外由于“酶胆分离”现象的存在，转氨酶对重型肝炎的诊 断意义更差。因此，临床上迫切需要其他更灵敏准确的血清学指标来进行辅助诊断，弥补转 氨酶的不足。
[0004]调钙素(regucalcin)是肝细胞胞浆中的一种可溶性蛋白质，含量非常丰富，占 肝脏可溶性蛋白总量的2%，在肝脏损伤时可释放入血，国外研究表明调钙素在ALT正常 的肝炎患者血清中升高，并且在重型肝炎患者血清中亦显著升高，提示其有可能作为反映 肝脏炎症的新的血清标志物。人类调钙素基因位于染色体X q 11.3 - 11.23，cDNA长度 为1438bp,分子质量为33KD。调I丐素主要分布在肝细胞的细胞质、细胞核及肾近曲小管的 刷状缘等处，提示与肝肾疾病密切相关。调钙素与衰老有关，因此又被称为衰老标记蛋白 (Senescence marker protein-30)。调I丐素在多种组织、细胞内发挥着重要的生理作用，最 主要的作用是调节细胞内钙稳态，此外还具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和(或) 苏氨酸磷酸酶的作用，从而影响蛋白质磷酸化一去磷酸化这一细胞内重要的调节功能。调 钙素还具有抑制细胞增殖的作用。
[0005]Yamaguchi M等研究发现，当间断给予大鼠CCL4诱导肝损伤时,ALT、AST等指标在第3天和第6天显著升高，在第18天和30天时恢复正常。而调钙素除了在第3天和第6 天显著升高，在第18天和30天时仍显著高于正常，这与组织学恢复速度相吻合。Isogai M 等予大鼠腹腔内注射半乳糖胺或者CCl4灌胃同样引起大鼠血清中ALT、AST和调钙素显著 升高。Yamaguchi M等还检测了 42例肝病患者血清中调钙素水平(包括急慢性肝炎、肝硬化 和肝癌患者)，发现血清中调钙素水平与ALT水平不完全平行，其中18例ALT和AST水平正 常，而调钙素水平却显著升高，其浓度为3.7?69.6ng / ml。正常人血清中则不能检测到 调钙素。Wei L等应用蛋白质组学和WB的方法研究发现，调钙素只在急性肝衰竭小鼠血浆 中升高，并且仅在存活的小鼠中恢复至正常水平，而在正常小鼠为阴性。采用WB法对4例 急性肝衰竭患者血清进行检测显示，患者血清中调钙素是正常人的3.65±0.34倍。因此， Wei L等认为调钙素在急性肝衰竭中不仅具有诊断意义，而且也有可能协助判断预后。
[0006]但遗憾的是国内外尚没有检测血清调钙素的试剂盒，极大地限制了临床应用及科 研研究。目前有关该标志物与肝细胞损伤之间的关系仍然缺乏系统的对照研究，对肝衰竭 患者相关研究仅进行了 4例血清学WB检测。显然，评价调钙素的临床意义急需标准规范的 试剂盒，尽管该课题组前期进行了一些研究，但由于某些限制，蛋白及抗体等未进行纯化， 因此建立的双抗体夹心ELISA检测方法有待进一步优化。

【发明内容】

[0007]本发明根据上述领域的需求，基于筛选到的分泌调钙素蛋白特异性单克隆抗体的 杂交瘤细胞系及多抗构建了灵敏特异的调钙素ELISA检测方法和检测试剂盒，技术方案如 下:
[0008]小鼠杂交瘤细胞系GB118，保藏号为CGMCC N0.6909。
[0009]由所述小鼠杂交瘤细胞系GBl 18产生的抗血清
[0010]一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由上述杂交瘤细胞系GB118 分泌而得。一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由上述的杂交瘤细胞系 GBl 18制备而得。
[0011]一种结合调钙素蛋白的抗体，其重链可变区由上述单克隆抗体的重链可变区的氨 基酸序列所定义，和/或其轻链可变区由上述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列所定 义。
[0012]一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于:所述酶标板微孔 内包被有含权利要求2所述的单克隆抗体的包被液。
[0013]所述包被液中的单克隆抗体的浓度为0.5 ii g/ml。
[0014]所述ELISA试剂盒还包括抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗 是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊 抗兔二抗。
[0015]用于非诊断目的检测调钙素水平的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，酶联免疫 反应中的第一抗体为权利要求2?4任一所述的抗体。
[0016]所述双抗夹心ELISA方法，还包括采用抗调钙素蛋白多抗和酶标二抗，所述抗调 钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化 物酶标记的羊抗兔二抗；[0017]所述抗调钙素蛋白多抗的工作稀释倍数为1000，所述酶标二抗的工作稀释倍数为 5000。
[0018]所述ELISA方法中，在加多抗后反应条件为:37°C90分钟，加入酶标二抗后反应条 件为37 0C 30分钟。
[0019]本发明一方面的贡献在于获得了一株优异的分泌调钙素蛋白单克隆抗体的杂交 瘤细胞株。
[0020]本发明另一方面的主要贡献在本发明基于该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，经 过抗体纯化以及ELISA反应参数的选择和优化，提供了一种灵敏特异的检测调钙素蛋白的 ELISA方法和试剂盒。根据中华人民共和国医药行业标准《酶联免疫吸附法检测试剂盒》 (YY/T1183-2010)对该ELISA方法进行评价，各项指标均达到行业标准要求，该方法和试剂 盒用于检测调钙素，灵敏度可达到ng / ml的水平，与其它蛋白无交叉反应，可用于特异性 检测调钙素。
[0021]基于本发明所得的单克隆抗体，本领域技术人员采用现有技术，例如测序技术以 及重组分子生物学技术等能够毫无疑义地获得其氨基酸序列，进而获得具有相同的抗原结 合特性的嵌合抗体、人源化抗体，单链抗体，F (ab)2，小分子抗体，抗原结合片段等蛋白或多 肽，这些衍生抗体的共性在于其抗原结合区的由本发明的单克隆抗体的对应区域的氨基酸 序列所定义。
[0022]本发明的方法检测调钙素水平并非都有诊断目的有关，该方法的一个最主要的用 途在于用于调钙素蛋白与肝损伤之间的相关性研究。本发明请求保护这种实施为非诊断目 的检测。
[0023]在本发明的检测方法中，主要优化了单抗，多抗以及二抗之间的搭配，实验结果证 明，本发明的10号单抗+多抗+羊抗兔酶标二抗是最优搭配。
[0024]本发明的检测方法中，还对上述搭配中的各种抗体的使用浓度进行了优化，实验 表明一抗10号抗体的包被浓度为0.5 u g/ml，多抗的工作稀释倍数为1000倍，酶标二抗的 工作稀释倍数为5000倍。
[0025]本发明的检测方法中，还进一步对于双抗夹心ELISA反应中各步骤的反应条件以 及试剂进行了优化和选择。最终得出稳定性，灵敏性以及特异性的表现良好的最优实施方 式:
[0026]调钙素双抗体夹心ELISA检测方法基本建立，反应条件为:
[0027]①抗体组合:10号单抗+多抗+羊抗兔HRP酶标二抗
[0028]②蛋白及抗体稀释液:5%酪蛋白样品稀释液；封闭液:10%GS封闭液
[0029]③包被浓度:0.5 U g/ml，包被条件:4°C过夜
[0030]④标准品选用不同浓度的市售调钙素蛋白，加样后4°C过夜
[0031]⑤多抗浓度:1:1000，反应条件:37°C 90min
[0032]⑥羊抗兔HRP酶标二抗浓度:1:5000，反应条件:37 °C 30min
[0033]专业术语:
[0034]本发明所用的术语“单克隆抗体”指由杂交瘤细胞分泌产生的无杂质的单一免疫 球蛋白。
[0035]本发明所用的术语“抗体”，指杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，以及基于原单克隆抗体的抗原结合区域序列信息，采用重组分子生物方法获得的嵌合抗体，人源化抗体，抗原结合片段，小分子抗体等具有与原单克隆抗体相同的抗原结合特性的分子。
[0036]生物保藏信息
[0037]保藏号:CGMCCN0.6909
[0038]生物材料名称:小鼠杂交瘤细胞GB118
[0039]保藏日期:2012年11月29日
[0040]保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0041]地址:北京市朝阳区大屯路
【专利附图】

【附图说明】
[0042]图1.调钙素重组蛋白基因测序结果。
[0043]图2.调钙素蛋白诱导前/后的上清及沉淀的电泳分析。
[0044]1.诱导前上清,2.诱导后上清,3.诱导前沉淀,4.诱导后沉淀，M.marker。
[0045]图3.重组调钙素蛋白GST亲和层析电泳分析。
[0046]1.粗提蛋白，2.流穿峰，3.洗脱峰。
[0047]图4.纯化重组调钙素蛋白电泳分析。
[0048]图5.腹腔接种杂交瘤细胞后BALB/c小鼠腹水产生情况。
[0049]左为对照BALB/c小鼠，右为腹水BALB/c小鼠。
[0050]图6.腹腔接种杂交瘤细胞后抽取BALb/c小鼠腹水。
[0051]图7.市售蛋白、重组蛋白与自制多抗及10号单抗的WB分析。
[0052]图8.单抗效价测定，其中，横坐标抗体稀释倍数，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
[0053]图9.多抗效价测定，其中，横坐标抗体稀释倍数，纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
[0054]图10.ELISA方法以市售调钙素蛋白为标准品的标准曲线。
[0055]横坐标:调|丐素浓度(ng/ml),纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
[0056]图11.调钙素重组蛋白浓度与校正浓度的相关性。
[0057]横坐标:重组蛋白校正浓度ng/ml，纵坐标:重组蛋白浓度ng/ml。
[0058]图12.双抗体夹心ELISA方法调钙素蛋白线性检测范围。
[0059]横坐标:调I丐素蛋白浓度(ng/ml, lg),纵坐标A450/630nm波长下OD值(lg)。
[0060]图13.血清调钙素对慢加急/亚急性肝衰竭的诊断ROC曲线。
【具体实施方式】
[0061 ]下面通过具体试验数据说明本发明的技术方案。
[0062]实施例1调钙素蛋白及抗体的制备、纯化及验证
[0063]I实验材料
[0064]1.1实验动物
[0065]BALB/c小鼠,清洁级,8周龄,体重18g?20g,雄性,购自中国军事医学科学院实验动物中心。[0066]新西兰大耳白兔，清洁级，体重2.5~3.0kg，雌性，购自中国军事医学科学院实验动物中心。
[0067]1.2实验材料
[0068]可表达调钙素蛋白的质粒pGEX-4T_regucalcin ((记载于李莉，高秀来，宋一志等.融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达.首都医科大学学报，2006，27(6):788-791.)
[0069]杂交瘤细胞系DC091(保藏号:CGMCC N0.6905 ;分泌本发明的中用到的18号抗体)和杂交瘤细胞系GB118细胞(保藏号=CGMCC N0.6909 ;分泌本发明的中用到的10号抗体)，培养条件:RPMI1640基础培养基+20%胎牛血清+1%青霉素/链霉素，温度:37°C，C02浓度:5%。
[0070]1.3实验试剂
[0071]
【权利要求】
1.小鼠杂交瘤细胞系GBl18，保藏号为CGMCC N0.6909。
2.权利要求1所述的小鼠杂交瘤细胞系GBl18产生的抗血清。
3.一种结合调钙素蛋白的单克隆抗体，其特征在于，是由权利要求1所述的杂交瘤细 胞系GBl 18制备而得。
4.一种结合调钙素蛋白的抗体，其重链可变区由权利要求3所述单克隆抗体的重链可 变区氨基酸序列所定义，和/或其轻链可变区由权利要求3所述单克隆抗体的轻链可变区 的氨基酸序列所定义。
5.一种检测调钙素水平的ELISA试剂盒，包括酶标板，其特征在于:所述酶标板微孔内 包被有含权利要求3所述的单克隆抗体的包被液。
6.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，所述包被液中的单克隆抗体的浓度为 0.5 u g/mlo
7.根据权利要求3所述的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒还包括抗调钙素蛋白多抗 和酶标二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫新西兰大耳白兔后分离纯化获得的 多抗，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
8.用于非诊断目的检测调钙素水平的双抗夹心ELISA方法，其特征在于，酶联免疫反 应中的第一抗体为权利要求3所述的单克隆抗体。
9.根据权利要求6所述的双抗夹心ELISA方法，还包括采用抗调钙素蛋白多抗和酶标 二抗，所述抗调钙素蛋白多抗是调钙素蛋白免疫家兔后分离纯化获得的多抗，所述酶标二 抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗；所述抗调钙素蛋白多抗的工作稀释倍数为1000，所述酶标二抗的工作稀释倍数为 5000。
10.根据权利要求9所述的双抗夹心ELISA方法，所述ELISA方法中，在加多抗后反应 条件为:37°C 90分钟，加入酶标二抗后反应条件为37°C 30分钟。
【文档编号】G01N33/68GK103592438SQ201310206809
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年5月29日 优先权日:2013年5月29日
【发明者】李莉, 张晶, 韦新焕, 刘晓慧, 郭海清, 马丽霞, 赵鹏, 谢立 申请人:首都医科大学附属北京佑安医院