专利名称：J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，通过检测鸡群J亚群禽白血病抗体，从而回顾性地判断鸡群是否感染过J亚群禽白血病病毒。
背景技术：
J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一种肿瘤性传染病。 ALV-J是具有囊膜的反转录病毒禽临床感染主要表现为髓细胞瘤、免疫耐受、高死亡率和生长迟缓。1997 1998年间，ALV-J呈全球性爆发，对世界肉种鸡业造成了毁灭性打击。ALV-J 感染除引起髓细胞瘤外，成红细胞瘤、血管瘤、肾瘤、和肉瘤常在感染后期伴随发生，通常死亡率为 5%，高峰期可达50%。研究证实，ALV-J对免疫应答具有持久损害作用，使生产力低下，继发感染和混合感染频发，J亚群禽白血病给家禽养殖业带来极大的风险。1、J亚群禽白血病在我国频发
我国白羽肉种鸡均从国外引进，且未对新出现的ALV-J采取任何防范措施，加之我国的养殖条件相对落后，使ALV-J在我国造成的损失高于其它任何国家。2000年，J亚群禽白血病在我国白羽肉种鸡中全面爆发，造成了巨大的经济损失；2002 — 2005年间，ALV-J病毒突破种间屏障，造成广东、广西三黄鸡、中国麻鸡鸡群中爆发J亚群禽白血�。剐矶嘌吵〉贡眨�2007年和J亚群禽白血病密切相关的血管瘤病在蛋鸡群及商品蛋鸡群中爆发，并很快席卷全国。J亚群禽白血病在我国鸡群中流行发生具有一下特点
1)感染率及发病率居高不下。近10年来，在肉种鸡、蛋种鸡中感染率均在10%左右； 2)混合感染促使病毒重组率增高。调查显示，禽白血病与马立克氏病、网状内皮增生症病的混合感染日趋严重，为临床诊断带来了困难；3)早期感染普遍、发病日龄明显提前。目前在青年鸡群或开产前的鸡群中J亚群禽白血病已成为常见�。�4)宿主范围扩展。爆发血管瘤的蛋鸡、我国特有鸡种麻鸡、柴鸡及芦花鸡中也检出ALV-J，这表明了 J亚群禽白血病正在向蛋鸡、地方鸡种传播，其宿主范围正在明显扩大；5)肿瘤趋于多样化。目前，我国感染禽群中出现了诸多以前罕见的肿瘤，如血管瘤、成红细胞瘤、肝细胞癌、腺癌、纤维瘤、皮肤癌和输卵管癌等；6)致病性增强。许多在蛋鸡及地方鸡中发现的肿瘤要比之前肉种鸡的病变更加严重，在肉鸡体内的某些器官内从未发现髓细胞瘤，而在蛋鸡中比较常见，如颈部髓细胞瘤、腰荐髓细胞瘤肠髓细胞瘤等。2、J亚群禽白血病的防控现状
一直以来，由于ALV-J病毒自身的特殊性以及引起疾病的复杂性，对ALV-J的防治研究未见显著成就，至今无法控制ALV-J的有效方法和防治ALV-J感染的药物和疫苗。对ALV-J 的防控，发达国家主要采取净化淘汰，1997 1998年，全球爆发ALV-J后，世界4大养禽公司先后投入巨额资金研究防制ALV-J策略，最终制定出一套严格的净化措施，逐步控制了 ALV-J的持续爆发；2002年后，ALV-J祖代种鸡群中已基本净化干净，但在商品肉鸡中还有零星的爆发，其每周发病率在1.5%左右。控制ALV-J是一个长期不懈的工作。在目前状况下，我国对ALV-J基本上没有行之有效的防控措施，政府没有补贴，也没有哪个公司能承担起高昂的净化费用。3、J亚群禽白血病的检测技术
目前，检测ALV-J常用方法为PCR和免疫检测。PCR方法对检测人员技术水平、设备有较高的要求，成本高，操作复杂，易出现假阳性和假阴性，不适合临床快速检测。ALV-J免疫检测以抗原一抗体特异性结合为基�。饕悦噶庖呶�(ELISA)和胶体金两种检测技术为研究热点，胶体金试纸卡具有方便、快捷、灵敏、经济实惠等特点。免疫层析胶体金技术是新型的诊断技术，已得到较为广泛的应用，基本原理为利用胶体金标记一种抗原或抗体，在试纸卡的硝酸纤维素膜上包被相应的配对抗体或抗原， 检测时，当样品中含有相应的特异性抗体或抗原时，胶体金标记颗�：脱分信涮逑嘟岷闲纬筛春衔铮缓笤谙跛嵯宋啬ど喜阄觯俦话坏目固寤蚩乖痘瘢禾褰鹂帕８患� 形成肉眼可见的检测线(T线)，通过检测线的有无来判断结果，同时在离检测线不远的后方设立另一可与金标物特异性结合的抗体或抗原作为质控线(C线)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术而提供了一种J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其以鸡血清为检测样品，可简便、快速地检测鸡群是否感染过ALV-J， 为鸡群特别是种鸡的ALV-J净化提供快捷工具，降低了净化成本，节约人力物力。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，包括有衬板，其上设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体；硝酸纤维素膜上有包被J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。按上述方案，所述的金标垫上附着有20 μ 1浓度为1. 5mg/ml的鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，其可与鸡血清中特异性抗ALV-J的抗体结合。可以满足试纸卡检测的灵敏度要求，同时也可满足与兔抗鼠多抗结合的要求。按上述方案，所述的金标垫的制备方法如下取胶体直径为20 士 5nm的胶体金溶液，用碳酸钠调整至PH8.0，加入鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，室温搅拌，BSA封闭，离心，弃沉淀；上清液离心，弃上清，将沉淀以与原体积相同的PBS溶解，如上重复离心2次， 所得沉淀物用40%原体积的PBS重悬，即得到金标抗体，将金标抗体均勻分散在玻璃纤维上，使其干燥备用。按上述方案，所述的检测线上的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白浓度为 0.2、.3 48/!111，体积为1(^1，所述的质控线的兔抗鼠IgG浓度为1.2 2. 2 yg/ml，体积为5 μ 1，满足试纸卡检测的灵敏度要求。按上述方案，所述的检测线包被方法如下取所述浓度0. 2^0. 3 μ g/ml的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白10μ1，在预定的检测线位置划线，干燥后即为检测线。按上述方案，所述的质控线包被方法如下取所述浓度为1. 2 2. 2 μ g/ml的兔抗鼠IgG 5μ 1，在预定的质控线位置划线，干燥后即为质控线。本发明还提供了上述鸡J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡的检测方法，其特征在于包括有以下步骤将试纸卡平放，取鸡血清100μ 1滴在样品垫上，根据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果，如果质控线、检测线均出现，判定为阳性；质控线出现，检测线不出现，判定为阴性；质控线、检测线均不出现或质控线不出现而检测线出现，均判定检测结果无效。本发明所述的禽白血病分A、B、C、D、E、F、G、H、I和J等10个亚群，其中A、B、C、
D、Ε、J亚群均可感染鸡，J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒(ALV-J)感染引起的一种肿瘤性传染�。淠夷さ鞍譯p85具有亚群特异性，感染过的鸡可产生亚群特异性抗体。 gp85蛋白上有多个抗原决定簇，可被鸡血清中的相应抗体IgG的Fab片段捕获。本发明设计了针对鸡IgG Fc片段的单克隆抗体及兔抗鼠IgG的多克隆抗体，用胶体金标记抗鸡IgG Fc片段的单克隆抗体，捕获鸡血清中的IgG，若样品阳性，则会形成肉眼可见的检测线(T线)，越过检测线的金标鼠抗鸡IgG Fc片段的的单克隆抗体与兔抗鼠IgG 的多抗结合形成肉眼可见的质控线(C线)。本发明的优点在于本发明中J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡检测方法，可快速检测鸡血清中的J亚群禽白血病抗体，从而判断是否感染过J亚群禽白血病。具有反应快速、敏感性高、特异性强、操作简单、适合“栏圈边”检测、经济实惠等优点。
图1为本发明的结构示意其中，1 一吸水垫；2 —衬板；3 —硝酸纤维素膜；4 一金标垫；5 —样品垫；6 —质控线； 7一检测线；
图2为检测结果判定，其中，A:C、T均出现红色线判为阳性；B 仅C出现红色线而T没出现红色线判为阴性；C、D 只要C不出现红色线结果均判为无效检测。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。实施例1鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体的制备
收集规模化蛋鸡场开产前蛋鸡的高免血清采用辛酸一硫酸铵法进行纯化，按每1份血清加4份乙酸钠缓冲液浓度0. 06mol/L, pH值4. 0)；用浓度lmol/L NaOH调pH值到4. 5， 加入辛酸33μ1/πι1。边加边搅拌30min。再2 8°C，12000转/min离心lOmin，弃沉淀。 上清滤纸过滤后用NaOH调pH值至7. 4，然后缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度45%，继续搅拌 30min，2 8°C静置 2h。再 2 8°C，12000 转/min 离心 30min，弃上清。用 0. OlM tTris (pH9. 0)透析除盐，直至用BaCl2检测无白色沉淀为止，用PEG8000进行浓缩。利用GE公司AKAT purifier蛋白纯化系统以Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝胶过滤预装柱， 纯化粗提的鸡血清IgG。用0. 22um滤器过滤粗提的鸡血清IgG，并经过超声除气；Hiload 16/60 Superdex 200prep pg凝胶过滤预装柱与AKAT purifier蛋白纯化系统相连接，先用 ddH20清洗柱子，接着用含0. 15M NaCl的0. 05M磷酸盐缓冲液(PBS，pH8. 0)平衡柱子，流速为2ml/min，直至UM80的吸光值和电导值基线稳定，平衡柱子时要清洗各阀位。将过滤的鸡血清IgG样品用注射器(上样前注意排空注射器里的气泡，以免损害柱子)注入样品环中， 设置洗脱速度和报警压，进行上样和洗脱，流速为lmL/min。观察UV280值基线的变化，收集紫外吸收峰的洗脱峰，每管收集anl，SAS-PAGE电泳检测脱蛋白，合并收集液，装入透析袋，放入PEG8000中浓缩，用NanodroplOOO分光光度仪0D280和0D260吸光值，并根据公式计算IgG含量蛋白含量(mg/mL) =(1. 45X0D280 0. 74X0D260) X稀释倍数，测得鸡IgG 的蛋白含量为18. 6mg/mL，用于鼠抗鸡IgG单克隆抗体的制备。收集纯化后的抗体，纯化的鸡IgG与弗氏佐剂等量混合，充分乳化，以50g IOOg/ 只免疫BALB/c系小鼠3次，每次间隔15 30天，第3次加强免疫后3 4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75%酒精浸泡5 lOmin，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心lOmin，收集脾细胞；将1 X IO8的脾细胞与2 5 X IO7的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心lOmin，弃上清，在37°C的水浴中将0. 7 Iml的40% 50%PEG4000 (pH8. 5 9. 0)缓缓加入细胞，温育Imin后，缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG 的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min离心lOmin，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(IOOuL/孔)，置37°C 5%C02培养箱中培养。培养7 10天后，用 5g 10g/ml的鸡IgG包被96孔酶标板，以ELISA检测杂交瘤的培养上清，挑取强阳性细胞克隆(0D492=0. 8以上)，经连续3次的有限稀释法克隆化，建立杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞腹腔注射经降植烷致敏一周的Balb/c系小鼠，每只小鼠注射5 X IO5个细胞，诱生小鼠腹水，制备抗IgG Fc片段单克隆抗体。获得的5株杂交瘤细胞株染色体为92 98，其分泌的单克隆抗体特异识别鸡IgG Fc片段，与鸭、鹅、鸽、猪、牛等的IgG不反应，亲和力常数达 10_8，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgGl，IgG^i。实施例2 J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白的制备
用基因工程技术高效表达J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白。参考GENBANK 上已经发表的J亚群原型毒株HPRS-103的gp85基因序列，设计一对扩增gp85基因的引物，上游引物 Pl :5，-TCCGAATTCGGAGTTCATCTATTGCAACAA-3 ‘，下游引物 P2 :5 ‘-GTACTCGAGTTAGCGCCTGCTACGGTGG TG-3'。P1 和 P2 的 5'端分别引入EcoR I 和 Xho I 酶切位点。扩增长度为921bP，反应条件为95°C预变性5min后，按94°C 30s, 57°C 45s, 72°C Imin进行33个循环，最后72°C延伸lOmin，PCR产物连接到pMD_18T载体上，将连接产物转化到DH5a感受态中，涂布于含IOOg / mL氨卞青霉素(Amp)的LB平板，37°C培养16小时， 挑单菌落，碱裂解法抽提重组质粒，以PCR和双酶切鉴定阳性克�。⑿蛄胁舛ㄑ橹�。阳性克隆的酶切产物与pET-28a表达质粒链接，构建重组表达质粒pETj8a-gp85，并转化表达菌BL21，挑单菌落接入5mL含100g/mL卡那霉素(Kan)的LB培养基中，37°C、250r/min震荡培养10h，然后按1 100转接500mL LB (100g/mL Kan)的培养基，37°C、250r/min震荡培养汕，加入终止浓度为lmmol/ L IPTG诱导表达4h。4°C、4000r / min离心lOmin,收集诱导表达菌体。利用QIAGEN公司的his-镍亲和层析柱，在变性条件下采用PH梯度洗脱纯化J亚群禽白血病重组His-gp85蛋白，主要步骤如下将收集的菌体沉淀按8mL / g的比重重悬于缓冲液 B (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH8. 0)中，在室温下轻微振荡 45 60min (避免产生气泡)，400w超声波击打30次，1200rpm，4°C离心30min，取上清加入到含 2mLNi-NTA填料的经缓冲液B平衡的纯化柱中，封闭纯化柱，200r/min, 37°C振荡30min，使重组蛋白和Ni2 + -NTA固相充分结合后，让纯化柱垂直放置，待Ni-NTA填料沉积后，将纯化柱用 IOmL 缓冲液 C (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, 20mM imidazol PH6.3)洗脱 2 次后，再用 IOmL bufferD (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M urea, PH5. 9)洗脱 2 次，最后用 IOmL bufferE (IOOmM NaH2PO4, IOmM Tris. Cl, 8M uregi, PH4. 5)洗脱目的蛋白，收集洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，采用BCA法测定纯化His-gp85蛋白含量，计算表达量。结果显示， 含pETj8a-gp85重组质粒的表达菌成功表达分子量为38KD的J亚群禽白血病亚群特异性 gp85抗原蛋白，其表达量为4aiig/L，可用于检测线的制备。实施例3兔抗鼠IgG多克隆抗体的制备
采取高免小鼠血液，分离血清，以辛酸-硫酸铵法粗提小鼠血清IgG，并用Superdex200 凝胶层析进行纯化(同实施例1)，测得小鼠IgG的蛋白含量为13. lmg/mL，可用于兔抗小鼠 IgG多克隆抗体的制备。以50 100ug/kg体重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐剂充分乳化，经皮下和肌肉注射免疫健康新西兰大白兔3 4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1 2000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸铵法粗提免疫兔血清IgG，并用Superdex 200凝胶层析进行纯化，不重述。所制备的抗小鼠IgG多克隆抗体用于检测试纸卡的研制。实施例4金标垫的制备
取胶体直径为18nm的胶体金溶液100ml，用碳酸钠调整至pH8. 0，加入1. 8mg实施例1 中鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，室温搅拌20min，10%BSA封闭。将上述标记物3000r/min 离心20 min，弃沉淀，上清液12000 r/min离心30 min，弃上清，将沉淀以与原体积相同的 PBS(0. 01mol/L pH8. 2，含0. 1% BSA、0. 05%叠氮钠)溶解，如上重复离心2次。最后沉淀物用40%原体积的PBS重悬，以Iml溶液铺35cm2的比例，均勻铺在玻璃纤维上，使其干燥备用。实施例5硝酸纤维素膜的包被
将实施例2中的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白用PBS(0. 01M，pH7. 4)配制成0. 2^0. 3 μ g/m的浓度，取10 μ 1用喷膜机在预定的检测线位置划线；
取所述实施例3的兔抗鼠多克隆抗体，用PBS (0. 01Μ, ρΗ7. 4)配制成浓度为1. 2 2. 2 μ g/ml的溶液，取5μ 1溶液，用喷膜机在预定的质控线位置划线。实施例6检测试纸卡的组装
在干燥室内，室温20 - 25°C，湿度小于30%，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等按图1所示固定到衬板上。其中硝酸纤维素膜位于衬板中部，其包被有T线的一端与金标垫的1/5搭接，包被有C线的一端与吸水垫的1/5搭接，样品垫与金标垫的1/2搭接。最后切成宽度为3. 5cm的小条，然后装入测试卡。每10个一包，加入小袋干燥剂，抽真空封装。 4 8°C保存，有效期一年。实施例7快速检测试纸卡的稳定性检测设计温度37°C、4°C
设计时间:0天、7天、21天、28天、2月、4月、6月、8月、12月、18月
保存方法拭纸卡真空封装(在37°C、4°C同时各保存一盒) 检测指标敏感性
表1本发明试剂盒试纸卡稳定性检测结果
权利要求
1.J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，包括有衬板(2)，其上设置有样品垫(5)、金标垫(4)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(1)，其特征在于金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗鸡 IgG Fc片段单克隆抗体；硝酸纤维素膜上有包被J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白构成的检测线(7)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。
2.按权利要求1所述的亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其特征在于所述的金标垫上附着有20 μ 1浓度为1. 5mg/ml的鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，其可与鸡血清中特异性抗ALV-J的抗体结合。
3.按权利要求2所述的亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其特征在于所述的金标垫的制备方法如下取胶体直径为20 士 5nm的胶体金溶液，用碳酸钠调整至pH8.0，加入鼠抗鸡IgG Fc片段单克隆抗体，室温搅拌，BSA封闭，离心，弃沉淀；上清液离心，弃上清，将沉淀以与原体积相同的PBS溶解，如上重复离心2次，所得沉淀物用40%原体积的PBS重悬， 即得到金标抗体，将金标抗体均勻分散在玻璃纤维上，使其干燥备用。
4.按权利要求1或2或3所述的亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其特征在于所述的检测线上的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白浓度为0. 2、. 3μ g/ml，体积为 10μ 1,所述的质控线的兔抗鼠IgG浓度为1.2 2. 2 yg/ml，体积为5μ 1，满足试纸卡检测的灵敏度要求。
5.按权利要求4所述的亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其特征在于所述的检测线包被方法如下取所述浓度0. 2^0. 3 μ g/ml的J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白 10μ 1，在预定的检测线位置划线，干燥后即为检测线。
6.按权利要求4所述的亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，其特征在于所述的质控线包被方法如下取所述浓度为1. 2^2. 2 μ g/ml的兔抗鼠IgG 5 μ 1，在预定的质控线位置划线，干燥后即为质控线。
7.权利要求1-6任一项所述的鸡J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡的检测方法，其特征在于包括有以下步骤将试纸卡平放，取鸡血清100μ 1滴在样品垫上，根据检测线和质控线的显色状态，判断检测结果，如果质控线、检测线均出现，判定为阳性；质控线出现， 检测线不出现，判定为阴性；质控线、检测线均不出现或质控线不出现而检测线出现，均判定检测结果无效。
全文摘要
本发明涉及一种J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡，包括有衬板，其上设置有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫上包被有胶体金标记的鼠抗鸡IgGFc片段单克隆抗体；硝酸纤维素膜上有包被J亚群禽白血病亚群特异性gp85抗原蛋白构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。本发明的优点在于本发明中J亚群禽白血病抗体快速检测试纸卡检测方法，可快速检测鸡血清中的J亚群禽白血病抗体，从而判断是否感染过J亚群禽白血病。具有反应快速、敏感性高、特异性强、操作简单、适合“栏圈边”检测、经济实惠等优点。
文档编号G01N33/577GK102507946SQ20111035307
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者刘丽娜, 张蓉蓉, 杨峻, 温国元, 王红琳, 罗玲, 罗青平, 艾地云, 邵华斌 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
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