专利名称：用于汞离子检测的dna电化学生物传感器及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种电化学生物传感器，尤其是涉及一种用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器及其构建方法。
背景技术：
生物传感器是是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法。电化学生物传感器具有快速、简便、灵敏和价廉等优点，在环境监测、临床检验、食品和药物分析、生化分析等研究中有着广泛的应用前景。自从 Hg2+介导的胸腺嘧啶(T)错配被发现后，不断地涌现出各种基于DNA的检测方法，并逐渐成为监测Hg2+的主要方法。对于DNA电化学生物传感器的制备及在其汞离子检测中的应用进行研究，目的是为了进一步提高对重要生命物质DNA的认识和利用能力。过氧化氢含有三价铁离子，具有电化学活性，在电极表面会发生氧化还原反应，过氧化氢上的三价铁离子在电极表面被还原成二价铁离子，产生电化学信号。循环伏安法、差分脉冲伏安法是电化学分析中的常用方法。循环伏安法是改变电位以得到氧化还原电流方向的电化学分析方法，主要是以施加一循环电位的方式来进行，从一起始电位以固定速率施加到一终点电位，再以相同速率改变回起始电位，此为一个循环，并记录电流-电势曲线。当某物质具有电化学活性时，会出现氧化峰和还原峰，当从低电位往高电位扫描时，会使分析物产生一氧化电流的氧化峰，当从高电位往低电位扫描时，则产生一还原电流的还原峰。对于一个新的电化学体系，首选的研究方法往往就是循环伏安法，可称之为“电化学的谱图”，常用于电极反应的性质、机理和电极过程动力学参数的研究。差分脉冲伏安法是在一个线性变化的扫描电压上， 施加一等振幅的脉冲，所测定的是施加脉冲振幅前后的电流差Ai，记录的曲线只有氧化峰或还原峰，同样，当从低电位往高电位扫描时，会使分析物产生一氧化电流的氧化峰，当从高电位往低电位扫描时，则产生一还原电流的还原峰。差分脉冲伏安法灵敏度好、分辨率高，具有很好的检测能力，常被用来定量分析。中国专利CN101846648A公开一种石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器及其制备方法。该电化学生物传感器为三电极体系传感器，所述的三电极中的对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为表面包覆有I 4层石墨烯量子点的玻碳电极。该发明的石墨烯量子点修饰的电化学生物传感器能成功识别最低浓度为50nM的目标单链DNA 的电化学生物传感器，当有目标单链DNA时，取等量互补单链DNA与其形成双链DNA，其电化学信号与仅有互补单链DNA有明显差别，便能起到快速检测目标单链DNA的作用。而且该段单链DNA不需巯基或荧光基团修饰，应用方便。该发明所检测的单链DNA是一段任意序列的核酸，理论上，该发明适用于不能形成内部双链的任意单链核酸序列，因此，将其置换成跟疾病相关的特异序列基因，即可用于疾病相关的基因检测，应用前景广泛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便的、廉价的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器及其构建方法，可通过汞离子特异性地与探针DNA结合引起的电化学信号变化达到能够特异性地检测水溶液中的汞离子检测水溶液中汞离子的目的。所述用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器是利用DNA分子中的巯基和金盘电极的表面形成稳定的Au-S键，将DNA分子自组装到金盘电极的表面，然后利用汞离子与DNA 分子中的胸腺嘧啶(T)特异性结合，特异性检测水溶液中的汞离子。所述用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器设有金盘电极和信号剂，在金盘电极表面自组装单链DNA分子层，所述单链DNA分子层作为探针，每条探针序列均为5’ -(T) η-3’，η > 5,5’端修饰有巯基；所述信号剂为过氧化氢溶液。所述金盘电极的直径可为2mm。所述用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法包括以下步骤I)将金盘电极进行清洗，吹干；2)在离心管中加入巯基化DNA，将步骤I)吹干后的金盘电极插入离心管中孵育， 巯基修饰的DNA便可通过Au-S键固定在金电极表面；3)将固定DNA探针的金盘电极浸入巯基己醇中，室温下孵育后，得到排列整齐的 DNA探针，即用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器。在步骤I)中，所述金盘电极的直径可为2_，所述清洗可将金盘电极依次进行抛光、超声和电化学清洗，然后用纯水清洗；所述吹干可采用氮气吹干。在步骤2)中，所述巯基化DNA可采用200 μ L浓度为I 10 μ M的巯基化DNA ;所述孵育可放置4 °C冰箱孵育。在步骤3)中，所述巯基己醇可采用ImM巯基己醇；所述室温下孵育的时间可为 Ih0本发明构建的DNA电化学传感器有以下优势I)所构建的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器在不需进行电化学标记且检测时间和成本较少的条件下，获得了较高的灵敏性，检测下限达50nM。2)所构建的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器在多种其他金属离子与汞离子同时存在的条件下仍能特异性地检测汞离子，具有良好的选择性。3)所构建的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器在对海水等实际样品的检测中不受其中干扰物质的影响，对汞离子具有良好的回收率(104. 55% 105. 72% )。4)所构建的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器在不同时期(O天、2天和7 天)对汞离子均能保持较好的灵敏性，具有良好的重现性和较高的稳定性。
图I为本发明所述用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器检测汞离子的示意图。由图I可见，单链DNA通过巯基连接在电极上时呈无规卷曲状排列，经巯基己醇(MCH) 处理后得到排列整齐的单链DNA。若不存在汞离子或银离子，排列整齐的单链DNA能够有效地阻止水溶液中过氧化氢在电极表面发生电子转移；然而当水溶液中存在汞离子或银离子时，对应的传感器电极表面单链DNA转变成双链DNA，自组装形成的单分子层出现空隙，导致过氧化氢能够接触到电极表面而产生电化学信号。图2为T5/MCH修饰电极与5μΜ汞离子反应Ih前后的循环伏安图。结果显示当溶液中不存在汞离子时，循环伏安电流较弱，在-O. 4V电位上的电流仅为-O. 303μ�。� 而当溶液中存在5μ M的汞离子时，循环伏安电流增大了 13倍，在-O. 4V电位上的电流达到-3. 98 μ Α。表明汞离子的存在导致电极表面DNA结构改变，使过氧化氢能够接触到金电极表面产生电子转移。图2中横坐标为循环电位E vs(Ag/AgCl) (V)，纵坐标为循环电流 I ( μ A)，点线为T5/MCH修饰电极与5 μ M汞离子反应前，实线为T5/MCH修饰电极与5 μ M汞离子反应Ih后。图3为T5/MCH修饰电极在不同扫描电位范围内与2 μ M汞离子反应前后的循环伏安图。结果显示T5/MCH修饰电极在不同扫描电位范围内与2μΜ汞离子反应前电流信号很弱，与2 μ M萊离子反应后电流信号明显增强；图3中横坐标为循环电位E vs (Ag/AgCl) (V)，纵坐标为循环电流I ( μ A)。点线表示T5/MCH修饰电极在不同扫描电位范围内与2 μ M 汞离子反应前的循环伏安图；实线表示T5/MCH修饰电极在不同扫描电位范围内与2 μ M汞尚子反应Ih后的循环伏安图。图4为在不同电位上传感器与汞离子反应前后的电流变化值(I-IciVIci :1。为反应前的电流值，I为反应后的电流值。结果显示= (I-Itl)Acl值随着扫描电位的增加出现先增大后减�。璺段г贠. I -O. 4V时达到最高值，为7. 39±0. 13。图4中横坐标为循环电位E vs (Ag/AgCl) (V)，纵坐标为与汞离子反应前后的电流变化值(I-IJ/I。。图5为T5修饰电极和T5/MCH修饰电极与2 μ M汞离子反应不同时间后的电流变化值(I-IciVIci, I0和I分别为反应前和反应后-O. 4V电位上的电流值。结果显示τ5修饰电极随着反应时间的增加，电流变化不明显，即使反应SOmin后电流变化值(I-Itl)Atl也仅为 1.51±0. 15。修饰电极出现大幅增加，在反应80min后电流变化值为
6.71±0. 19。表明无MCH修饰的电极，排列紊乱的单链DNA探针不能有效地阻止过氧化氢的电子转移。因此构建以过氧化氢为氧化还原指示剂的DNA生物传感器必需用MCH处理。 图5中横坐标为电极与2μ M汞离子反应的时间t(min)，纵坐标为反应前后的电流变化值 (I-I0)/I0^曲线a*T5修饰电极与2μΜ汞离子反应不同时间后的电流变化值(I-IW曲线b为T5/MCH修饰电极与2 μ M汞离子反应不同时间后的电流变化值(I-g/%。图6ST5/MCH修饰电极与不同浓度汞离子反应Ih后的循环伏安图。结果显示随着汞离子浓度的增加，循环伏安电流逐渐增大。这是由于汞离子的浓度越大，金电极表面形成的双链DNA越多，在DNA单分子层间出现更多的空隙，导致更多的过氧化氢能够接触金电极表面发生电子转移而产生电化学信号。图6中横坐标为循环电位E vs (Ag/AgCl) (V),纵坐标为循环电流I ( μ A)，图中曲线由上至下依次表示T5/MCH修饰电极与汞离子浓度为0， O. 05,0. 2,0. 5，1，2 和 3μΜ。图7为汞离子的标准曲线图，显示汞离子浓度在O I μΜ的范围内具有很好的线性关系y = -I. 2814x-0. 3197 (R2 = O. 9984)，且检测极限达到20nM。图7中横坐标为汞离子浓度C ( μ M)，纵坐标为循环电流I ( μ Α)。图8为T5/MCH修饰电极与不同离子反应后于-O. 4V电位上电流值的对比图。结果显示，其它各种金属离子如 Na+，K+，Li+，Ca2+，Mg2+，Co2+，Cd2+，Ni2+，Ba2+，Cu2+ 和 Mn2+ 等所产生的循环伏安电流值都很微弱，而汞离子即使在含有其它金属离子的条件下均能产生强的电流。表明汞离子能够与两个T碱基特异地结合形成T-Hg2+-T复合物，而其它金属离子均无此特性，因此此种DNA电化学生物传感器具有较好的选择性。图8中左起第一个柱子代表5 μ M Hg2+，第二个柱子代表5 μ M Hg2+与其它所有离子(各ImM)的混合液。图9为T5/MCH修饰电极在O天、2天和7天与O. I μ M汞离子反应前后的还原峰电流变化值(I-Ic1)Ac1=Ic1为反应前的电流值，I为反应后的电流值。结果显示，相对标准偏差 (RSDs) < 6%，表明此种传感器具有较好的重现性。通过SPSS软件分别对O天与2天、O天与7天两组进行T检验分析，显示P值均大于O. 5，表明本研究设计的DNA电化学生物传感器具有闻的稳定性。图10为所构建的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器结构组成，分别由直径为2_的金盘电极和自组装在金盘电极表面作为探针的单链DNA分子层，每条探针序列均为5’ _(Τ)η_3’，η彡5，5’端修饰有巯基。表I为自来水、湖水和海水三个实际样品中Hg2+的检测结果。在实际样品中检测 Hg2+具有较好的回收率(104. 55% 105. 72%)。表明实际样品中的干扰因素几乎可以忽略，证实了此种传感器能够用于实际样品中汞离子的检测。表I实际样品中汞离子的检测
样品a标准加入量测定值bRSD (%)c回收率(％)自来水0.10.10574.28105.72海水0.20.21145.91105.68湖水0.30.31363.11104.55a所有的水样品来自中国厦门，b平均值(n = 3)，c相对标准偏差(η = 3)。
具体实施例方式I)将直径为2_的金盘电极依次进行抛光、超声和电化学清洗，然后用纯水清洗， 氮气吹干。2)取2mL的离心管，加入200 μ L浓度为I 10 μ M的巯基化DNA，将处理好的金电极插入离心管中，放置4°C冰箱孵育，巯基修饰的DNA便可通过Au-S键固定在金电极表面。3)将固定DNA探针的金电极浸入ImM巯基己醇中，常温(25°C )下孵育lh，得到排列整齐的DNA探针如图I所示。4)将电极浸入 Tris-HCl 缓冲液，分别在 O. 2 -O. IV,O. I _0.2V、0. I -0.3V、
O.I -O. 4V、0. I -O. 5V和O. I -O. 6V的电位区间以O. lV/s的扫描速度进行扫描，获得电极与汞离子反应前的循环伏安曲线。之后将电极浸在含I 5 μ M的汞离子的TriS-HCl缓冲液中反应lh，之后取出，重新于Tris-HCl缓冲液中，在O. 2 -O. IV、
O.I -O. 2V、0. I -O. 3V、0. I -O. 4V、0. I -O. 5V 和 O. I -O. 6V 的电位区间以O. 1V/S的扫描速度进行扫描，获得电极与汞离子反应后的循环伏安曲线。分别取-O. IV、-O. 2V、-O. 3V、-O. 4V、-O. 5V 和-O. 6V 电位上的电流值作图(图 4)。5)将T5修饰电极和T5/MCH修饰电极浸在含I 5 μ M的汞离子的Tris-HCl缓冲液中反应不同时间(O 48min)，之后取出，于Tris-HCl缓冲液中，在-O. 4 O. IV的电位区间进行扫描，获得电极与汞离子反应不同时间后的电流变化值(Ι-Ιο)/Ι。=I0为反应前的电流值，I为反应后的电流值(如图5所示)。6)将电极分别浸在含不同浓度汞离子的Tris-HCl缓冲液中反应lh，之后取出，于 Tris-HCl缓冲液中，在-O. 4 O. IV的电位区间进行扫描，获得图6所示的电极与不同浓度汞离子反应Ih后的循环伏安曲线。图7为取-O. 4V电位对应的电流对汞离子浓度做标准曲线。7)将电极分别浸在含 1-5 μ M 萊离子和 I 5μΜ Na+, K., Li+, Ca2+, Mg2+, Co2+, Cd2+, Ni2+，Ba2+，Cu2+和Mn2+的Tris-HCl缓冲液以及同时含有这些金属离子与汞离子的Tris-HCl 缓冲液中反应lh，之后取出，于含I 5mM过氧化氢的Tris-HCl缓冲液中，在-O. 4 O. IV 的电位区间进行扫描，-O. 4V电位上的电流值作得图8所示的柱状图。11)各取5mL自来水、湖水与海水样品，向其中分别加入O. I μ M、0. 2 μ M和O. 3 μ M 汞离子，之后将修饰后的电极分别浸入三种样品反应lh，取出于含I 5mM过氧化氢的 Tris-HCl缓冲液中，在-O. 5 OV的电位区间进行扫描，根据还原峰电流计算样品中汞离子含量，与实际加入量对比，计算RSD和回收率，所得结果列于表I中。12)将修饰好的电极分别在4°C下放置O天、2天和7天后浸入含I 5 μ M汞离子的Tris-HCl缓冲液，在-O. 4 O. IV的电位区间进行扫描，测其还原峰电流并计算电流变化值(I-Itl)/%，对O天、2天与7天作得图9所示的柱状图。通过SPSS软件分别对O天与 2天、O天与7天两组进行T检验分析。
权利要求
1.用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器，其特征在于设有金盘电极和信号剂，在金盘电极表面自组装单链DNA分子层，所述单链DNA分子层作为探针，每条探针序列均为 5’ _(Τ)η_3’，η > 5，5’端修饰有巯基；所述信号剂为过氧化氢溶液。
2.如权利要求I所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器，其特征在于所述金盘电极的直径为2mm。
3.如权利要求I所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于包括以下步骤1)将金盘电极进行清洗，吹干；2)在离心管中加入巯基化DNA，将步骤I)吹干后的金盘电极插入离心管中孵育，巯基修饰的DNA便可通过Au-S键固定在金电极表面；3)将固定DNA探针的金盘电极浸入巯基己醇中，室温下孵育后，得到排列整齐的DNA探针，即用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器。
4.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤I)中，所述清洗是将金盘电极依次进行抛光、超声和电化学清洗，然后用纯水清洗。
5.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤I)中，所述吹干是采用氮气吹干。
6.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤2)中，所述巯基化DNA是采用200 μ L浓度为I 10 μ M的巯基化DNA。
7.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤2)中，所述孵育是放置4°C冰箱孵育。
8.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述巯基己醇采用ImM巯基己醇。
9.如权利要求3所述的用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器的构建方法，其特征在于在步骤3)中，所述室温下孵育的时间为lh。
全文摘要
用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器及其构建方法，涉及一种电化学生物传感器。传感器设有金盘电极和信号剂，在金盘电极表面自组装单链DNA分子层，所述单链DNA分子层作为探针，每条探针序列均为5’-(T)n-3’，n≥5，5’端修饰有巯基；所述信号剂为过氧化氢溶液。将金盘电极进行清洗，吹干；在离心管中加入巯基化DNA，将吹干后的金盘电极插入离心管中孵育，巯基修饰的DNA便可通过Au-S键固定在金电极表面；将固定DNA探针的金盘电极浸入巯基己醇中，室温下孵育后，得到排列整齐的DNA探针，即用于汞离子检测的DNA电化学生物传感器。
文档编号G01N27/327GK102608179SQ20121006621
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月14日 优先权日2012年3月14日
发明者孙莉萍, 胡楠, 贾静, 赖友群 申请人:厦门大学
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