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专利名称：用于测定未加工和部分加工的a型神经毒素的系统的制作方法
用于测定未加工和部分加工的A型神经毒素的系统本发明涉及在神经毒素生产过程中用于质量控制和安全性的工具。特别地，其涉及用于测定在包含加工的和部分加工的和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和 /或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步骤在允许所述抗体与所述部分加工和未加工的BoNT/A结合的条件下，将所述溶液的样品与特异性结合部分加工和未加工的BoNT/A的捕获抗体接触，从而形成复合物，并确定形成的复合物的量，而复合物的量指示了所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量。此外，本发明考虑了用于实施所述方法的装置和试剂盒。肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)生产强力的神经毒素，分别是肉毒梭菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素特异性结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约150kDa 的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用 (切割)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N端轻链和约IOOkDa的C端重链，两链通过二硫键连接。神经毒素结构上和功能上由3个结构域组成，S卩，催化轻链、涵盖了易位结构域的重链的N端一半和含有单或多受体结合位点的重链的C端一半，参见Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188,39 ；Krieglstein 1991, Eur T Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒梭菌神经毒素是作为分子复合物合成的，所述复合物包含150kDa神经毒素蛋白和相关联的无毒复合蛋白。复合物大小随梭菌菌株而不同，而不同的神经毒素血清型范围从300kDa，至500kDa以上，至多达900kDa。这些复合物中的无毒复合物蛋白使神经毒素稳定，并保护其免受降解，参见Silberstein 2004,Pain Practice 4， S19-S260肉毒梭菌分泌命名为A至G的7种抗原性不同的神经毒素血清型。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关TeNT都是Si2+-内切蛋白酶，其通过切割SNARE蛋白阻断突触的胞外分泌，参见Couesnon，2006，Microbiology, 152，759。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中所见的弛缓性肌肉麻痹，参见Fischer 2007, PNAS 104,10447。不论其毒性效应，肉毒梭菌毒素复合物已在多种疾病中被用作治疗剂。肉毒梭菌毒素A血清型(BoNT/A)于1989年在美国被批准用于人用途，用于治疗斜视、睑痉挛和其他病症，因而具有特别重要的意义。它作为BoNT/A蛋白制备物是可商购的，例如商标名 BOTOX (Al lergan Inc)或商标名DYSP0RT (Ipsen Ltd)。不含复合蛋白质的改良的BoNT/A 制备物是可商购的，商标名为XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)。出于治疗应用，将制备物直接注射入待治疗的肌肉中。在生理PH下，毒素从蛋白质复合物中释放并且产生所需的药理学作用。肉毒梭菌毒素的效应只是暂时的，这是为何维持治疗效果需要重复施用肉毒梭菌毒素的原因。梭菌神经毒素弱化肌肉收缩并且是斜视、局限性肌张力障碍(包括颈肌张力障碍和良性自发性睑痉挛)的有效疗法。其还表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且对广泛的其他适应证有效，例如胃肠道病症、多汗症和美容皱纹校正，见Jost 2007, Drugs 67， 669。
在生产梭菌神经毒素的过程中，活性神经毒素多肽的定性和定量测定以及质量控制是特别重要的。目前可获得的神经毒素制备物除所需的活性(加工的或成熟的)神经毒素以外，还包含不同量的未蛋白水解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。未蛋白水解加工的前体或部分加工的神经毒素多肽仅在少数氨基酸上不同于成熟的(活性的、加工的)神经毒素多肽。因此，难以基于它们的化学和物理性质定量地区分它们。另一方面， 总蛋白质含量中的未蛋白水解加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽的部分在此类制备物中可能仍然是显著的，即，与制备物的比活相关。用于测定制备物中的总神经毒素含量的测定是本领域普遍已知的。这些测定基于免疫 PCR 或夹心 ELISA(Lindstrom 2006，Clin Microbiol. Rev. 19(2) :298-314 ；Volland 2008，J Immunnol Methods 330(1-2) =120-129) 然而，如前所述，通过应用这些测定总神经毒素含量的技术不能够测定不需要的部分加工的或未加工的神经毒素的含量。因此，仍未有但非常需要用于测定制备物中的部分加工的或未加工的神经毒素分子(特别是BoNT/A分子)的含量的手段和方法。因而，本发明涉及用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步骤i)在允许所述抗体与所述部分加工和未加工的BoNT/A结合的条件下，将所述溶液的样品与特异性结合部分加工和未加工的BoNT/A的捕获抗体接触，从而形成复合物，和ii)测定步骤i)中形成的复合物的量，而复合物的量表示所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量，其中通过以下方法可获得捕获抗体，所述方法包括a)在允许形成捕获复合物的条件下，将来自由包含如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列(TKSLDKGYNKA)的肽免疫原免疫过的动物的多克隆抗血清与下列捕获肽SLD、LDK和 YNK接触，其中所述捕获复合物包含多克隆抗血清包含的非特异性抗体和捕获肽；b)从多克隆抗血清中移除捕获复合物；C)在允许形成包含上述肽和特异性地结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽的抗体的复合物的条件下，将多克隆抗血清与包含基本由SEQ ID NO 1组成的肽接触；d)从抗血清中移除步骤C)中形成的复合物；和e)从所述复合物中释放与未加工的或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的抗体。本发明的方法可以完全或至少部分地受自动化辅助。此类自动化可包括机器人装置，以及已实现了用于测定所述溶液中所述部分加工的和/或未加工的BoNT/A的量的合适算法的计算机系统。此外，本发明的方法可包括在步骤i)和ii)之前、之后或之间执行的额外步骤。此类额外步骤一方面可包括样品预处理步骤，洗涤或纯化步骤，以及数据挖掘步骤。一方面，所述额外步骤包括在下文所附的实施例中说明的那些步骤。术语“部分加工的和未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A) ”在本文中使用时指尚未成熟(即尚未从单链前体加工成成熟双链(dichain)多肽，或者仅部分加工的)的神经毒素A血清型多肽。BoNT/A是肉毒梭菌神经毒素的七种血清型中的一种。它作为单链前体分子生产，所述分子在翻译后被蛋白水解加工。单链分子包含N端轻链、接头肽和C端重链。在单链分子的蛋白水解加工过程中，切除了接头肽，从而生成包含重链和轻链但缺少接头肽的成熟双链分子。因此，接头肽的侧面是两个蛋白酶切割位点。因此，在蛋白水解激活的过程中，将出现部分加工的分子。这些部分加工的分子仅在侧翼蛋白酶切割位点中的一个处被切割从而使得接头肽仍然连接在轻链或重链上。出于本发明的目的，此类分子被称为部分加工的BoNT/A多肽。作为合适的加工的结果，获得了 “加工的BoNT/A”。所述加工的BoNT/A多肽表现出神经毒素的生物学性质特征，即，(a)结合受体，(b)内化，(c)跨内涵体膜进入细胞溶胶的轻链易位，和/或(d)对突触小泡膜融合中涉及的蛋白质的内切蛋白水解切割。因此，加工的BoNT/A多肽在本文中有时被称为活性的或成熟的神经毒素多肽。一方面，生物学活性是由所有上述生物学性质导致的。用于评估生物学活性的体内测定包括小鼠LD50测定和离体小鼠偏侧腸测定，如 Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol 128 :69-77 禾P Dressier 2005, Mov Disord 20 1617-1619所描述。生物学活性通常表达为小鼠单位(MU)。如本文中使用的，IMU是在腹膜内注射后杀死50%的指定小鼠群体的神经毒素组分的量，即小鼠 i. p. LD50。在一方面，BoNT/A是从肉毒梭菌的Hall菌株获得的，并且在另一方面，它具有如 Beecher 1997，J Protein Chem 16 :701-712 或 Krieglstein 1994，J Protein Chem 13 49-57中公开的结构(即，氨基酸序列)。此外，BoNT/A的氨基酸和编码核酸序列可见于 GenBank登录号ABD6M72. 1或GI :89258592下或分别在SEQ ID NO :2或3中显示。在接头肽侧面的蛋白酶切割位点一方面在氨基酸K438/T439和K448/A449之间。因而，接头肽基本由氨基酸1^439至氨基酸K448组成。然而，本发明的方法还涵盖了上述BoNT/A的变体。所述变体一方面是相比如SEQ ID N0:2所示的BoNT/A的氨基酸序列或由SEQ ID NO :3编码的氨基酸序列具有包含至少一个氨基酸添加、替换和/或缺失的氨基酸序列的神经毒素多肽。另一方面，变体神经毒素包含与SEQ ID NO 2所示BoNT/A的氨基酸序列或由SEQ ID NO 3编码的氨基酸序列至少40%相同的氨基酸序列。上述氨基酸序列显示未加工的BoNT/A多肽的氨基酸序列。通过本文别处给出的切割位点和接头肽的信息，能够从上述序列推导相应的部分加工的或加工的神经毒素多肽的序列。在本发明的另一方面，变体BoNT/A多肽具有与SEQ ID NO 2 所示氨基酸序列或由SEQ ID NO :3的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少40%、至少50%、 至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列相同的氨基酸序列。如本发明所用相同指氨基酸序列的序列同一性，其中比对序列从而获得最高的顺序匹配。这能够通过使用公开的技术或计算机程序编码的方法来实现，例如 BLASTP、BLASTN、FASTA、Altschul 1990，J Mol Biol 215，403。在一方面，百分比同一性的值是对整个氨基酸序列计算的。技术人员可获得基于多种算法的系列程序用于比较不同的序列。在本上下文中，Needleman和Wunsch，或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。为了进行序列比对，使用程序PileUp(1987，J Mol Evolution 25， 351 ；Higgins 1989CABI0S 5，151)或程序 Gap 和 BestFit (Needleman 1970，J Mol Biol 48 ；443 ；Smith 1981, Adv Appl Math 2，482)，所述程序是GCG 软件包(Genetics Computer Group 1991，575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)的部分。在本发明的一个方面，以下列设置使用程序GAP对整个序列区测定上文以百分比(％ )所述的序列同一性值:Gap Weight :50, Length Weight :3, Average Match :10. 000 禾口 Average Mismatch 0. 000，除非另外说明，否则所述设置应该一直用作序列比对的标准设置。将理解上述变体在本发明一方面将保留BoNT/A的至少一个生物学性质，而在另一方面应保留BoNT/A的所有生物学性质。另一方面，可以想到部分加工的和未加工的变体 BoNT/A多肽能够被本发明方法中应用的抗体特异性结合。一方面，这能够通过接头肽中包含SEQ ID NO 1的肽序列的存在实现。在其他方面，BoNT/A的变体能够是具有改良的或改变的生物学性质的神经毒素， 例如它们可包含就酶识别改良的切割位点，或者可就受体结合或任何其他上述性质改良。一般而言，可预计可以修改本发明的方法，因为基础的概念依赖于在神经毒素多肽的轻链和重链之间存在至少一个切割位点，而切割位点的性质和它们之间的特定氨基酸序列是无关紧要的，只要用于方法中的抗体能够特异性识别部分加工的或未加工的神经毒素多肽。因此，另一方面应用变体神经毒素，其中蛋白酶识别位点和/或在重链和轻链之间的接头肽已被替换。将理解该方面待应用的抗体将仍特异性地结合接头肽或其表位。还在另一方面，通过例如核酸重组技术，能够向其他的神经毒素血清型的接头肽中引入包含SEQ ID NO :1的BoNT/A的接头肽，并且通过应用本发明的方法能够测定样品中所述其他神经毒素血清型的未加工的和部分加工的多肽的量。如本发明的方法所用，术语“量”涵盖了多肽的绝对量、所述多肽的相对量或浓度， 以及与其相关或能够源自它的任何值或参数。如本文所用术语“溶液”指含有成熟BoNT/A多肽和部分加工的和/或未加工的 BoNT/A多肽前体的任何溶剂系统。溶剂系统进一步包含溶剂。在本发明多种方面所涵盖的溶剂是水、含水缓冲系统、有机溶剂和离子液。在本发明一个方面，其是含水溶剂系统。此外，除成熟的BoNT/A多肽和部分加工的或未加工的前体多肽和溶剂以外，溶剂系统也可包含其他分子，所述分子包括其他细菌多肽。在一方面，用于本发明方法的溶液将是细菌细胞培养物或从此类细菌细胞培养物获得的部分纯化的或纯化的制备物。如本文所用术语“样品”指将通过本发明的方法研究的所述溶液的部分。将理解样品还将包含BoNT/A和部分加工的和/或未加工的BoNT/A前体。在本发明方法的一方面， 所述样品具有预先确定的体积和/或预先确定的总蛋白质含量。在其他方面，样品可包含由外源供应的分子标准。根据本发明方法使用的将溶液样品与捕获抗体接触指将样品包含的前述未加工的和/或部分加工的BoNT/A多肽与捕获抗体物理相邻使得允许物理和/或化学的相互作用。原则上允许特异性相互作用的合适条件是技术人员普遍已知的。所述条件依赖于用于本发明方法中的抗体和溶液，并能够由技术人员在不费周折地调整。此外，技术人员还能够不费周折地确定足以允许相互作用的时间。将理解所述时间依赖于执行方法时的外源因素，例如温度、溶剂组成、PH值等。此外，应理解在本发明方法所述的接触的单个步骤之间， 可实施洗涤步骤以获得适合接触的条件。例如，在步骤i)中形成复合物后，在向所述复合物应用检测剂之前，应移除剩余的溶液。在本发明方法的一方面，在步骤i)过程中存在洗涤剂。因而，可以想象先于步骤 i)或在其过程中将向样品添加洗涤剂。合适的洗涤剂包括离子型和非离子型洗涤剂。在一方面，洗涤剂是非离子型洗涤剂，而在另外的方面中，是Tween 20。
在本发明方法的一方面，所述洗涤剂存在的浓度是在0. 01% (ν/ν)至10% (ν/ν) 的范围内。在另一方面，所述浓度是在0.2% (ν/ν)至0.8% (ν/ν)的范围内或在0.3% (ν/ ν)至0.6% (ν/ν)的范围内，仍在另一个方面，浓度是0.5% (ν/ν) 0在本发明方法的另一方面，所述步骤i)中的条件包括磷酸缓冲的或tris缓冲的盐溶液的存在。在一方面，所述盐溶液包含浓度在150至350mM范围内的NaCl。还在另一方面，所述浓度是在200至300mM的范围内，而仍在另一方面，浓度是250mM。如本文所用术语“测定量”涉及以定量或半定量的方式测量绝对量，相对量或浓度。测量将基于步骤i)中形成的复合物的化学的、物理的或生物学的性质进行。可直接或间接地测定所述复合物的所述量。在一方面，可以应用与形成的复合物相互作用的检测剂。检测剂将包含或生成与所检测的复合物的量相关的可检测的标记，并因而允许测定其量。在一方面，所述检测剂结合复合物中存在的捕获抗体或未加工的或部分加工的BoNT/ A。因此，在其他方面，检测剂将是当存在于步骤i)中形成的复合物中时，结合捕获抗体或部分加工的或未加工的BoNT/A或二者的抗体、结合肽(例如，BoNT/A受体或其部分)、适配体或小分子化合物。在一方面，检测剂包含可检测的标记。在一方面，可检测的标记具有荧光或化学发光性质，并因而允许检测剂的直接检测。典型的荧光标记包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德州红(Texas Red)、荧光黄和Alexa染料(例如，Alexa568)。仍在另一方面， 标记可以是放射性标记。典型的放射性标记包括35S、125I、32P、33P等。还在另一方面，检测剂可以包含能够生成可检测信号的酶活性，例如通过底物转化。一般地，此类酶可以是过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶)、萤火虫萤光素酶或碱性磷酸酶。上述类型的标记能够与检测剂直接偶联(共价或非共价地)。除所述直接标记外，在本发明方法的另一方面，可以间接地标记检测剂。所述间接标记涉及活性剂的结合(共价或非共价地)，所述活性剂特异性地结合检测剂并携带可检测的标记。此类活性剂可以是例如特异性结合检测剂的二级(高阶)抗体。在此类情况下二级抗体将被偶联于可检测的标记。将理解还能够额外使用其他更高阶的抗体用于检测检测复合物。更高阶的抗体通常用于增加信号。合适的更高阶的抗体还可以包括可商购的标记系统，例如链霉亲和素-生物素系统(Vector Laboratories, Inc.) ,Dako LSAB 2和LSAB +系统(标记的链霉亲和素-生物素)，或DakoPAP系统(过氧化物酶抗过氧化物酶)。将理解由检测剂包含或生成的可检测标记的量与复合物的量直接相关。复合物的量又与待测定的分子种类的量相关，即与样品中存在的未加工的和/或部分加工的神经毒素分子相关。此外，将理解样品是溶液的代表性部分。因而，对样品所测定的未加工的和/ 或部分加工的BoNT/A多肽的量表示存在于溶液中的量。在一方面，测定未加工的和部分加工的神经毒素多肽的量也需要通过应用具有预先确定的量的所述多肽的标准溶液校正方法。如何进行此类校正是本领域技术人员普遍已知的。在一方面，通过应用本发明的方法对在未加工的和/或部分加工的神经毒素的预先确定的量中不同的两个或更多个前述标准溶液的样品进行若干次测定。因而，在本发明方法的一方面，所述步骤ii)包括与参照比较复合物的测定的量。 在一方面，参照是源自如上所述的两个或更多个标准溶液的校正曲线。作为比较的结果，能够针对未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的预先确定的量分配测定的复合物的量。
能够从表达蛋白酶切割位点中被突变的BoNT/A多肽前体的肉毒梭菌突变体获得未加工的BoNT/A多肽。通过本领域普遍已知的标准分子生物学技术能够生成此类突变体。 此外，通过在大肠杆菌或缺少能够通过蛋白水解切割激活BoNT/A的蛋白酶的其他细菌中重组地表达所述BoNT/A能够获得未加工的BoNT/A。在另一个方面，能够突变肉毒梭菌的细菌细胞或其他表达系统以筛选具有显著降低的或者甚至无蛋白酶活性的突变体，并因而仅生产未加工的神经毒素。本发明的方法需要特异性结合部分加工的和未加工的BoNT/A多肽的捕获抗体。 在一方面通过包括上述步骤a)至e)的上述方法此类抗体是可获得的。在下文中进一步解释本上下文中使用的术语。如本文所用术语“抗体”涵盖了单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人、人源化、灵长动物源化(primatized)，或嵌合的抗体、双特异性抗体、合成抗体、化学或酶修饰的衍生物、任何所述抗体的片段或由天然存在的和/或化学修饰的核酸组成的适配体。所述抗体的片段包括F (ab' )2、F(ab)、Fv或scFv片段，或任何这类片段的化学或酶修饰的衍生物。 本发明的抗体将特异性结合由前述肽组成的表位，如果所述肽包含于部分加工的或未加工的神经毒素多肽。术语“特异性结合”意指本发明的抗体不以显著的程度与一般所述部分加工的或者所述未加工的神经毒素多肽上，或者其他多肽上的其他表位交叉反应。在本发明的一个方面，本发明的抗体不与所述活性的、完全加工的神经毒素多肽交叉反应。表位特异性是本发明抗体的重要特征。一方面，关于部分加工的或未加工的神经毒素相对于加工的神经毒素的抗体特异性将是至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %。通过多种普遍已知的技术(包括例如竞争研究或SDS PAGE的Western印迹分析)能够测试特异性结合。 另一重要的特征是抗体的灵敏性。在本发明的一个方面，灵敏性将使得样品所包含的加工的神经毒素的至少70%、至少80%、至少90%、至少95%被结合。通过普遍已知的技术能够测试灵敏性。通过使用常规实验，本领域技术人员能够确定对于每次测定的可操作的和优化的测定条件。用于结合研究的常规技术包括放射免疫测定、ELISA、平衡透析、等温微量量热法、BIACORE 测定(表面等离振子共振，SPR)或其他表面吸收方法。原则上通过使用存在于传感器表面上的固定化的抗原(配体)的结合研究可测定本发明抗体的结合特性(例如灵敏性)。将在移动相(即溶液)中提供待测试的抗体(分析物)。在一些情况下，抗原通过结合另一种称为捕获分子的固定化的分子而间接地附着在表面上。当以不连续的脉冲将抗体注射到具有固定化的抗原的表面时，基本能够分为3个阶段(i)在样品注射期间抗体与抗原的结合；(ii)在样品注射期间的平衡或稳定态，其中抗体结合的速率由自抗体-抗原复合物的解离平衡；(iii)在缓冲液流动期间抗体从表面解离。将理解备选地能够用固定的待研究抗体和含有抗原的溶液作为流动相来实施此类测定。结合和解离阶段提供了分析物-配体相互作用的动力学的信息(ka和kd，复合物形成和解离的速率，kd/ka = KD)。平衡相提供分析物-配体相互作用的亲和力的信息(Kd)。本发明的抗体在本发明的一个方面具有小于0. 5 μ M的KD，在一个方面，具有小于0. 05 μ M的KD，而在另一个方面， 具有小于0. 02μΜ的KD。在一方面，本发明方法中待使用的抗体允许以高灵敏性和特异性检测部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽，在一方面具有< 1000pg/mL、< 300pg/mL、< 100pg/mL的检测限度，在一方面具有50至80pg/mL的检测限度，还在另一方面具有69pg/mL的检测限度。 在其他方面，检测限度甚至可为< 30pg/mL、< 10pg/mL、< 3pg/mL，并且在一方面检测限度为约或< lpg/mL。能够通过使用以下方法生产本发明涉及的抗体，所述方法描述在例如Harlow和 Lane,"Antibodies,A Laboratory Manual，，,CSH Press,Cold Spring Harbor, 1988 中。单克隆抗体能够按Kiihler 1975，Nature 256，495 和 Galfr61981，Meth Enzymol 73，3 中初始描述的技术来制备。所述技术包括将小鼠的骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物的脾细胞融合。能够通过本领域普遍已知的技术进一步改良抗体。例如，用于BIACORE 系统中的表面等离振子共振可用于增加与蛋白水解未加工的神经毒素多肽内的上述表位结合 ^vMMWiKW^^, Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7,97 ；Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183,7。如上使用的术语“肽免疫原”指以允许在非人动物中引发免疫应答的方式提供的具有如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的寡肽。在一方面，通过本领域已知的任何接头或连接方法偶联所述具有SEQID NO :1的肽与载体蛋白。在另一个方面，所述免疫原还包含KLH。在其他方面，通过接头N_[ Y-马来酰亚氨基丁酉先氧基]琥拍酉先亚胺酉旨(N-[gamma-maleimidobutyryloxy] succinimide ester, GMBS)，所述KLH与具有SEQ ID NO :1的肽相连。还在其他方面，通过半胱氨酸，并且一方面通过C端半胱氨酸，所述KLH与具有SEQ ID NO 1的肽通过接头GMBS连接。如何通过接头分子例如GMBS连接KLH和肽是本领域普遍已知的或描述在下文所附实施例中。在另一个方面，能够使用卵清蛋白作为免疫原。所述卵清蛋白将通过接头磺酸基琥珀酰亚氨基-4 (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)与半胱氨酸残基交联，一方面，与C端的半胱氨酸残基交联。在此方面，可以想象使用C端添加了上述半胱氨酸的由SQ ID NO 1的氨基酸X至Y组成的五肽。在另一个方面，非人动物是哺乳动物，在一个方面，是大鼠、小鼠、兔、绵羊或山羊。 在进行本发明的方法之前，使用上述的肽免疫原免疫将作为多克隆抗血清来源的非人动物。如何免疫非人动物是本领域普遍已知的并描述在下文所附实施例中。所述免疫的结果是非人动物将生产针对肽免疫原的多克隆抗体。通过多种技术能够从非人动物获得多克隆抗血清。在一个方面，通过本领域普遍已知的和下文所附实施例所述的标准技术，从血液、血清或血浆中获得。术语“多克隆抗血清”因而包括来自所述动物的纯化的和部分纯化的血清。此类多克隆抗血清是上述方法的起始材料。除与未加工的和部分加工的BoNT/A多肽特异性结合的需要的一种或多种抗体外，多克隆抗血清可包含不与未加工的和部分加工的BoNT/A多肽特异性结合的其他抗体。在允许形成包含多克隆抗血清中包含的非特异性抗体和捕获肽的捕获复合物的条件下，通过将所述多克隆抗血清与捕获肽SLD、LDK和YNK接触，并从多克隆抗血清中移除捕获复合物，将这些不需要的、交叉反应的抗体与需要的特异性抗体分离，从而获得部分纯化的多克隆抗血清。一方面，上述捕获肽能够以在下文所附实施例中公开的它们的衍生物的形式应用于方法中。之后，将所述部分纯化的多克隆抗血清与也具有如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的肽接触。在一个方面，如本文别处详细所述地将所述肽固定在载体上。作为所述接触的结果，形成了肽和特异性抗体的复合物，所述复合物能够随后从剩余的多克隆血清中被移除。 然后能够从移除的复合物中释放特异性抗体。在本文的别处描述从此类复合物中释放抗体的合适技术。在一个方面，用于获得抗体的方法的步骤a)至e)是通过亲和层析的手段进行的。 本发明使用的亲和层析指基于分子对层析使用的固定相的不同的亲和力，用于分离移动相中的分子的技术。在一个方面，所述技术指从固定的配体上选择性吸收并随后回收化合物。 在另一个方面，所述技术被设计用于蛋白质和相关化合物的高度特异和有效的纯化，使用珠状和有孔基质上的恰当的选择性配体，用于结合随后能够在温和的条件下回收的靶化合物。所述技术基于高度特异性的相互作用，例如抗原和抗体之间、酶和底物之间，或者受体和配体之间的相互作用。在另一个方面，按柱层析实施所述亲和层析。在一个方面，上文详细表征的亲和层析是免疫吸附层析和、疏水相互作用层析(HIC)、逆相层析，并且在另一个方面，是应用结合活性剂的免疫亲和层析，所述结合活性剂在另一方面是本发明的抗体。在一个方面，本文涉及的固定相由上述活性剂作为固体基质组成。在一个方面，所述活性剂与偶联在固体基质上的多肽载体结合，并在另一个方面，与偶联在固体基质上的蛋白A结合。为了实施本发明的方法，能够把捕获抗体与固体支持物共价或非共价地偶联。此类固体支持物的材料是本领域普遍已知的，并且尤其包括可商购的多糖基质，所述多糖基质选自琼脂糖凝胶(s印harose)、交联葡聚糖凝胶(s印hadex)；琼脂糖、s印hacell、微晶纤维素(micro-cellulose)和藻酸珠(alginate-bead)、多肽基质、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、金属胶体颗粒、玻璃、塑料和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素带、膜、片、duracytes、反应托盘的孔和壁、塑料管。在本发明的一个方面，所述固体支持物由Y放射过的聚苯乙烯制成。根据所预计的用途，所述固体支持物可包括在分隔的瓶中，或是分隔的瓶的形式。备选地，固体支持物可包括在多孔板中，或是多孔板的形式。取决于固体支持物，在本发明的方法中应用固体支持物之前，可能必须进行封闭步骤，以封闭固体支持物上对肽和蛋白质的自由结合位点。本发明的方法有利地允许特异性的测定BoNT/A前体分子，即，未加工的，单链 BoNT/A和/或部分加工的BoNT/A。这些前体分子通常是应用于治疗或美容目的的BoNT/ A制备物中不需要的污染物。因而，其含量应该被降低到最小的量。本发明的方法允许为 BoNT/A制备物的生产建立起有效的质量控制和产品安全性管理。此外，当生产BoNT/A制备物时，能够监控纯化和/或加工步骤的效率。在本发明基础的研究中，在山羊中使用与KLH 偶联的接头肽作为免疫原(抗接头肽scBoNT/A血清)，产生针对未加工的肉毒梭菌A型神经毒素(BoNT/A)的多克隆血清。即使在亲和纯化后，在SDS PAGE的Wfestern印迹分析中血清表现出对加工的BoNT/A的交叉反应。经验证，交叉反应取决于对存在于接头肽，以及加工的BoNT/A的轻链和重链中的三肽(SLD、LDK和YNK)的识别。通过两步亲和层析纯化第二批山羊免疫血清，移除交叉反应的三肽抗体。第二抗接头肽scBoNT/A血清在Western 印迹中没有表现出针对加工的BoNT/A的交叉反应性。在一方面，包括上述一般步骤的本发明的方法还包括下列特定步骤1)将通过上述方法获得的捕获抗体固定在固体支持物(例如，多孔板)上；2)通过洗涤移除未固定的捕获抗体；
3)通过应用合适的封闭缓冲液(见下文实施例)，封闭固体支持物上的自由的肽 /蛋白质结合位点；4)通过洗涤移除封闭缓冲液；5)在允许形成捕获复合物的条件下，应用待分析的溶液的样品或用于校正的标准溶液的样品；6)通过洗涤移除未结合的样品材料；7)在允许形成检测复合物的条件下，应用检测剂(例如，第一和任选地，更高阶的检测抗体，所述抗体与酶(例如过氧化物酶)直接或间接地偶联)；8)通过洗涤移除未结合的检测剂；9)测定检测剂发出的检测信号(例如，通过对检测复合物应用生色底物并通过确定光密度测量底物转化)。然而，将理解，也能够通过可源自上文的任何其他特定步骤实施本发明的方法。本发明还考虑了用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的装置，所述装置包含i)包含如上所述的捕获抗体的分析单元，其中所述分析单元允许所述溶液的样品与所述捕获抗体接触，和ii)评估单元，其包含用于测定在分析单元中形成的复合物的量的读数系统和允许基于所测定的复合物的量计算所述溶液中部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的量的数据处理系统。如本文所用，术语“装置”指这样的系统，所述系统至少包含前述布置的彼此有效连接以允许测定的分析单元和评估单元。在一方面，所述布置可以是具有上述固定的捕获抗体的固体支持物，所述捕获抗体可以如上所述存在于固体支持物上(例如以瓶的形式)， 从而允许溶液的样品与捕获抗体接触。此外，在一方面，装置可包含用于测定检测复合物的量的读数系统。取决于待用的检测剂的种类，此类系统将包含生成的信号的检测器。此外， 在一方面，单元还能够包含用于处理从读数系统获得的数据的基于计算机的算法。所述算法将允许计算需要的多肽的量。在一方面，这通过比较测量信号与校正标准以测定溶液或其样品中存在的多肽的量来实现。此外，本发明涵盖了用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的包含如上所述的捕获抗体的试剂盒。如本文所用术语“试剂盒” 一方面指上述捕获抗体和检测剂和/或一种或多种本文中别处示出的校正标准的集合。试剂盒的所述组分可以包装或不包装在一起。试剂盒的组分可以包含在分隔的瓶中(即，作为试剂盒的分隔的部分)或在单个瓶中提供。此外，应理解，本发明的试剂盒是用于实践本文上文中提及的方法的。在一方面，可以想象所有的组分都以即用(ready-to-use)的方式提供，用于实践上文提及的方法。在其他方面，试剂盒含有进行所述方法的说明。说明能够以纸或电子形式的用户手册来提供。例如，手册可包括用于解释当使用本发明的试剂盒进行上述方法时获得的结果的说明。在本发明试剂盒的方面，所述试剂盒还包含至少一种用于测定包含捕获抗体和未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的复合物的量的检测剂。本说明书引用的所有参考文献都以其完整的公开内容和本说明书中具体提及的公开内容引入作为参考。
实施例实施例1 免疫原和抗体的牛成免疫原的生成1、接头肽-免疫原I 通过外部供应者生成具有序列NH2-TKSLDKGYNK-Cys-COOH的肽并然后通过接头GMBS与载体-蛋白质KLH偶联。2、接头肽-免疫原II :a)激活卵清蛋白将2. ISmg磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚氨基-4 (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)溶解在50 μ LDMSO中。之后，添加2.5ml 含有7. 5mg/ml卵清蛋白的卵清蛋白溶液(缓冲液5mM磷酸钠；0. 9% NaCl)，并在室温下旋转孵育溶液让。使用PDlO柱实施缓冲液改变，在3. 5ml含有IOmM磷酸钠；0. 9% NaCl的缓冲液中洗脱活化的卵清蛋白。b)将肽与卵清蛋白偶联JfSmg的肽Ac-DKGYN-Cys-COOH溶解在250 μ L H2O和2. 5 μ L 500mM TCEP · HCl (三羧乙基)膦盐酸盐)中，之后用ImM NaOH中和。最后，添加活化的卵清蛋白，并在室温下旋转孵育反应混合物4. 4h。通过添加 IOmM半胱氨酸溶液，旋转孵育lh，封闭剩余的反应基团。使用IOmM磷酸钠；0. 9% NaCl实施透析。免疫通过免疫获得抗血清。1)抗接头肽scBoNT/A-血清I 使用接头肽-免疫原I作为免疫原，所述接头肽-免疫原I通过接头GMBS与载体-蛋白KLH偶联。通过皮下注射接头肽-免疫原I免疫两只山羊，每只初始用溶解在弗氏佐剂中的300 μ g接头肽-免疫原I，并最后用在不完全弗氏佐剂中的100 μ g接头肽-免疫原I以2周的节律免疫4次。在49、63、77和84天后， 收集抗血清。使用第84天时最后一次放血所收集的血清来实施亲和层析。2)抗接头肽scBoNT/A-血清II 使用接头肽-免疫原II作为免疫原，所述接头肽-免疫原II通过接头SMCC与载体-蛋白卵清蛋白偶联。通过皮内注射接头肽-免疫原II免疫两只兔子，每只初始用在弗氏佐剂中的300 μ g接头肽-免疫原II，并最后用在 Montanide ISA 206中的150 μ g接头肽-免疫原II以2周的节律免疫5次。分别使用第 60或110天时放血所收集的血清来实施亲和层析。血清的两步亲和层析1、基质的生成对于两步亲和层析，生成含有不同肽的两种不同的超连接碘代乙
酰基质。一方面，交联反应肽SLD、LDK和YNK以下列肽的形式存在 Ac-ELDKYN-Cys-COOH (SEQ ID NO 4), NH2-NISLDL-Cys-COOH (SEQ ID NO 5)禾口 NH2-YYNKF-Cys-COOH(SEQ ID NO :6)，并使用下文给出的一般说明与基质偶联。另一方面， 以下列衍生物的形式Ac-TKSLDKGYNKA-Cys-C00H，使用下文给出的一般说明将接头肽(SEQ ID NO 1)与基质偶联。一般说明
偶联缓冲液50mM Tris、5mM EDTA-Na, pH 8. 5。制备体积等于所使用的 UltraLink Iodoacyl Gel 体积 20 倍的缓冲液。L-半胱氨酸HCl ；洗涤溶液ImM氯化钠(NaCl)。可顶部和底部加帽的空的重力流动式或旋转式柱子。制备肽或蛋白质样品用偶联缓冲液溶解肽。与UltraLink Iodoacyl Gel 偶联1、将底帽置于重力流动式柱上，加入需要量的UltraLink IodoacylGel浆，允许凝胶沉降15分钟。2、通过添加缓冲液至凝胶床的顶部允许通过柱排出，从装好的柱中排出液体并用 5倍凝胶床体积的偶联缓冲液洗涤/平衡UltraLink IodoacylGel 不要让凝胶床流干。3、放回底帽并添加已制备的含巯基的样品。每ml的UltraLink Iodoacyl Gel
可应用约Iml的样品溶液。4、放回顶帽并在RT混合柱15分钟。5、将柱竖直直立并在不混合的条件下RT孵育30分钟。6、依次移除柱顶和底的帽并允许溶液排出。7、用3倍凝胶床体积的偶联缓冲液洗涤柱子。封闭凝胶上的非特异性结合位点1、放回柱子的底帽。2、制备50mM L-半胱氨酸HCl的偶联缓冲液的溶液并按每毫升凝胶Iml将该溶液添加到柱子中。3、放回顶帽并在RT混合15分钟，然后在不混合的条件下RT孵育反应另外30分钟。2、两步亲和层析首先从血液中分离待纯化的血清。对含有交叉反应三肽的第一柱应用粗制血清。 交叉反应抗体结合三肽并因而从粗制血清中分离。对含有结合的接头肽的第二柱应用该第一柱的滤过物(flow-through)。接头肽特异性抗体结合接头肽并因而与可见于第二柱的第二滤过物中的粗制血清分离。通过用PBS缓冲液(0.5M NaCl)的高严格度洗涤，从柱中移除低亲和力的抗接头肽scBoNT/A抗体。随后，洗脱并浓缩结合的高亲和力的抗接头肽 scBoNT/A抗体。该浓缩物对应于所使用的抗接头肽scBoNT/A血清。实施例2 测试和验证抗体特异性试剂ELISA 包被缓冲液0.005M-1M Tris ；0. 9%NaCl，优选0. OIM-0. 2M Tris ；0. 9%NaCl,pH =8. 5。捕获抗体抗接头肽scBoNT/A血清。封闭和抗体稀释缓冲液在0. OlM磷酸钠中的0. 5% -5% BSA ；0. 9% NaCl, pH = 7. 4。样品缓冲液在0. 005M-1M 磷酸钠中的 0. 5 % -5 % BSA ；0. 1-0. 5MNaCl ； 0. 01% -1% Tween 20，优选在 0. 005-0. IM 磷酸钠中的 1 % -3 % BSA ；0. 15M-0. 4M NaCl ；0. 05% -0. 5% Tween 20，pH = 7. 4。洗涤缓冲液0.OlM 磷酸钠；0. 9% NaCl ；0. 05% Tween 20，pH = 7. 4。检测抗体抗BoNT/A的单克隆抗体。二级抗体缀合了过氧化物酶的多克隆抗小鼠IgG(H&L)抗体的抗体。底物TMB，可商购。2、试剂 Western 印迹变性样品缓冲液，可商购。SDS凝胶，可商购。MES电泳缓冲液(SDS PAGE)可商购。PVDF膜可商购。转移缓冲液(Western印迹)可商购。样品含双链-BoNT/A和scBoNT/A的肉毒梭菌神经毒素A。一级抗体抗接头肽scBoNT/A血清。二级抗体缀合了碱性磷酸酶的多克隆驴抗山羊抗体IgG(H&L)。封闭和抗体稀释缓冲液在0. 01M-0. IM Tris 中的 0. 5% ~5% BSA ；0. 9% NaCl, 0. 05% -5% Tween 20，pH = 7. 4。洗涤缓冲液0.01M-0. IM Tris ；0. 9% NaCl ；0. 05% ~5% Tween 20，pH = 7. 4。Tris 缓冲液0. 025M Tris, pH = 8. 0。底物BCIP/NBT，可商购。a)抗血清对于BoNT/B和BoNT/E的特异性为了测定抗血清对于BoNT/B和BoNT/ E的特异性，在ELISA中分析物质的回收率。以100μ 1/孔的含有0.5yg抗接头肽scBoNT/ A-血清/ml的包被缓冲液在室温孵育微量滴定板1 并随后用洗涤缓冲液洗涤3次。向微量滴定板中添加200 μ 1/孔的封闭溶液并在室温孵育lh。把抗原scBoNT/A (在样品缓冲液中系列稀释；pg/ml浓度)用作校正标准，用100 μ 1/孔的校正标准孵育微量滴定板。分别在样品缓冲液中稀释BoNT/B或ΒοΝΤ/Ε，并以100 μ 1/孔的体积用于微量滴定板。两种物质都过量使用，使用200ng/ml的稀释物。在37°C孵育样品和标准池。用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。添加100 μ 1的检测缓冲液/孔并在室温孵育lh。然后，用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。随后，用100 μ 1/孔的二级抗体在室温进行孵育lh。然后用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。通过添加100 μ 1底物/孔开始检测反应。在室温孵育30分钟后，通过添加50 μ 1 2Μ 孔终止反应并测定在450nm的吸光度。为了测定特异性，通过标准化计算BoNT/B 和BoNT/E的浓度。通过计算回收率，能够测定抗接头肽scBoNT/A对血清型B和E的特异性。回收率越低，交叉反应越低，且血清对于scBoNT/A的特异性越好。b)抗接头肽BoNT/A对于双链BoNT/A的特异性为了测定抗血清对于活化的双链 BoNT/A的特异性，通过Wfestern印迹实施免疫组织化学检测。在还原条件下通过SDS-PAGE 根据它们的分子量，将NT样品(scBoNT/A至少50ng，双链BoNT/A取决于所使用的样品)分离为scBoNT/A、LC和HC(双链BoNT/A)。然后将蛋白质印迹在PVDF膜上。用20ml封闭缓冲液在室温封闭膜达lh。移除封闭缓冲液并添加20ml含0. 005 μ g/ml抗接头肽scBoNT/ A血清的一级抗体溶液。在4°C孵育一级抗体过夜。移除含有抗体的溶液并用20ml洗涤缓冲液在37°C洗涤膜3次，30分钟。随后用20mL浓度为0. 4 μ g/ml的二级抗体在室温孵育膜3小时。移除二级抗体溶液并用20ml洗涤缓冲液在37°C洗涤膜3次，30分钟。此外，在室温用20ml的25mM Tris缓冲液洗涤膜1次5分钟。通过添加底物实施检测反应。孵育底物15分钟并通过添加水终止显色反应。通过染色在150kDa的scBoNT/A带测定特异性。当仅检测出150kDa的特异性带而没有在 IOOkDa(HC)和50kDa(LC)的双链BoNT/A的特异性带时,测定抗接头肽的特异性。使用上述ELISA条件测定不同电荷的scBoNT/A含量，并与通过SDSPAGE测定的含量比较。结果显示在下表中。表通过SDS PAGE 相对 ELISA 测定的 scBoNT/A
权利要求
1.用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，所述方法包括步骤i)在允许所述抗体与所述部分加工和未加工的BoNT/A结合的条件下，将所述溶液的样品与特异性结合部分加工和未加工的BoNT/A的捕获抗体接触，从而形成复合物，和 )测定步骤i)中形成的复合物的量，而复合物的量指示所述溶液中的部分加工和/ 或未加工的BoNT/A的量，其中通过以下方法可获得捕获抗体，所述方法包括a)在允许形成包含多克隆抗血清中包含的非特异性抗体和捕获肽的捕获复合物的条件下，将来自用包含如SEQ ID NO :1中所示氨基酸序列的肽免疫原免疫的动物的多克隆抗血清与下列捕获肽SLD、LDK和YNK接触；b)从多克隆抗血清中移除捕获复合物；c)在允许形成包含上述肽和特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽的抗体的复合物的条件下，将多克隆抗血清与包含SEQ ID NO 1的肽接触；d)从抗血清中移除步骤c)中形成的复合物；和e)从所述复合物中释放与未加工的或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫原还包含KLH。
3.权利要求2的方法，其中所述KLH通过接头Ν-[γ-马来酰亚氨基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)与具有SEQ ID NO 1的肽相连。
4.权利要求1至3的任一项的方法，其中步骤i)中的所述条件包括存在洗涤剂。
5.权利要求4的方法，其中所述洗涤剂是Tween20。
6.权利要求4或5的方法，其中所述洗涤剂以在0.01%(ν/ν)至10% (ν/ν)的范围内的浓度存在。
7.权利要求6的方法，其中所述浓度是在0.2%(ν/ν)至0.8% (ν/ν)的范围内或在 0. 3% (ν/ν)至 0.6% (ν/ν)的范围内。
8.权利要求1至7的任一项的方法，其中步骤i)中的所述条件包括存在磷酸缓冲的或 tris缓冲的盐溶液。
9.权利要求8的方法，其中所述溶液包含浓度在150至350mM范围内的NaCl。
10.权利要求9的方法，其中所述浓度在200至300mM范围内。
11.权利要求1至10的任一项的方法，其中所述步骤ii)包括比较参照与复合物的量， 从而能够针对未加工BoNT/A多肽的预先确定的量分配所测定的复合物的量。
12.用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的装置，所述装置包含i)包含如权利要求1至3的任一项所述捕获抗体的分析单元，其中所述分析单元允许所述溶液的样品与所述捕获抗体接触，和 )评估单元，其包含用于测定在分析单元中形成的复合物的量的读数系统和允许基于所测定的复合物的量计算所述溶液中部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的量的数据处理系统。
13.用于测定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A多肽的溶液中的部分加工的和/或未加工的神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的试剂盒，其包含如权利要求1至3的任一项所述的捕获抗体。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述试剂盒还包含至少一种用于测定包含捕获抗体和未加工和/或部分加工的BoNT/A多肽的复合物的量的检测剂。
全文摘要
本发明涉及在神经毒素生产过程中用于质量控制和安全性的工具。特别是涉及用于确定在包含加工的和部分加工和/或未加工的BoNT/A的溶液中的部分加工的和/或未加工的肉毒梭菌神经毒素A多肽(BoNT/A)的量的方法，包括步骤在允许所述抗体与所述部分加工和未加工的BoNT/A结合的条件下，将所述溶液的样品与特异性结合部分加工和未加工的BoNT/A的捕获抗体接触，从而形成复合物，并确定形成的复合物的量，而复合物的量指示所述溶液中的部分加工和/或未加工的BoNT/A的量。此外，本发明考虑了用于执行所述方法的装置和试剂盒。
文档编号G01N33/50GK102597769SQ201080047556
公开日2012年7月18日 申请日期2010年10月18日 优先权日2009年10月21日
发明者C·布林, H·V·泰勒, K-H·艾泽勒 申请人:莫茨制药有限及两合公司