一种amacr自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种amacr自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用的制作方法
技术领域：
一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用，本发明涉及体外免疫检测领域。
背景技术：
统计数据表明，美国男性每年有179， OOO人被诊断为前列腺癌，死亡率大约是25%。我国每年新增前列腺癌的病例为70， 000-80, 000人。晚期前列腺癌的死亡率很高，但如果发现得早，前列腺癌病人可以获得很高的五年生存率。因而，对前列腺癌的早期诊断十分重要。传统前列腺癌的诊断依靠病理学检査，需取活体组织，给病人带来痛苦和不便。PSA (前列腺特异性抗原)是仅发现于男性前列腺的一种蛋白酶。目前，血液中PSA浓度作为前列腺癌的重要指标。但是它的灵敏度和特异性都很低，不能作为大规模诊断普查之用。所以，新的肿瘤标志物的研究一直是肿瘤研究的重要领域。[参考文献马乐、吴小晶、冉 �。磺傲邢侔┲琢霰昙俏镅芯康睦�、现状和发展，中华检验医学杂志2001年 7月第24巻第四期]
AMACR ((x-甲基酰基辅酶A消旋酶)是最新研究发现的一种消旋酶，在前列腺癌组织中表达水平显著高于正常人，可以作为早期前列腺癌病变的诊断指标。AMACR的优点在于它是癌症特异性，只存在于癌症组织。AMACR亦可用作其他癌症，例如结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤和黑素瘤等等的诊断标志物。以结肠直肠癌和前列腺癌表达最高。但是AMACR在血液中的浓度太低，不适合单独作前列腺癌标记物。最新的临床研究表明，AMACR 引起血液中抗AMACR抗体的增加，前列腺癌病人血样中产生明显的抗AMACR 自身抗体。如检测血液中抗AMACR抗体，检出前列腺癌的灵敏度是77%，特异性是80M(pO.001)，远远强于PSA作为前列腺癌的检测指标。[参考文献Journal of the National Cancer Institute, Vol. 96, No. 11， June 2， 2004]

发明内容
本发明的目的在于通过间接ELISA法检测人体内AMACR自身抗体来提供一种高灵敏、可大规模检查前列腺癌的方法。
本发明所说的AMACR自身抗体的检测是通过如下技术方案来实现的一种a-甲基酰基辅酶A消旋酶AMACR自身抗体的检测方法 A、试剂的配制
(1) 0.05M、 pH9.6包被缓冲液1.59gNa2C03 、 2,93gNaHC03，加超纯
水定容至lOOOmL;
(2) 0.15M、 pH7.4磷酸盐缓冲液PBS: 8.0g NaCl、 0.2g KCl、 2.9g Na2HP04'12H20和0.2g KH2P04，调pH至7.4后加超纯水定容至lOOOmL;
(3) 0.15M, pH7.4磷酸盐-吐温缓冲液PBST: 8.0g NaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HP04'12H20、 0.2g KH2P04和0.5mL Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至lOOOmL;
(4) 封闭液1.0g明胶溶于100mL0.15M、 pH7.4磷酸盐缓冲液PBS中；
(5) 0.05M、 pH5.6底物缓冲液39.8gNa2HP04'12H20、 6.3g柠檬酸，加超纯水定容至lOOOmL;
(6) 显色液10mLpH5.6底物缓冲液、O.lmL 1%四甲基联苯胺(10mg四甲基联苯胺溶于lmL二甲基亚砜)和32^iL0.75XH202，混合均匀，现用现配；
(7) 终止液2MH2S04;
(8) 阳性对照血清取筛出的阳性血清OD45(^0.500，按每mL血清加1000 单位青霉素和IOOO单位链霉素，无菌过滤；
(9) 阴性对照血清取正常男性血清OD45()^).100，按每mL血清加lOOO 单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；
所述的试剂的配制可按照实际需要按比例来配制； B、 AMACR自身抗体ELISA检测方法
(1) 包被用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1 l(Vg/mL，在微孔反应板中每孔加入50pL, 37'C水浴中反应2h或4X:冰箱过夜，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(2) 封闭微孔反应板中每孔加入150nL封闭液，37"C反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(3) 加待测血清用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将待测血清稀释10 500倍后以每孔50pL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37°C 反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
所述的加待测血清过程中，空白对照、阴性对照、阳性对照分别为应加的稀释后的待测血清作如下替代空白对照为只加50pLPBST稀释液；阴性对照为加相同于待测血清稀释倍数的阴性对照血清5(HlL;阳性对照为加相同于待测血清稀释倍数的阳性对照血清5(^L;其余操作均与待测血清的操作相同；
(4) 加酶标二抗用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将商品化的HRP-鼠抗人IgG (辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG)稀释至工作浓度(可以根据购买HRP-鼠
抗人IgG时所附的说明书来稀释)，微孔反应板中每孔加50nL， 37i:反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(5) 显色微量反应板每孔加50pL的显色液，37。C显色反应10 15分钟；
(6) 终止反应并读数微量反应板每孔加2M的硫酸25ML终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B^2.1Bo定为阳性。
所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。本发明的有益效果-
1. 尽管肿瘤组织中AMACR表达很高，但病人的血液中的浓度却很低。本发明便是通过测定血液中AMACR自身抗体的浓度来预测肿瘤组织中AMACR 蛋白的表达。
2. 直接检测肿瘤组织中AMACR的表达需要从病人身上取活体标本，增加了病人的痛苦，不适用于健康检査。本发明的检测方式是无创检查，只要常规抽血即可。所以，可以用于大规模健康检査。
3. 本发明的灵敏度和特异性好于临床上常用的PSA检测。本发明的检测方式优点如下
1. 检测的是抗体，适合特定目的的特定需求；
2. 包被的AMACR抗原纯度高，从而特异性高；
3. 操作简单易行，可以标准化为产品；
4. 检测成本低廉，适于推广；
5. 通过酶标仪判读，减少主观性；
6. 可以进行大批量检测。
具体实施例方式
一、试剂的配制
(1) 包被缓冲液(0.05M， pH9.6): 1.59gNa2C03 、 2.93gNaHC03，加超纯水定容至lOOOmL;
(2) 磷酸盐缓冲液(PBS， 0.15M， pH7.4): 8.0g NaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HPCV12H20、 0.2g KH2P04，调pH至7.4后加超纯水定容至lOOOmL;
(3) 磷酸盐-吐温缓冲液(PBST， 0.15M, pH7.4): 8.0gNaCl、 0.2gKCl、 2.9g Na2HP04'12H20、 0.2g KH2P04、 0.5ml Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至lOOOmL;
(4) 封闭液l.Og明胶溶于100ml磷酸盐缓冲液(PBS， 0.15M, pH7.4)中；
(5) 底物缓冲液(0.05M， pH5.6): 39.8gNa2HP04'12H20、 6.3g柠檬酸，加超纯水定容至lOOOmL;
(6) 显色液10mL pH5.6底物缓冲液、O.lmL 1%四甲基联苯胺(10mg四甲基联苯胺溶于lmL二甲基亚砜)和32^iL0.75XH202，混合均匀，现用现配；(7) 终止液2MH2S04;
(8) 阳性对照血清取筛出的阳性血清(OD450^0.500)按1000单位/mL 加青霉素和链霉素，无菌过滤；
(9) 阴性对照血清取正常男性血清(OD45(^0.100)按1000单位/mL加青霉素和链霉素，无菌过滤；
二、 AMACR自生抗体ELISA检测方法
(1) 包被用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1 10|ug/mL，按5(Hil每孔加入微孔反应板中，37'C水浴中反应2h，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(2) 封闭每孔加入15(HiL封闭液，37'C反应1.5小时，倒净，以磷酸盐 -吐温缓冲液(PBST)洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(3) 加待测血清用磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)将待测血清稀释10 500 倍后以每孔50pL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照， 37。C反应l小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(4) 加酶标二抗用磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)将商品化的HRP-鼠抗人 IgG (辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG)稀释至工作浓度(可以根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附说明书来稀释)，微孔反应板每孔加50|iL， 37'C反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)洗涤5 7次并倒置、在吸水纸上拍干；
(5) 显色微量分析板每孔加50pL的显色液，37'C显色反应10 15分钟；
(6) 终止反应并读数加2M的硫酸，微量分析板每孔加25pL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B^2.1Bo定为阳性。
三、临床上检测方法的应用
按上述实施步骤进行临床检测，表明本发明与传统PSA的检测方法相比，具有更高的灵敏度和特异性。
取前列腺癌病人血样30例、正常男性血样45例。
利用本发明所述方法进行检测，得出真阳性23例、真阴性36例、假阳性9例、假阴性7例。
利用传统PSA的检测方法进行检测，得出真阳性13例、真阴性23例、假阳性22例、假阴性17例。
经灵敏度公式[真阳性数/ (真阳性数+假阴性数)]X100。/。和特异性公式:X100n/。可以得出利用本发明检测前列腺
癌灵敏度为76.7%，特异性为80%;利用PSA来检测前列腺癌灵敏度为43.3%, 特异性为51.1%。
权利要求
1、一种α-甲基酰基辅酶A消旋酶AMACR自身抗体的检测方法，其特征是A、试剂的配制(1)0.05M、pH9.6包被缓冲液1.59g Na2CO3、2.93g NaHCO3，加超纯水定容至1000mL；(2)0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；(3)0.15M，pH7.4磷酸盐-吐温缓冲液PBST8.0g NaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KH2PO4和0.5mL Tween-20，调pH至7.4后加超纯水定容至1000mL；(4)封闭液1.0g明胶溶于100mL 0.15M、pH7.4磷酸盐缓冲液PBS中；(5)0.05M、pH 5.6底物缓冲液39.8g Na2HPO4·12H2O、6.3g柠檬酸，加超纯水定容至1000mL；(6)显色液10mL pH5.6底物缓冲液、10mg四甲基联苯胺溶于1mL二甲基亚砜配制的1％四甲基联苯胺0.1mL和32μL 0.75％H2O2混合均匀，现用现配；(7)终止液2M H2SO4；(8)阳性对照血清取筛出的阳性血清OD450≥0.500，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；(9)阴性对照血清取正常男性血清OD450≤0.100，按每mL血清加1000单位青霉素和1000单位链霉素，无菌过滤；所述的试剂的配制按照实际需要按比例来配制；B、AMACR自身抗体ELISA检测方法(1)包被用包被缓冲液将特异性抗原AMACR稀释至0.1～10μg/mL，在微孔反应板中每孔加入50μL，37℃水浴中反应2h或4℃冰箱过夜，倒净，以洗涤缓冲液磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(2)封闭微孔反应板中每孔加入150μL封闭液，37℃反应1.5小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(3)加待测血清用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将待测血清稀释10～500倍后以每孔50μL加到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；所述的加待测血清过程中，空白对照、阴性对照、阳性对照分别为应加的稀释后的待测血清作如下替代空白对照为只加50μL PBST稀释液；阴性对照为加相同于待测血清稀释倍数的阴性对照血清50μL；阳性对照为加相同于待测血清稀释倍数的阳性对照血清50μL；其余操作均与待测血清的操作相同；(4)加酶标二抗用磷酸盐-吐温缓冲液PBST将商品化的HRP-鼠抗人IgG稀释至工作浓度，根据购买HRP-鼠抗人IgG时所附的说明书来稀释，微孔反应板中每孔加50μL，37℃反应1小时，倒净，以磷酸盐-吐温缓冲液PBST洗涤5～7次并倒置、在吸水纸上拍干；(5)显色微量反应板每孔加50μL的显色液，37℃显色反应10～15分钟；(6)终止反应并读数微量反应板每孔加2M的硫酸25μL终止显色反应，酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。
2、权利要求1所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，其特征是在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。
全文摘要
一种AMACR自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用，涉及体外免疫检测领域。本发明提供一种AMACR自身抗体ELISA检测方法，用特异性抗原AMACR包被微孔反应板，加待测血清到微孔反应板中，同时设空白对照、阴性对照、阳性对照；加酶标二抗，显色和终止反应并读数；酶标仪上450nm处读出吸光值，正常血清作为阴性对照吸光值Bo，待测样品吸光值B，当B≥2.1Bo定为阳性。所述AMACR自身抗体的检测方法的应用，在前列腺癌诊断中，检测人血液中AMACR自身抗体，作为诊断前列腺癌的标志物。本发明优点在于相对于目前国内市场上利用检测人血液中PSA的浓度来诊断前列腺癌的方法，在灵敏度和特异性上都有很大的提高。
文档编号G01N33/574GK101344525SQ20081012450
公开日2009年1月14日申请日期2008年8月22日优先权日2008年8月22日
发明者斌吴, 杨静华申请人:无锡纳生生物科技有限公司

亚星游戏官网-www.yaxin868.com

一种amacr自身抗体的检测方法及在前列腺癌诊断中的应用的制作方法