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专利名称：锰离子诊断/测定试剂盒及锰离子浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓 度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
锰作为一种微量元素在人体中是不可或缺的必需成分，同时也是对人体有毒 的物质。在自然状态下，以两价、三价和四价的形式存在，氧化程度越低，毒 性越高。通常锰有八种不同的氧化状态。锰的生物学意义是作为人体中辅助因
子有多种多样的功能。然而，在许多酶激活反应中，Mr^+和MgS+可互相替代。 常用石墨炉原子吸收分光光度测定法、原子发射ICP-OES。中子激发分析 (NAA)是最好的方法，但仅能在一些条件好的实验室才能测定。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶倍增法(Enzymatic Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光 度的变化，得以测定锰离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方 法的锰离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行锰离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。
本发明锰离子浓度测定方法原理如下
草酰乙酸草酰乙酸脱羧酶/Mr^丙酮酸+ 二氧化碳二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+
辅酶入+辅酶
丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)
苹果酸+辅酶
这种方法应用需要锰离子激化活性的草酰乙酸脱羧酶(oxaloacetate decarboxylase; EC 4,1,1.3)酶(偶)联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2丄51)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase (decarboxylating); EC 1丄1.38; EC 1丄1.39; EC 1.1.1.40; EC 1.1.1.83)酶促反应连续监测法/速率比色法。草 酰乙酸脱羧酶的激活程度与锰离子浓度成正比。锰离子激化活性下的草酰乙酸 脱羧酶酶解草酰乙酸反应产生丙酮酸及二氧化碳，再通过(偶)联合丙酮酸脱 氢酶、苹果酸脱氢酶的双重作用，最终二次将还原型辅酶(在340nm处有吸收 峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm 处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算锰离子 的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论 是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锰离子诊断/测定试剂盒较为理
想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
草酰乙酸脱羧酶 6000 U/L
丙酮酸脱氢酶 8000 U/L
苹果酸脱氢酶 10000 U/草酰乙酸 12mmol/L 乙酰辅酶A 6 mmol/L
本发明的锰离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果
酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A。 试剂盒可以是干粉状态,在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶。 还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、 乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在 使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱羧酶。 还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锰离子浓度的方法，其还原型辅酶 可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的锰离子诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 还原型辅酶 草酰乙酸脱羧酶 丙酮酸脱氢酶 苹果酸脱氢酶 10000 U/L
草酰乙酸 12mmol/L 乙酰辅酶A 6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，
加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂的体积
比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测
时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
500 mmol/L 0.25 mmol/L
6000 U/L
8000 U/L检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小 实施例二
本实施例的锰离子诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲院一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
还原型辅酶
草酰乙酸
乙酰辅酶A
50 mmol/L
0.25 mmol/L
12 mmol/L
6 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100 mmol/L
稳定剂
草酰乙酸脱羧酶 丙酮酸脱氢酶
500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰离子样品与试剂1、试
剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约l分
钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。
实施例三本实施例的锰离子诊断/测定试剂为三试剂，包括-
试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
草酰乙酸
乙酰辅酶A
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸脱氢酶 苹果酸脱氢酶
100mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L 6 mmol/L
100mmol/L
500 mmol/L
8000 U/L
画00U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂
草酰乙酸脱羧酶
500 mmol/L
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定锰离子浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO 分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测锰 离子样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应 (下降反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器
得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.002;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达5 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土3 %;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.12 ± 0.06AA/mmol /L;试剂在2—8。C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度 好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的锰离子浓度测定方法，其方法原理如下草酰乙酸草酰乙酸脱羧酶/Mn2+丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶丙酮酸脱氢酶丙酮酸+ 辅酶A+辅酶丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化) 苹果酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出锰离子的浓度大小测定结果。
2. —种锰离子诊断/测定试剂盒，主要成分包括-缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L还原型辅酶0.1—0.35 mmol/L草酰乙酸脱羧酶1000———80000 U/L丙酮酸脱氢酶1000———80000 U/L苹果酸脱氢酶1000———80000 U/L草酰乙酸l-50 mmol/L乙酰辅酶A1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸 脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸 脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、草 酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、草酰乙酸 脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、 还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙 酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、草酰乙酸脱 羧酶组成。还原型辅酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、 草酰乙酸、乙酰辅酶A在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述锰离子诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的锰离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锰离子浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、草酰乙酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出锰离子的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101620164SQ20081012423
公开日2010年1月6日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司