专利名称：Cd146及其抗体诊断和治疗三阴性乳腺癌的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫诊断和生物治疗领域。具体地说，本发明涉及CD146分子及其抗体在诊断和治疗乳腺癌的应用。更具体地，本发明涉及的CD146单克隆抗体AA4可以诊断三阴性乳腺癌，而CD146单克隆抗体AA98及其功能形式的功能在于抑制三阴性乳腺癌细胞间质细胞特征及恶性特征，从而抑制肿瘤转移侵袭。
背景技术：
乳腺癌是女性中最常见且致死率最高的恶性肿瘤。全球每年有将近130万女性患上乳腺癌，并且有超过40万女性因为乳腺癌的转移复发而死亡。乳腺癌中恶性程度最高的一种亚型，称为三阴性乳腺癌，以雌激素受体(ER)阴性/黄体激素受体(PR)阴性/表皮生长因子受体(HER2)阴性为特征。三阴性乳腺癌的发病率约占乳腺癌中的17% 25%，由于缺乏抗雌激素和抗HER2靶向治疗的靶标，以及极高的概率发生转移复发，是预后最差的一种乳腺癌类型。 目前，在临床上治疗三阴性乳腺癌主要是化疗药物，例如顺钼及蒽环类药物，主要发挥预防肿瘤转移的功能。这类药物没有靶向性，对全身正常的组织器官也将造成损害，具有很强的毒副作用。另外，尽管三阴性乳腺癌在化疗早期对化疗药物比较敏感，但是预后依旧很糟糕。因此，探索三阴性乳腺癌的发病机理，并从中发掘新靶标，是三阴性乳腺癌治疗的新方向。大量文献报道,上皮细胞向间质细胞转化的机制(epithelial to mesenchymaltransition, EMT)在三阴性乳腺癌的转移复发中发挥重要作用。EMT赋予肿瘤细胞侵袭转移能力，耐药性以及干细胞特征。从基因分型来说，三阴性乳腺癌属于基底样乳腺癌的类型，其肿瘤细胞更倾向于表达间质细胞的标记分子，被认为是一类已经发生EMT的乳腺癌类型，并通过EMT的机制发生远端迁移至脑部、肺部等重要脏器。由于三阴性乳腺癌细胞的间质细胞性质特征在一定程度上解释了肿瘤的恶性转移程度，抑制其间质细胞特征并发掘新的相关靶标分子将成为三阴性乳腺癌细胞治疗的潜在方向。由于很多重要的生长因子受体相关的酪氨酸激酶活化、TGF-β相关信号通路，以及整合素等细胞黏附分子相关的信号通路在诱导上皮来源的肿瘤细胞发生EMT的过程中发挥重要作用，以这些信号通路为靶标的抗体药物、小分子抑制剂以及拮抗剂被大量证明通过抑制EMT而达到治疗肿瘤转移侵袭的效果(Targeted therapies in control of EMT in carcinoma and fibrosis.Kian-Ngiap Chua,Jing Ma,Jean-Paul Thiery.DO1:10.1016/j.ddmec.2008.06.002)。例如，cystatin C，一种丝氨酸抑制剂，在乳腺癌细胞中被发现可以作为TGF-β受体的拮抗齐U，进而抑制TGF-β与其受体的结合及激活下游诱导EMT发生的信号通路。因此，cystatinC可以作为潜在的药物用于受TGF-β调节的乳腺癌治疗中。
发明内容
本发明首次提出⑶146是三阴性乳腺癌的新靶标，抗⑶146抗体是治疗这类疾病的新型靶向药物。与传统的化疗药物相比，抗CD146抗体的副作用�。换峁璉起全身范围的组织器官损伤。CD146及其抗体在三阴性乳腺癌诊断和治疗中的应用是基于以下重要的科学发现:(I)⑶146分子在三阴性乳腺癌病理组织中特异性高表达；(2)⑶146在上皮性质乳腺癌细胞MCF-7细胞中过表达之后，诱导细胞发生EMT，赋予细胞侵袭转移能力；(3)在原位乳腺癌老鼠模型(Orthotopic Breast Cancer Mouse Model)中⑶146分子的过表达促进乳腺肿瘤的形成，降低肿瘤的分化程度，以及促进肿瘤的原位侵袭及远端迁移；(4)在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中使用siRNA下调⑶146分子的表达或使用⑶146的功能性抗体AA98，可以抑制其间质细胞性质特征，降低细胞转移侵袭能力。综上所述，⑶146的过表达可以诱导上皮性质的肿瘤细胞发生EMT，这对三阴性乳腺癌的发生及进展具有重要作用。同时，CD146分子对维持三阴性乳腺癌的间质细胞特征及恶性程度有重要功能。我们自主研制的抗⑶146功能性抗体AA98可以在体外抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移及侵袭能力。因此，我们提出CD146可以作为三阴性乳腺癌的靶标分子，其功能性抗体AA98可以通过结合细胞膜表面的CD146分子，通过抑制其下游信号通路，从而阻断其诱导EMT的功能，或者抑制恶性肿瘤细胞的间质性质特征。同时，该种抗体的特异性较好，不会引起全身范围的免疫功能性的损伤。因此，本发明一方面涉及CD146在制备用于诊断和/或治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。本领域技术人员可以通过现有技术中公开的各种方法生产针对CD146或其信号通路的抑制剂(例如抗体、siRNA等)进而制备用于诊断和/或治疗三阴性乳腺癌的药物。在诊断乳腺癌时，本发明这一方面包括用于检测⑶146表达量的各种方法，例如可检测该分子在乳腺癌细胞中的RNA水平或蛋白质水平，进而辅助诊断三阴性乳腺癌。本发明再一方面涉及抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于诊断和/或治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。在本发明中，抗CD146的抗体或该抗体的功能形式可包括抗CD146的单克隆抗体、基因工程抗体和人源化抗体。此类抗体可根据本领域大量公开的文献容易地制备。在本发明中，抗CD146的抗体或该抗体的功能形式是抗CD146的抗体的功能耦合物，其中与抗体结合的物质可以是药物、毒素、放射活性剂、酶、细胞因子或另一种抗体。在本发明中，抗⑶146的抗体优选地是单克隆抗体AA98和AA4。本发明又一方面涉及⑶146或抗⑶146的抗体或该抗体的功能形式在制备诊断三阴性乳腺癌药物中的应用，其特征在于检测受试者肿瘤组织病理切片中CD146的水平。在本发明的这一方面，药物可制备成试剂盒的形式。本发明又一方面涉及抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于三阴性靶向性治疗的药物中的应用。优选地，所述抗CD146的抗体或该抗体的功能形式包括抗CD146的单克隆抗体、基因工程抗体和人源化抗体。更优选地，所述抗CD146的抗体是单克隆抗体AA98 和 AA4。本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AAl等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。为了更全面地理 解和应用本发明，提供下列实施例。
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:图1.A:临床标本:⑶146在三阴性乳腺癌病人肿瘤组织病理切片中特异性高表达；B:三阴性乳腺癌vs.非三阴性乳腺癌:88.9% vs.8.7%, p < 0.0001。图2.⑶146在MCF-7细胞中过表达，筛选出稳定克隆。其中Mock为对照，转入空载；B10和A5是CD 146表达株，BlO中等表达⑶146，A5为高表达⑶146。图3.CD146的过表达诱导细胞发生EMT。A_B，Mock、BlO和A5依次发生EMT相关的细胞形态及信号分子变化；C，Mock、BlO和A5细胞迁移能力依次增强；D，Mock、BlO和A5侵袭细胞数。图4.在体内水平，⑶146过表达导致增加乳腺癌肿瘤生成(A)，并减低肿瘤分化程度(B)，以及肿瘤的原位迁移(C)；图5.在体内水平，⑶146过表达促进乳腺癌远端迁移(A-D)；图6.在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中下调⑶146表达逆转其间质细胞特征。(A)Western Blot鉴定乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及Hs78T细胞EMT相关标记分子(B)CD146表达下调导致EMT相关标记分子的变化；(C)CD146表达下调导致细胞形态的逆转；(D-E) CD146表达下调导致细胞迁移及侵袭能力的下降；图7.抗⑶146功能性抗体AA98抑制三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的间质细胞特征(A-D)。图8.Sigma公司真核表达质粒p3XFLAG-HA-cmv_14图谱。
具体实施例方式
实施例一:⑶146在三阴性乳腺癌病人肿瘤组织病理切片中特异性高表达；细胞黏附分子在乳腺癌发生发挥过程中发挥重要作用。CD146分子是一个有关血管新生及肿瘤转移的重要细胞黏附分子。为了研究CD146在乳腺癌中的作用，我们对90例乳腺癌组织病理切片进行免疫组化分析，发现CD146分子在三阴性乳腺癌中特异性高表达。主要材料:乳腺癌病人肿瘤组织石蜡切片，包括44例三阴性乳腺癌及46例非三阴性乳腺癌组织，均来源于天津肿瘤医院；主要试剂:4%多聚甲醛，二甲苯，无水乙醇，无水甲醇，过氧化氢，PBS，小鼠抗CD 146单克隆抗体AA4 ;本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AAl等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。主要方法:石蜡切片制作:用4%多聚甲醛固定新鲜组织24小时后，石蜡包埋，以下为石蜡切片的免疫组化过程:I)取出片子，入二甲苯溶液37°C脱蜡两次，每次30分钟；2)入无水乙醇X 2-95% -80% -70% -50% -30%和蒸馏水中水化，室温每次5分钟；3) 0.3%过氧化氢/甲醇溶液37°C避光处理30分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗三次；4)pH6.0柠檬酸修复液100°C水浴30分钟抗原热修复，自然冷却；5) 5%的正常羊血清37°C封闭I小时；
6)加入PBS稀释的一抗(兔抗⑶146多抗或AA4)，4°C孵育过夜；7) PBS洗三次；山羊抗-兔-生物素或山羊-抗-小鼠-生物素二抗(购自中衫金桥)(1: 1000)在37°C孵育I小时，PBS洗三次；8)亲和素-HRP(1: 1000)在 37°C孵育 45 分钟；9)用现配的DAB避光显色2_7分钟，再进行苏木素复染。10)逐级脱水:50-70-80-90-100-100%乙醇-二甲苯，晾干，中性树脂封片。11)显微成像系统中拍片。结果显示，如图1所示，相比于非三阴性乳腺癌组织，⑶146分子在三阴性乳腺癌组织中特异性高表达。CD146表达在肿瘤细胞的细胞膜，并更倾向于表达在肿瘤迁移的边缘。实施例二:⑶146过表达诱导上皮性质乳腺癌细胞MCF-7发生EMT ；我们选择了⑶146阴性的细胞系MCF-7细胞(购自上海细胞库，目录号为TCHu74)作为了细胞模型，发现CD146在恶性的三阴性乳腺癌组织中高表达具有重要意义。MCF-7是一个上皮性质的乳腺癌肿瘤细胞系，恶性程度低，分化程度高，细胞迁移能力极弱。我们在MCF-7中过表达⑶146分子，构建获得了 2个稳定表达株，BlO和A5，其中BlO中等表达⑶146，A5为高表达⑶146。同时，我们也在MCF-7细胞中转入空载体，构建了对照稳定株Mock。具体过程如下详述。主要试剂:CD146 cDNA(SEQ ID NO:7)最初为法国慕尼黑大学Judith P.Johnson教授馈赠，目前在国内也 可以通过武汉三鹰生物技术有限公司购买获得(编号:BC056418，载体质粒为PCMV-SP0RT6)，所编码的蛋白质序列见SEQ ID NO:8。我们选择了真核表达质粒p3XFLAG-HA-cmv-14 (购买于Sigma公司，编号E4901)构建⑶146真核表达质粒，原始质粒图谱见图8。CD146 cDNA通过EcoRI与BamHI两个酶切位点插入p3XFLAF-HA-cmv_14，构建后所得的目的质粒由本实验室长期保存。其中从含有CD146 cDNA的载体质粒上PCR出5’及3’端分别带有EcoRI与BamHI的⑶146 cDNA片段运用的引物为:正向5’ -CGGAAT TCAATG GGG CTT CCC AGG CTG-3，(SEQ ID NO:1);反向 5，-GCG GATTCA TGC CTC AGATCG ATG TA-3’ (SEQ ID NO:2)。转染试剂为罗氏 Fugene HD。G418 试剂购买于 Sigma。Transwell技术使用的96孔板(8 μ m)购买于美国康宁(Coring)。本说明书中使用的抗体AA98、AA4、AA1等可根据中国专利申请号99107586.2、中国专利申请号200810057260.7的描述获得。抗E-cadherin抗体、抗cytokeratin抗体、抗Fibronectin抗体、抗GAPDH抗体购买于Abeam,抗Vimentin抗体购买于Sigma。胰酶购买于Gibco。Matrigel购于BDbiosciences 公司。主要方法:采用脂质体转染试剂转染真核细胞，并采用G418抗性筛选出单克�。僭擞肳estern Blot、流式细胞仪、Transwell技术等鉴定所得细胞的特性。(I)将MCF-7细胞种在2个35mm的细胞培养皿中，使第二天转染时细胞密度达到80%左右。(2)根据罗氏Fugen HD转染试剂的说明，分别对两个25mm培养皿中的MCF-7细胞转染p3XFlag质粒或p3XFlag-CD146质粒，48h后分别加入G418 (0.5 μ g/ml)进行筛�。�(3) I周后，等存活的细胞长满后，胰酶消化细胞后，用新鲜培养基稀释细胞密度至IXlO4个/ml，种于96孔板，对多克隆进行单克隆化。
(4)96孔板的细胞长满后，扩大到35mm培养皿进行培养，并采用流式分析的方法对⑶146的表达量进行检测，挑选不同表达量的⑶146克隆。(5)对挑选出的克隆继续在G418存在的情况下培养约2_3月，待克隆稳定后即可进行后续细胞形态观察、细胞迁移侵袭测试等实验。对于细胞迁徙实验，5X103个细胞种于Tranwell板中的上孔，培养在50 μ I无血清的MEM培养基中，下孔中为含200 μ I 10%血清的MEM培养基作为诱导，14-18h后，上孔中的培养基被吸干，覆盖于膜上的细胞被蘸了 70%的酒精的棉球棒擦干净，膜被揭下并倒扣在在玻片上。迁移过来的细胞用4%的PFA固定并结晶紫染色，显微镜拍照并计数。每个细胞需要设计3个平行对照孔。对于细胞侵袭实验，膜上需预先覆盖2.5mg/ml的Matrigel胶，IXlO4个细胞将用于该实验。接下步骤与上同。如图3所示，在MCF-7稳定克隆株Mock、BlO和A5这一系列中，我们观察到有关EMT的相关变化。首先，Mock细胞维持母本MCF-7细胞的典型的上皮性质细胞的形态，细胞成片生长，呈铺路石状，其紧密连接。然而，高表达⑶146分子的A5细胞形态发生极大变化，细胞分散生长成梭性。中等表达CD146分子的BlO细胞形态处于两种的中间状态。其次,Western Blot实验表明Mock细胞表达典型的上皮细胞的标记分子,例如E-cadherin和Cytokeratin。而A5细胞表达典型的间质细胞的标记分子,例如Vimentin和Fibronectin。(Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease, Jean PaulThiery, HerveAcloque, Ruby Y.J.Huang and M.Angela Niet0.Cell 139, November 25,2009) o 最重要的是，应用 Transwell 技术(Leukocyte transmigration through vascularendothelium.An in vitro method.Allavena P,Del Maschio A.Methods Mol Biol.1999 ；96:171-6)，我们能发现⑶146在A5细胞中的高表达显著地增强了细胞迁徙及侵袭能力。实施例三:在原位乳腺癌老鼠模型中⑶146过表达促进乳腺肿瘤的形成，降低肿瘤的分化程度，并促进肿瘤的原位侵袭及远端迁移；我们利 用SCID/Beige构建了原位移植的乳腺癌小鼠模型，发现在体内水平⑶146的高表达对乳腺癌的发生发展具有重要作用。实验方法:选择20只4周大小雌性的SCID/Beige (购于维通利华)小鼠，随机分为2组。分别在乳腺脂肪组织垫注射I X IO6个MCF-7细胞来源的克隆Mock或A5细胞重悬在50ul PBS,与50ul 2.5mg/ml的Matrigel混合。每周观察I次，测量长、宽及高，以便计算肿瘤体积。10周后，当有荷瘤鼠变得虚弱后，脱颈法处死所有小鼠，剥离肿瘤和重要脏器，4% PFA固定24小时后，石蜡包埋，切片并做免疫组化分析。结果如图4、图5所示，Mock细胞在SCID/Beige小鼠上成瘤性差，10只小鼠中只有3只成瘤，且肿瘤体积偏�。琢鲎橹峁雇暾砻鞣只潭雀撸颐挥蟹⑸磺窒霸抖饲ㄒ�。而形成鲜明对比的是，CD146高表达的A5细胞成瘤容易，10只小鼠中只有8只成瘤，且肿瘤体积普遍偏大，肿瘤组织结构混乱，表明分化程度低。更重要的是，A5形成的肿瘤显著地侵袭到邻近的正常组织，例如皮肤，乳腺，肋骨等，且转移到了肺部及肝脏。实施例四:在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231下调⑶146或抗⑶146功能性抗体AA98表达抑制其间质细胞特征。主要试剂:靶向CD 146 的 siRNA 序列:正向 5’ -CCAGCU CCG CGUCUA CAAAdTdT-3’ (SEQ ID NO:3)，反向 5’ -UUU GUA GAC GCGGAG CUG GdTdT-3’ (SEQ ID NO:4)；靶向 GFP 的 siRNA 序列:正向 5’ -CUU CAG CCU CAG CUU GCC GdTdT-3 (SEQ ID NO:5)，反向 5，-CGGCAA GCU GAC CCU GAA GdTdT-3J (SEQ ID NO:6).Lipofectin 2000 转染试剂购于 Invitrogen 公司。主要方法:(1)MDA-MB-231细胞分于2个35mm细胞培养皿中，以使第二天转染siRNA时密度达到70%左右。根据Lipofectin 2000的转染要求，分别对两个35mm培养皿的MDA-MB-231细胞转染siRNA-GFP或者siRNA_CD146，48h后使用RIPI裂解缓冲液裂解细胞，做总蛋白定量之后跑SDS-PAGE，并进行Western Blot进行相关分子的检测。确认⑶146在MDA-MB-231细胞中表达下调的效果后，进一步进行细胞形态变化观察、细胞侵袭迁移能力等测试。(2)MDA-MB-231细胞分于2个35mm细胞培养皿后，立即加入mlgG及AA98 (50mg/ml)进行刺激，48h后进行各种检测，与上同。我们进一步选择三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (购自ATCC，编号HTB-26 )为研究模型，使用祀向⑶146分子的siRNA (于Invitrogen合成)下调⑶146的表达或抗⑶146功能性抗体AA98，发现CD146对维持间质细胞特征的肿瘤细胞的恶性程度具有重要功能。结果如图6、图7所示，靶向⑶146分子的siRNA将MDA-MB-231细胞中⑶146蛋白水平下调到原来的三分之一。我们观察到梭性的细胞开始部分回圆。与此同时，间质细胞的标记分子vimentin及Fibronectin表达下调，上皮细胞的标记分子E-cadherin表达上调。更重要的是，细胞迁移及侵袭能力受到了抑制。同时，抗⑶146功能性抗体AA98也可以显著抑制MDA-MB-231细胞间质细胞标记分子Slug表达，上调上皮细胞标记分子E-cadherin的表达，并抑制细胞 迁移能力。
权利要求
1.CD 146或抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤是乳腺癌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的应用，其中所述抗CD146的抗体或该抗体的功能形式包括抗CD146的单克隆抗体、基因工程抗体和人源化抗体。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的应用，其中所述抗CD146的抗体或该抗体的功能形式是抗CD146的抗体的功能耦合物，其中与抗体结合的物质可以是药物、毒素、放射活性剂、酶、细胞因子或另一种抗体。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的应用，其中所述抗CD146的抗体是单克隆抗体AA4 或 AA98。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的应用，其中所述应用是在制备诊断三阴性乳腺癌的药物中的应用，其特征在于检测受试者肿瘤组织病理切片CD146的水平。
8.抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于抑制三阴性乳腺癌转移以及导向治疗的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述抗CD146的抗体或该抗体的功能形式包括抗CD 146的单克隆抗体、基因工程抗体和人源化抗体。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其中所述抗CD146的抗体是单克隆抗体AA4或AA98。
全文摘要
本发明涉及CD146及其抗体诊断和治疗三阴性乳腺癌的应用。本发明首次提出CD146是三阴性乳腺癌的新靶标，抗CD146抗体可能成为治疗这类疾病的新型靶向药物。因此，本发明提供CD146或抗CD146的抗体或该抗体的功能形式在制备用于诊断和/或治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。CD146分子在三阴性乳腺癌组织中特异性高表达，并诱导肿瘤细胞发生上皮细胞向间质细胞转化，促进肿瘤侵袭迁移。因此，CD146抗体治疗三阴性乳腺癌的作用机理主要是抑制三阴性乳腺癌细胞的间质细胞特征，降低其转移侵袭能力。与常规化疗药物相比，抗CD146抗体的副作用�。斜昝魅罚换嵋鹑矸段У母弊饔�。
文档编号G01N33/574GK103157109SQ201110412778
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者阎锡蕴, 曾启群, 吴真真, 卢迪, 段红霞, 罗永挺, 杨东玲, 冯静 申请人:中国科学院生物物理研究所
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