专利名称：根据PTHrP预测和诊断骨骼疾病的制作方法
技术领域：
本发明涉及预测、诊断和治疗疾病的方法和材料。尤其是，本发明涉及预测、诊断和治疗骨骼疾病的方法和材料。本发明还涉及筛选出对骨骼疾病的治疗，尤其是针对骨质疏松症具有治疗潜力的化合物的系统和方法。
背景技术：
骨骼疾病会发生在所有年龄的妇女，男人和儿童身上。从幼年到老年，骨骼疾病正严重影响着北美数百万人的生活质量。每年，仅在美国，骨骼疾病中的骨质疏松症、佩吉特氏病(Paget′s disease)、成骨不全和多骨髓瘤就折磨着3千万人，导致生活无法自理、残疾、病痛和死亡。在美国，每年与骨骼疾病相关的急性和长期护理的费用大约为200亿美元。随着人口老龄化，预计到2020年，这些费用会达到600到800亿美元。如果不进行干涉，包括诊断方法的改进，尤其是对前期发病预后性症状的检查和有力的预防治疗，慢性�。绻侵适杷芍⒔崾辜毙院统て诨だ矸延玫母旱Ｑ有较赂鍪兰停⑹刮颐强刂莆郎＝》延玫呐Ω吨�。
由于骨密度降低导致的骨质疏松症和相关的骨折在老龄个体中很常见，并且产生了与此类疾病相关的大量卫生保健费用和负担。尽管骨质疏松症有多种病因，但是80％的根本病因在于遗传。可是，目前没有商业化的检测手段能用来确定个体具有易患骨质疏松症的体质。通常，只有当疾病已经发展到了明显程度之后，患者才能被诊断出骨质疏松症。无法提供骨骼疾病和/或骨骼疾病诱因的早期检测，使得该类疾病的治疗费用不断攀升。
近来，申请人和其它研究者的实验研究提供了重要的证据，表明在骨骼的成骨细胞(造骨细胞)中表达的一种蛋白质，被称为甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)，对造骨细胞的适当恢复、增生、分化和功能发挥十分重要，这些过程对于保持合适的骨密度和防止骨质疏松症的发生非常关键(Horwitz等.JClin Endocrinol Meta.，February 2003，88(2)569-575)。
申请人获得的大量证据归纳如下发现PTHrP基因失活的小鼠纯合子(Karaplis等.，(1994)Genes Dev.8，277-289；Amizuka等，(1994)J.Cell Biol.126，1611-1623)具有软骨发育障碍骨骼异常以及改变的软骨内骨化，这在紧接着的围产期的死亡时候达到了顶点。另一方面，PTHrP基因失活的小鼠杂合体(在基因组中缺失一个拷贝PTHrP基因的基因敲除小鼠，而正常的小鼠有2个拷贝)出生时候的表型是正常的，但是发育到3个月的时候出现了与早期的骨质疏松症症状一致的特征(Amizuka等，(1996)Developmental Biol.175，166-176)。骨质疏松症的严重形式与骨骼中PTHrP表达的降低相关，特征是骨小梁(trabecular bone)的体积和连接性显著下降(各项异性程度降低和结构模型指数增加)，这些所观察到的现象是人骨质疏松症的显著特征。
同样地，已证明PTHrP的水平与骨质疏松症相关联。但是，还需要有改进的方法和系统对骨骼疾病的发病机理进行表征，以便对这类疾病的机理有深入的认识，并且开发出与此相关的灵敏诊断方法和治疗方法。此外，在疾病发生前还需要能有改进的方法来检测骨骼疾病和/或确定遗传性诱因的方法，以便能够对患病个体实施基因型特异性的个性化治疗和/或实施预防方案来改善个体的健康状况。
发明目的本发明的目的在于提供一种诊断个体骨骼疾病的方法。
本发明的进一步目的在于提供一种对个体的骨骼疾病的诱因和易感性进行表征的方法。
本发明的再一个目的是提供对一个经诊断个体的骨骼疾病和/或疾病诱因进行选择性治疗的方法。
本发明的又一个目的在于提供一种筛选用于治疗骨骼疾病的新疗法。
本发明的概述根据本发明的实施方式，骨骼疾病的指示子已得到表征。尤其是，骨骼疾病的遗传指示子已在PTHrP基因内得到表征。特别地，根据本发明一个优选的实施方式，骨质疏松症的遗传指示子已在PTHrP基因内得到了表征。此外，本发明的指示子为骨骼疾病的诱因，例如骨质疏松症的诱因的鉴定和/或治疗提供了一种新的诊断和治疗靶点。另外，根据本发明鉴定到的骨骼疾病的指示子为调节PTHrP基因的表达提供了一个新的靶点，而PTHrP基因的表达与为需要治疗的个体提供治疗和/或预防方案有关。根据本发明一个实施方式的记载，骨骼疾病的指示子出现在PTHrP基因内含子的数目可变的串联重复区域(VNTR)中。优选的，内含子位于PTHrP基因外显子VI和VII之间。本发明的PTHrP基因优选指代哺乳动物PTHrP基因。根据本发明的一个实施方式，PTHrP基因指鼠科的PTHrP基因。更优�。痉⒚鞯腜THrP基因是指人的PTHrP基因。
根据本发明一个实施方式，本发明的指示子是在PTHrP基因VNTR区域内的遗传片段。优选地，该遗传片段根据等位基因的长度被表征为骨骼疾病的指示子或有骨骼疾病诱因的指示子。更优选地，本发明的遗传指示子根据预先确定的PTHrP基因VNTR区域内的重复序列的数目而被表征。本发明的一个实施方式确定了骨骼的遗传指示子在PTHrP基因的VNTR区域内包含至少一个9-mer核苷酸序列。优选地，遗传指示子包含两个或两个以上9-mer核苷酸重复序列。
术语“遗传指示子”表示所研究的基因内的标记，用来为个体发生疾病的遗传诱因和/或发生疾病的可能性提供指示。优选的，本发明的遗传指示子是指PTHrP基因内的标记，用来为个体发生骨骼疾病的遗传诱因和/或可能性提供指示。
术语“等位基因”是指遗传片段的可选择形式或所感兴趣的基因区域，其根据本发明用来提供遗传指示子。优选地，本发明的等位基因的形式为PTHrP基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域。
术语“诊断”是指根据或至少部分根据疾病的遗传指示，鉴定哺乳动物的疾病状态或鉴定疾病发生的诱因或易感性。
术语“骨骼疾病状态”是指在患病个体疾病的严重程度。
术语“个体”是指哺乳动物。优选地，哺乳动物是小鼠。更优选地，哺乳动物是人。
根据本发明的一个技术方案，本发明提供了一种诊断个体的骨骼疾病和/或疾病诱因的方法，该方法包括(a)从所述的个体中获得生物样品，该样品适合用来检测所述个体的甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的基因；(b)在所述个体的PTHrP基因中筛选出骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；(c)根据步骤(b)中的结果诊断所述个体的骨骼疾病和/或骨骼疾病的诱因。本发明的生物样品优选包括所述个体的DNA，籍此样品能适于用来扩增和/或检测包含于其中的DNA。
本发明的一个或多个遗传指示子包括所述PTHrP基因内的一个区域。根据本发明的一个实施方式，本发明的一个或多个遗传指示子可包含所述PTHrP基因内的数目可变的串联重复(VNTR)区域。此外，本发明的一个或多个遗传指示子可包含所述PTHrP基因内的数目可变的串联重复(VNTR)区域，该区域根据等位基因的长度而被确定。根据本发明优选的实施方式，遗传指示子是具有预先确定长度的PTHrP基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域的片段，其中遗传指示子与骨骼疾病状态和/或对骨骼疾病的易感性相关。根据本发明的一个实施方式，骨骼疾病优选是骨质疏松症。
对本发明PTHrP基因中感兴趣的区域优选为VNTR区域。更优�。们蛟诤塑账嵝蛄兄邪靠杀涞拇馗雌�。此外，根据本发明的实施方式，遗传指示子优选为VNTR区域内的PTHrP基因片段，长度为252-460个碱基对。
根据本发明进一步优选的实施方式，遗传指示子包括PTHrP基因在VNTR区域内的片段，碱基对的长度为252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。本发明的基因指示子还可以包含PTHrP基因内的至少一个9-mer核苷酸序列的核苷酸重复片段。更优选地，本发明的9-mer核苷酸序列可进一步指代数目可变的串联重复片段(VNTR)，该重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
根据本发明的一个技术方案，该方案提供了一种诊断个体对骨骼疾病的易感性的方法，所述的个体具有PTHrP基因，该方法包括(a)获得生物样品，该样品适合用来从所述个体中筛选出骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；(b)从生物样品中筛选出所述个体PTHrP基因中对骨骼疾病具有易感性的一个或多个遗传指示子；和(c)根据步骤(b)中的结果诊断所述个体对骨骼疾病的易感性；其中，当检测到对骨骼疾病具有易感性的一个或多个遗传指示子时，所述的个体就被诊断为有患骨骼疾病的风险。
根据本发明的另一个技术方案，本发明对患有骨骼疾病或对骨骼疾病具有易感性的患者提供了一种治疗方法，所述的个体具有PTHrP基因，该方法包括(a)鉴定所述患者PTHrP基因在数目可变的串联重复(VNTR)区域内检测到的变化，(b)采用与所述患者的基因型谱相对应的疗法选择性地治疗患者；其中，根据所述基因的VNTR区域内所检测到的变化来鉴定基因型谱。
根据本发明进一步的技术方案，还提供了一个分离的核酸，它的核苷酸序列包含一个或多个重复的GTATATATA或ATATATATA，其中所述的核苷酸序列具有和PTHrP基因区域互补的片段。本发明分离的核酸可用作骨骼疾病遗传指示子的探针。或者，本发明分离到的核酸还可用作与针对骨骼疾病而提供的治疗和预防方法有关的治疗剂。
根据本发明的另一个技术方案，本发明提供了用来诊断个体的骨骼疾病和/或个体患骨骼疾病风险的商用试剂盒，该试剂盒包括(a)试剂，用来在所述个体的PTHrP基因中检测骨骼疾病和/或对骨骼疾病有易感性的至少一个遗传指示子；(b)说明书，用来确定所述的至少一个遗传指示子并联系骨骼疾病的诊断和/或预测。
在实施方式中，本发明的骨骼疾病是一种代谢作用的骨骼疾病。更优选的，本发明的骨骼疾病包括，但不限于骨质疏松症、骨软化病、骨硬化症、佩吉特氏病和肾性骨质营养不良。
在实施方式中，本发明遗传指示子的确定包括采用本领域公知的方法，例如PCR方法扩增PTHrP基因的VNTR区域。
本发明进一步包括使用遗传指示子来(a)诊断个体的骨骼疾�。�(b)确定个体是否有患骨骼疾病的诱因；或(c)同时进行(a)和(b)两种用途。
本发明进一步提供了治疗具有PTHrP基因的个体的方法，包括从个体中筛选出骨骼疾病的遗传指示子；根据对PTHrP基因中一个或多个遗传指示子的鉴定，来确定个体的基因型谱；以及，如果个体的基因型谱表明具有患骨骼疾病的风险，则对个体的骨骼疾病进行选择性治疗。本发明的实施方式中，对个体的选择性治疗包括开发对个体进行的基因型特异性治疗方法，以适合个体的基因型谱。本发明的基因型谱优选是PTHrP特异性的基因型谱。
根据本发明的另一个技术方案，提供了一种转基因的非人哺乳动物纯合子，该纯合子在造骨细胞中缺失了PTHrP基因，但在非造骨细胞中没有缺失PTHrP基因。优选地，本发明转基因的非人哺乳动物适合用来研究骨骼疾病的发展、治疗和预防。该转基因的非人哺乳动物可进一步用于筛选对骨骼疾病有治疗和预防作用的化合物和/或制剂上。
根据本发明的另一个技术方案，还提供了一个单链核酸，它的核苷酸序列包含一个或多个重复的GTATATATA或ATATATATA，其中所述的核苷酸序列具有和PTHrP基因区域互补的片段。
根据本发明的另一个技术方案，还提供了一个至少包含GTATATATA或ATATATATA的单链寡核苷酸，用来鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物。
根据本发明的另一个技术方案，还提供了一个包含两个或两个以上GTATATATA或ATATATATA序列的重复片段的单链寡核苷酸，用来鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物。
根据本发明的另一个技术方案，还提供了一个包含SEQ ID NO1或其互补序列的单链寡核苷酸，用来鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物。
根据本发明的另一个技术方案，还提供了一个分离的核酸，该核酸包含在严格条件下能与杂交探针杂交的序列，该杂交探针的核苷酸序列由SEQ IDNO1或其互补序列构成。
在实施方式中，非人哺乳动物的体细胞包括造骨细胞特异性的PTHrP破坏机制，例如下面将要提到的Cre-LoxP技术，它能在造骨细胞中特异性地损坏PTHrP基因或部分该基因，而不损坏非造骨细胞中的PTHrP基因。在实施方式中，这种机制包括(a)处于造骨细胞特异性启动子(例如，类型1的胶原质启动子)控制下的Cre重组酶基因；和(b)在PTHrP基因和其部分(例如外显子4)侧翼的loxP位点(PTHrP flox/flox)(He等.Endocrinology)。
进一步，本发明包括一个转基因的非人哺乳动物，遗传工程技术使之在造骨细胞中缺失了PTHrP，但没有在非造骨细胞中缺失PTHrP基因，因而该动物成为了杂合子。通过这种方式得到的动物与本发明公开的纯合体造骨细胞特异的基因敲除小鼠相似。本发明涉及的杂合体造骨细胞特异的基因敲除小鼠也为骨骼疾病的发展、治疗和预防提供了一个有用的研究模型。尤其是，杂合体造骨细胞特异的基因敲除小鼠更适于筛选对骨骼疾病的治疗和/或预防有效的化合物和/或试剂。例如，在杂合体造骨细胞特异的小鼠模型中，造骨细胞特异的化合物由于它们调节PTHrP基因表达的能力而被筛选出来。
将本说明书中引用的所有文献都列于此以作参考，就好像是专门和分别列出了每一个出版物、专利申请或授权的专利的全部内容以作参考一样。
下面结合附图进行的详述使本发明的进一步的特征和优点变得明显。附图中，图1对正常(左边样品)和杂合的PTHrP(+/-)小鼠(右边样品)进行微CT分析的结果，表明在突变的动物上骨小梁的下降程度。
图2在正�：驮雍系腜THrP(+/-)小鼠中所测得的骨体积对总体积的比值(BV/TV)。B.V.骨体积；Tb.N，骨小梁的数目；Tb.Th.，骨小梁的厚度。
图3在野生型和杂合PTHrP(+/-)小鼠中，对描述骨的3-D结构的特征小梁间隔(Tb.Sp.)、各向异性程度(DA)、总体积(TV)和结构模型指数(SMI)的分析结果。
图4通过钙黄绿素染色和随后的四环素染色(14天后)，分析野生型和杂合的PTHrP(+/-)小鼠的骨。两条线之间的距离(图形C和D)可用来计算骨生成的速率，在突变小鼠中该距离明显消失。
图5对分化为造骨细胞的分析。抽取野生型(左)和杂合PTHrP(+/-)(右)动物的骨髓，培养并诱导分化成造骨细胞(成骨细胞)，接着用能与钙化的基质结合的茜素红染色。
图6根据本发明的实施方式中造骨细胞的PTHrP特异性失活的小鼠的制备过程图示。
图7分析对照小鼠(PTHrPflox/floxPTHrP++)以及在造骨细胞中缺失了PTHrP的突变小鼠(PTHrP flo/flox/ostColl-)的骨骼。
图8通过染色凋亡细胞的核而分析对照小鼠(左图)以及在造骨细胞中缺失了PTHrP的突变小鼠(右图)的造骨细胞。
图9来自不同种的PTHrP基因的结构。
图10PTHrPVNTR区域的252bp等位基因。与用于PCR扩增的寡核苷酸引物相对应的区域已被划线。串联重复片段(G/A TATATATA)见黑体表示。
图11PTHrP等位基因在一般人群中广泛存在。图中显示，19个患骨质疏松症的雄性待测受试者中有16个(即，84％的受试者)具有252bp的等位基因。
优选实施方式的详细表述骨质疏松症和其它骨骼疾病是一种在老龄人群中具有高发病率和死亡率的常见疾病。对个体患骨骼疾病如骨质疏松症的可能风险进行早期预测的简单测试在目前是非常需要的，并且可根据本发明的实施方式而有效提供。如下面进一步讨论的，本发明表明，PTHrP基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域的长度用作骨骼疾病的新指示子。此外，本发明进行了一项研究，在四组具有正常骨矿物密度(BMD)和低骨矿物密度的患者中，检测骨矿物密度方面PTHrP基因的VNTR区域长度的可预测值，这四组患者为(1)骨质疏松症的男性患者，(2)患骨质疏松症的绝经前妇女，这两组患者骨质疏松症的病因都在于遗传，(3)健康男性，(4)没有骨质疏松症迹象的健康的绝经前妇女。现有的假说是，PTHrP基因的VNTR区域的各种等位基因在骨骼的微环境内引起PTHrP蛋白的各种表达。尤其是，如下文中进一步讨论的，PTHrP蛋白表达的下降会引起骨骼形成的下降，因而导致如前所述的骨矿物密度的降低。本发明通过对遗传指示子的鉴定来确定患骨骼疾病的个体基因型谱，从而在此基础上给出适于个体基因型的基因型特异性的治疗方案。
间歇性地在体内施用甲状旁腺素相关肽(PTHrP)对骨骼形成具有合成代谢的作用(Stewart等.J.Bone Miner Res151517，2000)。PTHrP的合成代谢作用在分子和细胞水平的确切基础目前还不清楚，试图采用PTHrP敲除的小鼠来研究该机理，但由于在本发明之前这些小鼠在围产期的死亡而使得这一努力白费。为了克服上述困难，在此使用了一个新系统，它能在造骨细胞中使PTHrP选择性失活。尤其是，使用Cre-介导的重组在小鼠造骨细胞中选择性破坏PTHrP表达。
根据本发明，已通过几种方式证实了这一点，包括传统的组织形态测定、骨密度测定(在患者中使用DEXA)以及更先进的技术，包括对骨进行特定的计算机化微X线断层显像(mCT)。文中所述的研究中所使用的转基因小鼠在造骨细胞中选择性除去PTHrP基因，但是在其它细胞中没有除去该基因。这些小鼠表现出早熟，以及严重的骨质疏松症。根据本发明可以推断出，在骨微环境尤其是造骨细胞中，PTHrP的表达水平对防止骨质疏松症非常关键。此外，本发明的转基因非人哺乳动物进一步为研究骨骼疾病提供了一个新系统，该骨骼疾病与实际的人疾病状态的表型非常一致。本发明的转基因非人哺乳动物还能作为研究候选的治疗方案效果，例如，化合物和/或试剂在治疗、预防和缓解骨骼疾病进程上的效果的新模型。根据本发明优选的实施方式，提供了一种用来评价和/研究候选疗法的系统，该疗法能在哺乳细胞中调节PTHrP的表达。在本发明中，造骨细胞缺失了PTHrP基因的造骨细胞特异性的PTHrP敲除小鼠可以是纯合体或杂合体。
在此，对患有骨骼疾病的人PTHrP的研究显示了人PTHrP基因的特异性区域(在此称为数目可变的串联重复(VNTR)区域)在调节PTHrP的表达方面有作用。根据本发明，PTHrP基因的VNTR区域被鉴定为骨骼疾病的一个新的标记物。尤其是，本发明骨骼疾病和/或对骨骼疾病具有易感性的遗传指示子可包含PTHrP基因或其部分基因的VNTR区域。
当提到存在VNTRs时，在本研究之前，并没有任何与该序列相关的作用和功能研究。在普通人群中，该区域在个体中的长度变化范围为252到460个核苷酸。本发明观察到，具有更长VNTR区域的等位基因比具有更短VNTR区域的等位基因能更有效表达PTHrP。因此VNTR区域可作为PTHrP基因转录的调节区域，原因可能是转录因子和其它蛋白能结合到该区域。
本发明的一个实施方式提供了一个新的寡核苷酸。根据一个优选的实施方式，本发明的寡核苷酸是一个造骨细胞特异的寡核苷酸。优选地，本发明的寡核苷酸包括至少一个在此申请中公开的9-mer的核苷酸序列。更优�。痉⒚鞯墓押塑账岚ū旧昵牍闹辽倭礁�9-mer核苷酸序列的重复片段。本发明的寡核苷酸能用在鉴定新的治疗靶点。本发明的寡核苷酸可通过本领域公知的技术获得。此外，根据本发明的实施方式，以及根据本领域实现杂交的公知方法，例如下文所采用的例子，从而可使本发明的寡核苷酸被用作杂交探针。
在分析一些被诊断为由于遗传缺陷而患有骨质疏松症的男性受试者的过程中，根据本发明鉴定到19个患者中有16个具有高风险的等位基因，即，在PTHrP基因中包含一个更短的含VNTR的区域，且在骨骼的微环境下可能使PTHrP表达下降，这与造骨细胞中的低水平PTHrP和发展为早熟以及严重的骨质疏松症的倾向有关这一动物发现相一致。因而，根据本发明，骨骼疾病和/或具有骨骼疾病诱因的遗传指示子可以是一个PTHrP基因的一个等位基因，该PTHrP基因所包含的一个VNTR区域比一般人群中的更短。更优选地，本发明的实施方式鉴定了VNTR的长度与骨骼疾病的诱因或骨骼疾病的严重性之间的比例关系。例如，所研究个体的PTHrP基因中的VNTR区域越长，个体患骨骼疾病的可能性则越�。欢鳹NTR区域越短，个体患骨骼疾病的可能性则越大。或者，本发明的实施方式还提供了一种对个体骨骼疾病的严重性进行诊断的方法，当患有骨骼疾病或骨骼疾病症状的个体在PTHrP基因的VNTR区域具有更短的等位基因时，则该个体与具有更长等位基因的个体相比，被诊断为患有更严重的骨骼疾病。进一步，可根据本发明的基因型特征，选择性地治疗个体的骨骼疾病或骨骼疾病的诱因。
表征PTHrP基因的等位基因而鉴定个体具有患骨骼疾病危险的遗传检测，尤其是鉴定患骨质疏松症诱因的遗传检测均没有在本发明之前的研究中被提到。
特别是，本发明中记载了PTHrP基因的特定等位基因，也被称为遗传指示子，与骨骼疾病的关联性。根据本发明，PTHrP基因的等位基因被鉴定为骨骼疾病的遗传指示子和/或具有骨骼疾病诱因的遗传指示子。本发明的等位基因部分是根据PTHrP基因染色体区域(本文中称为含VNTR的区域)的大小来定义的，并且进一步是根据该区域所包含的VNTRs的数目来定义的。高危险的等位基因，是代谢性骨骼疾病具有更高危险性的指示，它是包含更少数目VNTR的更短的一种含VNTR的区域。在实施方式中，骨骼疾病更优选是一种代谢性骨骼疾病。根据本发明优选的实施方式，代谢性骨骼疾病可选自骨质疏松症、骨软化病、骨胳硬化症、佩吉特氏病和肾性骨质营养不良。
每个VNTR序列可包含RTATATATA上文说明每个VNTR的第一个位置可以是G或A，也就是，VNTR可以包含GTATATATA或ATATATATA。
相应地，本发明提供了一种包含一个或多个上述核苷序列重复的核苷酸序列和/或寡核苷酸。本发明分离的核苷酸序列和/或寡核苷酸可被用作骨骼疾病遗传指示子的检侧试剂，例如杂交探针。此外，本发明的这些技术方案可以用作鉴定化合物的探针，这些化合物对骨骼疾病或其诱因具有治疗或预防潜能。或者，本发明的核酸序列和/或寡核苷酸可被施用在体内，作为骨骼疾病的优选治疗和/或预防治疗方案或治疗组分。本发明核酸序列和/或寡核苷酸可采用本领域公知的方法来制备或分离到，例如这些方法记载在Sambrook等.(1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratories)；Ausubel等.(1994，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，New York)；以及Glick等.(1994 MolecularBiotechnology-Principles and Applications ofRecombinant DNA，ASM，Washington，D.C.)中。当用作杂交探针时，本发明的核酸序列和/或寡核苷酸优选在本领域公知的或下文示例的严格杂交条件下与核酸杂交。
本发明鉴定了PTHrP基因VNTR区域的等位基因与PTHrP表达水平之间的相关性。例如，本发明显示，在PTHrP基因中的等位基因包含更长的含VNTR区域时，PTHrP的表达水平较高。此外，在PTHrP基因VNTR区域的重复数目增加与PTHrP的高水平表达相关，并因此达到更好的骨形成。相应地，本发明的一个技术方案提供了一种鉴定与PTHrP低水平表达相关的遗传指示子(即，高危险的等位基因)的基因分型检测，以便能给出指示说明具有遗传指示子的个体存在患骨骼疾病的危险。另外，本发明提供了一种鉴定与PTHrP高水平表达相关的遗传指示子(即，低危险性的等位基因)的检测方法，以便能给出指示说明具有该遗传指示子的个体患骨骼疾病的危险性很低。例如，根据本发明，PTHrP基因中含VNTR区域的252bp的等位基因与骨骼疾病正相关。
根据本发明的一个技术方案，遗传指示子是根据长度来表征的，在遗传组合物包含该指示子的个体中确定疾病或非疾病状态时，长度具有基因型基础。
根据本发明的实施方式，疾病的严重程度可以根据本发明遗传指示子来确定。
本发明可用于对被鉴定为具有患骨骼疾病危险的个体进行诊断和/或治疗。例如，这些个体会表现出骨骼疾病或相关病症的一种或多种症状，或具有一个或多个与骨骼疾病或相关病症关联的危险因子。根据流行病学标准，例如性别、年龄、社会经济因素或家族史来鉴定个体患骨骼疾病的危险，在此基础上可以得出评价，即，所研究的个体比其它人群更易患骨骼疾病。内科医生诊断骨骼疾病一般是根据总的症状表现、病史、家族史、药物治疗、体格检查、成像方法(骨矿物密度的测定)和确定骨骼的完整性的各种血液和尿样测试。
本发明的技术方案通过为其中预先确定的遗传指示子而评价PTHrP基因(受试者中存在的PTHrP等位基因的性质)，从而提供了诊断和预测代谢性骨骼疾病的方法。在鉴定本发明的遗传指示子时，与骨骼疾病有关的个体基因型谱能得到表征。本发明的受试者优选是哺乳动物，更优选是人。本发明的受试者可以是具有患代谢性骨骼疾病危险的受试者。
在实施方式中，遗传指示子是根据存在于PTHrP基因的等位基因中的含VNTR区域的PTHrP的性质而被表征的。
相应地，本发明提供了一种诊断或预测骨骼疾病的方法，该方法包括a)从所述个体中获得一个生物样品，所述的样品适合用于检测患者的甲状旁腺素相关肽(PTHrP)基因；b)在所述个体的PTHrP基因中筛选出针对骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；和c)根据步骤b)的结果诊断所述个体患骨骼疾病的危险性。因而，根据本发明鉴定到的遗传指示子的特征能诊断骨骼疾病或说明患者具有骨骼疾病的诱因。根据本发明优选的实施方式，本发明的遗传指示子是根据长度来确定的。更优选地，本发明的遗传指示子包含PTHrP基因中的含VNTR区域。根据本发明的实施方式，PTHrP基因中的含VNTR区域的突变体在本文中也被称为等位基因或等位基因突变体。在一个实施方式中，遗传指示子出现在PTHrP基因内含子的数目可变的串联重复(VNTR)区域中。在一个实施方式中，内含子位于PTHrP基因的外显子VI和VII之间。在本发明的一个实施方式中，遗传指示子的表征是基于PTHrP基因的等位基因中VNTR的数目(例如，9-mer的核苷酸序列的3个重复)。在本发明的另一个实施方式中，遗传指示子的表征是基于鉴定包含PTHrP基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域的等位基因，该等位基因选自252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp和460bp长度的等位基因。可以采用各种本领域公知的方法鉴定PTHrP基因(或其上的遗传指示子)。例如，包含VNTR区域的等位基因可以通过PCR扩增该区域得到PCR产物，然后检查所获得的PCR产物的长度而得以鉴定。可采用合适的寡核苷酸引物来进行扩增，例如图10所示的引物，其购自SHELDON BIOTECH，Montreal，PQ。
等位基因的鉴定可以通过例如直接对PTHrP基因或其区域，如含VNTR的区域进行测序。另一种鉴定PTHrP的方法可以是限制性片段长度多态性分析(RFLP)，例如，PCR扩增包含PTHrP基因或其区域如含VNTR区域的核苷酸序列，得到PCR产物，用限制性酶消化PCR产物得到限制性消化产物；例如通过凝胶电泳来检测得到的限制性消化产物的长度。其它的方法可以在优化的杂交条件下使用等位基因特异性探针的杂交，因而能检测到等位基因的差异。还可使用微阵列方法，如美国专利5,858,659(Sapolsky et al.；January12，1999)或6,223,127(Berno；April 24，2001)中所述的方法。
在实施方式中，从受试者的生物样品，例如从受试者的组织或体液中鉴定PTHrP等位基因。合适的组织或体液包括但不限于血液、血浆、淋巴细胞、上皮细胞、造骨细胞、骨髓基质细胞和成纤维细胞。本发明的生物样品包括DNA。优选地，可以从本发明生物样品中检测出和/或扩增个体的DNA。采用本领域公知的方法进行DNA扩增和检测，在并入本文作为参考的文献中列举了其中的一些方法。
在实施方式中，在鉴定样品中的PTHrP基因之前，先从样品中纯化包含了PTHrP基因或部分该基因的核酸。在实施方式中，在确定PTHrP等位基因是否存在之前，先扩增纯化得到的核酸。在实施方式中，用引物扩增纯化得到的核酸，该引物能扩增PTHrP基因或该基因片段。在某些实施方式中，通过采用能与含VNTR区域的两端(即，5’端和3’端)序列杂交的引物，例如图10所示的引物的PCR方法进行扩增。
本发明进一步涉及使用上述的PTHrP基因的等位基因来诊断和/或预测骨骼疾病。根据优选的实施方式，本发明提供了一个杂交探针，该探针的序列与PTHrP基因的等位基因的至少一个9-mer核苷酸序列同源。
本发明进一步提供了实施上述诊断和/或预测骨骼疾病的方法的商用包装或试剂盒，该商业包装或试剂盒包含合适的上述试剂(例如引物或探针)，以及说明书，以说明采用此类商业包装以诊断和/或预测对骨骼疾病的易感性的方法。
因此，本发明进一步提供了一种商用包装或试剂盒来诊断和/或预测骨骼疾病。本发明的商业包装或试剂盒包含试剂，该试剂用来检测受试者PTHrP基因中骨骼疾病的遗传指示子；还包括说明书，用来确定所述的遗传指示子是骨骼疾病和/或骨骼疾病易感性的阳性或阴性指示子。更优选地，本发明的包装或试剂盒还包含将预定的遗传指示子与疾病严重性程度和/或易感性程度相关联的定量关联信息。
在一个技术方案中，本发明提供了一种治疗患有骨骼疾病或骨骼疾病易感性的病人的方法，该病人具有PTHrP基因，该方法包括(a)根据在所述基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域中测到的变化来表征患者的PTHrP基因；(b)根据所述基因的VNTR区域中测得的变化，采用个体特异性的治疗方案治疗患者。
PTHrP基因的变化可以是外显子VI和VII之间的内含子处VNTR区域的长度。因而，该变化可以作用本发明合适的遗传指示子。本发明的高危险性等位基因(或遗传指示子)的存在可以例如被用作骨骼疾病易感性或诱因的指示子，或更严重的骨骼疾病的指示子。更优选地，本发明提供了一种根据个体的基因型选择性治疗骨骼疾病和/或疾病诱因的方法。也就是，本发明提供了针对骨骼疾病的基因型特异性的治疗或预防方案。在实施方式中，根据本发明的遗传指示子来表征个体的基因型，并在此基础上设计出相应的治疗或预防方案。例如，根据本发明的实施方式，具有PTHrP基因的252bp等位基因的个体所接受的治疗与具有PTHrP基因的460bp等位基因的个体所接受的治疗是不同的。
可以根据本发明的各种技术方案治疗病人的骨骼疾病。例如，对病人骨骼疾病的治疗包括采用有效量的化合物或药物向病人给药。有效量的药物可以是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”指在一定剂量和一定时间内能达到所需的治疗效果，例如减轻骨骼疾病的迹象和症状，和/或使骨骼结构损伤延迟出现的有效量。治疗有效量会根据各种因素例如疾病状态、年龄、性别和个体的体重，以及治疗能在个体中引起所需反应的能力而变化。剂量方案可作调整以便产生最优的治疗反应。治疗有效量也是使治疗有益效果远远超过治疗毒害效果的用量。“预防有效量”是指在一定用量和一定时间内能达到所需的预防效果，例如减轻骨骼疾病的迹象和症状，以及使骨骼结构损伤延迟出现的有效量。预防有效量可以在疾病出现前或疾病的早期阶段在受试者上施用，预防有效量可能在某些情况下比治疗有效量多或少。
治疗骨骼疾病的药物例如包括FDA批准的治疗各种程度骨骼疾病的药物，例如能减轻患者骨骼疾病的迹象和症状，以及使骨骼结构损伤延迟出现。这些药物包括如雌激素、阿仑膦酸盐(alendronate)，利塞膦酸盐(residronate)，降钙素和甲状旁腺素。
本发明一个技术方案使用了PTHrP核酸进行基因治疗。可以通过治疗上可接受的基因治疗载体传递PTHrP核酸，来修饰患者的PTHrP等位基因谱。例如，基因治疗可以用低危险的PTHrP等位基因来替代高危险的PTHrP等位基因，或促进PTHrP蛋白的表达。
基因治疗载体可以是例如腺相关病毒载体(AAV)。这种载体例如包括5’反向末端重复区(ITR)；启动子，如具有造骨细胞特异性增强子的CMV增强子-启动子；内含子；3’非编码区(3’-UTR)；多聚腺苷酸信号，如SV40多聚腺苷酸信号；和3’-ITR。对于基因治疗的载体，给药的剂量很大程度上依赖于被治疗的受试者的病情和个体大�。约爸瘟频呐浞�、治疗的频率和给药途径。根据用药的初始反应和临床判断来指导连续治疗方案，包括剂量、配方和频率。优选的非肠道给药采用注射给药至组织空隙间，但是在一些特定的给药条件下也需要其它非肠道给药途径，如吸入气雾剂。在一些方法中，采用合适的用量将水性载体中包含基因和基因传递系统的配方注射到组织中。组织目标可以是特异性的，例如肌肉或肝脏组织，或几种组织的联合，例如肌肉和肝脏组织。代表性的组织目标可包括肝脏、骨骼肌、心肌、脂肪沉积物、肾、肺、血管内皮、表皮和/或造血细胞和骨细胞。本发明的核酸可传递到体内的细胞中，采用例如直接的DNA注射方法，受体介导的DNA摄入，病毒介导的转染或非病毒转染和基于脂质体的转染方法，所有的这些方法都涉及到使用基因治疗载体。直接注射用来将裸DNA引入体内细胞中(参见如Acsadi等.(1991)Nature 332815-818；Wolff et al.(1990)Science 2471465-1468)。将DNA注射至体内细胞中可能需要使用传递工具(例如“基因枪”)。这种工具是可以商业购得的(如BioRad的15)。裸DNA还可与阳离子例如赖氨酸形成配位复合物而导入细胞中，该复合物与细胞表面受体的配体相偶联(参见例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等.(1992)J.Biol.Chem.267963-967；以及U.S.Pat.No.5,166,320)。DNA-配体复合物与受体的结合能通过受体介导的内吞作用来促进DNA的摄入。与腺病毒壳体结合的DNA-配体复合物能用来阻止复合物被细胞内溶酶体降解，这是由于腺病毒壳体能破坏内涵体从而将物质释放到细胞质中(参见如Curiel等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；Cristiano etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。缺陷型逆转录病毒能用作基因治疗的载体(为查阅起鉴，请参见Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等.(eds.)GreenePublishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它标准实验手册中，可以找到制备重组逆转录病毒和用这些病毒在体外或体内感染细胞的30种方法。合适的逆转录病毒的例子包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它们都是本领域技术人员所公知的。合适的包装病毒系的例子包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。逆转录病毒已被用来将多种基因导入许多不同类型的体内和/或体外细胞中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(参见例如Eglitis等，(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8761416145；Huber等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8880398043；Ferry等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8883778381；Chowdhury等.(1991)Science 2541802-1805；van Beusechem等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay等.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等.(1993)J.Immunol.1504104-4115；U.S.Pat.No.4,868,116；U.S.Pat.No.4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO89/05345；以及PCT申请WO 92/07573)。
当用作基因治疗的载体时，可对腺病毒的基因组进行操作使它包含PTHrP核酸，但是该病毒丧失了在一个正常的渐退的病毒生命周期中复制的能力。参见，Berkner等.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等.(1991)Science 252431-434；以及Rosenfeld等.(1992)Cell 68143-155。合适的腺病毒载体来源于本领域公知的腺病毒株Ad型5 dl324或其它腺病毒株(例如，Ad2，Ad3，Ad7等)，它们是本领域公知的。重组腺病毒非常有优势，因为它们无需分裂细胞而成为有效的基因传递载体，并能感染多种细胞类型，包括导管上皮细胞(Rosenfeld等.(1992)cited supra)，内皮细胞(Lemarchand等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)，肝细胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9028122816)和肌细胞(Quantin等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺相关病毒(AAV)可以在基因治疗上作为传递DNA的基因治疗载体。AAV是一种天然产生的缺陷病毒，它需要其它病毒例如腺病毒或疱疹病毒为有效的复制和生命周期作为协助病毒(Muzyczka等.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可以用来将DNA整合至不分裂的细胞中(参见如Flotte等.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等.(1989)J.Virol.633822-3828；以及McLaughlin等.(1989)J.Virol.6219631973)。例如在Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260中记载的AAV载体可用来将DNA引入到细胞里(参见例如Hermonat等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等.(1984)J.Virol.51611619；以及Flotte等.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。Lentiviral基因治疗载体也可适用于本发明。
基因治疗的一般方法是本领域公知的，例如可参见Anderson等的U.S.Pat.No.5,399,346。在Baetge等人的PCT公开文献95/05452中记载了一种生物相容性胶囊传递的遗传材料。将基因转移到造血细胞中的方法也已有报道，可以参见Clapp，D.W.等.，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo et al.，288669-72(2000)。
本发明进一步涉及转基因的非人哺乳动物，用于研究骨骼疾病及其机制。更优选地，本发明的非人转基因哺乳动物可以造骨细胞特异性方式来研究PTHrP的作用，非人哺乳动物在造骨细胞中特异性地具有破坏的/失活的PTHrP基因(或部分该基因)。对于破坏的PTHrP基因，本发明的非人转基因哺乳动物的造骨细胞可以是纯合体或杂合体。此外，本发明的非人哺乳动物可用来筛选对调节PTHrP的表达和/或治疗、预防或延缓骨骼疾病病变为有效的化合物和/或药剂。当采用能增加PTHrP表达的化合物对需要骨骼形成或修复的病人进行治疗时，造骨细胞产生PTHrP的作用将被刺激，从而导致骨骼形成和修复。因此，根据本发明实施方式鉴定到的能调节PTHrP表达的化合物可用于治疗骨骼疾病、骨断裂、骨损伤、骨骼发育不全和其它需要产生PTHrP的病症。
在实施方式中，非人哺乳动物的体细胞包括PTHrP基因破坏机制，例如使特定地在造骨细胞中的PTHrP基因、部分该基因或与该基因实质相同的核酸序列被去除/被剪切或失活。“特定地在造骨细胞中”在此是指在造骨细胞中去除或失活，而在非造骨细胞中基本不去除或失活。在实施方式中，哺乳动物是啮齿动物，优选是小鼠。
在实施方式中，上面提到的PTHrP基因破坏机制包括(a)Cre重组酶基因造骨细胞特异的转录调节区域，例如启动子；和(b)在PTHrP基因或其部分基因侧翼的loxP位点。在一个实施方式中，造骨细胞特异性的启动子是类型1的胶原蛋白启动子。
在下述的实施例中，这些动物能用于研究骨骼组织中许多PTHrP依赖性的表型，并且具有上文所述的应用。例如，这些动物能用于研究骨骼疾病、骨形成、骨断裂、骨损伤和骨骼疾病治疗方法的发现和开发。尤其是，本发明的转基因非人哺乳动物尤其能用来筛选可能的治疗化合物和/或药剂，该化合物和/或药剂能有效用来治疗、预防和改善骨骼疾病和/或骨骼的病情。本发明的转基因非人哺乳动物在这一点上是很有优势的，因为它提供了一种能用于长时间研究的活的动物，并且还提供了一种造骨细胞中纯合的空白PTHrP-/-对照，用来研究与PTHrP功能有关的骨骼发育和疾病。例如，PTHrPflox/flox/ostCre小鼠用实验制剂或单独用载体处理一到两个月，然后处死，用多种技术检查小鼠的骨骼，这些技术包括BMD、组织学、组织形态测量学和免疫组织化学等。与用载体处理的动物相比，实验动物骨密度和骨微结构的增加是非常重要的。
尽管在此公开了本发明的多种实施方式，但是根据本领域公知的方法所作的改变修饰也属于本发明的范围。这些修饰包括，为了达到相同的结果而采用实质上相同的方法做的等同替换。数值范围包括范围内的数字。在权利要求中，所用的“包含”是开放式写法，等同于“包含，但不限于”。
下面的实施例用来阐述本发明的各种实施方式，但不是用来限制本发明公开的较宽的技术方案。
实施例实施例1对PTHrP(+/-)杂合小鼠的分析在PTHrP(+/-)动物中评价骨损失的程度，将骨骼从这些动物中取出并用微CT分析。用一个分辨率为18μm3的μCT 20系统(Scanco USA，Inc.Wayne，PA)对骨骼进行扫描。从每个样品中获得一系列的图像。采用10个感兴趣的手选体积进行三维分析，来计算骨小梁形态特征参数。图1是从正常小鼠(左边样品)和杂合体小鼠(右边样品)中所选的具有代表性的图，再次显示了突变小鼠中骨小梁含量发生下降。
图2为按照上述分析的测定骨骼体积(BV/TV)，显示在突变动物中体积下降了50％，而骨小梁的数目(Tb.N)和厚度(Tb.Th.)没有改变。
图3显示，骨小梁之间的空隙显著增加了，而其它的参数例如DA(各项异性程度)和SMI(结构模型指数)、描述骨骼3-D结构的特征都表明在突变小鼠中存在骨质疏松变化。
为了确定骨骼数量下降的原因，在处死前4天，分别给小鼠腹膜内注射钙黄绿素(20mg/kg动物体重)和土霉素(30mg/kg动物体重)。取出每个动物的股骨和胫骨，在甲基丙烯酸甲基酯(该化合物能整合到新沉积的骨中，发出绿色荧光)中进行非脱钙处理，14天后给同样的动物注射四环素(发出橙红色光)。如图4所示，两条线(图形C和D)之间的距离可以用来计算骨形成的速率，在突变小鼠中该速率明显减少。
为了确定图5所示的PTHrP(+/-)小鼠的骨骼形成减少的原因，从正常(左)和突变(右)的动物中抽出骨髓，并培养，分化成造骨细胞(骨形成细胞)。用1ml的MEM介质从两端冲洗骨髓，制得了细胞培养物。收集粘连细胞，并以104个细胞/35mm培养皿的密度铺在包含胎牛血清、抗生素(100ug/ml的pen G、50ug/ml的庆大霉素、和0.3ug/ml的两性霉素B)、50ug/ml的抗坏血酸、10-9M地塞米松和10mM Na-R-甘油磷酸酯的MEM介质上，促进矿物化的骨节形成。每2-3天更换介质，共培养20天。最后，将细胞固定并用碱性磷酸酶染色。使用解剖显微镜对集落进行定量。可以看到，突变小鼠的骨髓不能像正常小鼠一样轻易分化成造骨细胞。因此，造骨细胞的分化受损。
实施例2使小鼠的造骨细胞中的PTHrP选择性失活在杂合体PTHrP(+/-)小鼠中，PTHrP基因从体内的每个细胞包括造骨细胞，hondrocytes，和软骨形成细胞中被去除。由于骨是由软骨形成的，因此有可能观察到异常的软骨形成，而不是骨骼形成的受损。
为了排除这种可能性，使用Cre-LoxP系统来得到仅仅在造骨细胞中缺失PTHrP的小鼠(如图6所示)，该系统需要两只小鼠一只在PTHrP基因侧翼连有LoxP序列，第二只在造骨细胞特异性的启动子(类型1的胶原蛋白)下表达Cre重组酶的转基因小鼠(He等.(2001)Endocrinology 142(5)2070-7)。交配时，PTHrP基因仅仅从造骨细胞中被去除。所有的其它细胞都是正常的。尤其是，携带有处于类型1的胶原蛋白启动子(Col I)控制下的位点特异性重组酶基因(Cre)的小鼠与PTHrP floxed小鼠(PTHrPflox/flox)交配，该PTHrPflox/flox小鼠的两个PTHrP等位基因的外显子4的侧面都连接有loxP位点，交配后产生了造骨细胞中缺乏PTHrP表达的小鼠(PTHrpflox/flox；crecolI)。
如图7所示，上面的骨小梁图中显示了造骨细胞发育早熟。小梁处的图(黑色)衬出功能性造骨细胞。相比之下，突变细胞(右下)没有显示出大量的健康造骨细胞。因此，造骨细胞中PTHrP的缺失导致造骨细胞功能下降和骨形成的减少。
如图8所示，在野生型样品的骨中，缺失PTHrP的造骨细胞并不十分明显，因为它们由于凋亡而死亡了(左图)。如右图所示，在造骨细胞缺失PTHrP的突变动物中(2个月大)，采用特异性试验对造骨细胞的凋亡细胞核的染色是非常明显的，(中心区，右图)，但在野生型样品中并不明显(左图)。
这些发现表明PTHrP对于正常造骨细胞的发育是关键的，因为它的缺失导致造骨细胞生成的减少以及早期的凋亡。最后的结果是骨形成的减少和骨质疏松的过早产生。
与同窝出生的野生型PTHrPflox/flox对照小鼠相比，进一步确定了6星期的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的血清钙、PTH和1，25二羟维生素D3水平和甲状旁腺尺寸是正常的。另一方面，用PIXImus比重计测量，发现与野生型小鼠相比，6星期的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的股骨和胫骨的骨密度下降了6.33％和6.00％。骨小梁的体积也受到了影响，与同窝出生的野生小鼠相比，在新生的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的股骨和胫骨中分别下降了33.33％和35.50％，在6周的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠中下降了33.90％和47.00％。组织形态学分析显示，与野生型小鼠相比，6周龄的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠中的造骨细胞数目和表面、骨样厚度、骨小梁厚度都大大减少了。
与野生型对应物小鼠相比，在6周龄P-/floxcresolI小鼠股骨的干骨后端测量类型1的胶原蛋白、骨钙素(osteocalcin)，和骨桥蛋白(osteopontin)染色的阳性区域而确定的免疫组化进一步证实这一点。与6周龄的野生型小鼠相比，双重钙黄绿素标记的组织形态学证实骨形成速度也下降了。此外，与野生型小鼠相比，6周龄P-/flox，cresolI小鼠中造骨细胞的数目和表面也显著减少了。因此这些结果显示，PTHrP至少部分通过自分泌方式表现出合成代谢作用，并能调节或刺激造骨细胞形成和新生。
根据本发明，上述的方法适合用来产生杂合的造骨细胞特异性PTHrP破坏的小鼠。
实施例3比较骨质疏松症和健康受试者之间的PTHrP基因序列人PTHrP基因的结构尤其参见图9，并进一步被Yasuda T.等.inJ BiolChem.1989 May 5；264(13)7720-5)所公开。箭头所指的DNA区域包含VNTR，即数目可变的串联重复片段，该重复片段已在上文记载，但是没有提到任何它的功能(Pausova Z.等.Genomics.1993 17(1)243-4)。
如图10所示，采用针对划线区域的寡核苷酸引物，可以从基因组DNA中PCR扩增到含VNTR的序列。根据个体DNA中含有的这些重复片段的数目，串联重复片段的数目(G/ATATATATA)n可产生各种长度的扩增DNA。
如图11所示，在普通人群中存在各种VNTRs，长度在252bp至460bp之间。清楚的是，虽然还公开了一些更短的重复片段，但最常见的是252bp至378bp的VNTRs。
然后检测了19个骨质疏松症男性患者受试者的PTHrP VNTR区域。这些患者诊断为患有先天的骨质疏松症，即，很可能由于遗传原因导致的骨质疏松症。如图11所示，在病人样本中，16/19(84％)具有252bp等位基因，比普通人群中出现的频率(32％)高得多，这说明在特定的个体中，短的VNTRs在确定具有患骨质疏松症更高危险性上非常重要。
材料和方法研究设计本研究选择具有骨质疏松症临床表现并且发现有低或正常骨质量密度的病人，还与病人签订了研究同意书。根据呈现的阳性家族病史并排除了第二种病因后，诊断出了由于遗传原因导致的骨质疏松症。记录腰脊柱(L2-4)，股骨颈部和股骨转子T-(与年轻成人相比的BMD)和Z-(与年龄匹配的对照相比的BMD)数值。并且还需获得基准特征，例如年龄、身高、体重、钙摄入和25(OH)维生素D水平。从每个病人上收集血液样品(10cc)。从血液细胞中分离DNA，通过PCR检测PTHrP VNTR。然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增的DNA片段的长度。
根据法律的规定为病人保密。如果病人有要求，他们可以在研究的任何时候退出。病人参加该研究是无成本无报酬的。
排除标准具有骨骼疾病病史的病人或正在进行影响骨骼更新的药物治疗的病人将从本研究中被排除。已经在进行骨质疏松治疗的病人不被允许加入本研究。
病人的风险与本研究有关的风险是极小的。这些风险与抽血有关，包括疼痛、淤伤或偶尔的昏晕。
病人的益处病人将得到对骨质疏松症的检查，并且病人也会得到适当的随访以及对他们BMD的下降进行治疗。
相关性PTHrP VNTR遗传标记物可以作为诊断工具，用来评价个体患骨质疏松症和骨质疏松的骨折的危险性。我们已知，BMD T-数值为-2.5，它被广泛用作骨质疏松症的治疗阈值，该数值在实际患有骨折的群体中仅鉴定到很小比例的个体。骨脆弱或骨损失的遗传标记物可用在BMD测定之前和BMD测定之时协助对具有骨折危险性的个体进行早期预防治疗。
统计分析对BMD上的VNTR长度的预测值进行了一个探索性研究。记录每个病人的VNTR长度。同样，BMD的2个标记物，即腰脊柱和股骨颈骨将受到记录。
统计学的目的在于说明，VNTR长度和BMD的两个预测因子变量之间具有统计学显著性关系。结果测定为反应Y＝VNTR长度，连续测定值预测因子X1＝腰脊柱，X2＝股骨颈部，X3＝股骨转子，三个都是连续变量。
这种关系会受到原始特征的控制，例如年龄、身高、体重、钙摄入和25(OH)维生素D水平。性别将是另一个对照变量，但是具有一定范围的骨质疏松水平。
总共有80人参加了该研究两组男性，每组20人他们是正常的和患骨质疏松症的；两组绝经期前的女性，每组20人她们是正常的和患骨质疏松症的。
下面进行协方差分析Y＝X1+X2+X3+年龄+身高+体重+钙+维生素+性别+骨质疏松水平(性别)将所有不重要的基准特征从分析中去除，接着根据缩减的模型得到结论。按照SAS版本8.12进行所有的分析。X1、X2和X3的回归系数的统计显著性可表示可能的预测值，这将在进一步的研究中得到确认。
实施例4开发造骨细胞特异的寡核苷酸我们最近发现，包含VNTR的GTATATATA序列的下述寡核苷酸(SEQ IDNO.1)5′-TATATACGTATATATATATACGTATATATATACGTA-3′当与细胞核提取物孵育时会被核蛋白结合。尤其是，当我们将VNTR寡核苷酸与COS细胞核提取物(非骨来源的细胞系)孵育时，没有产生与任何核蛋白的特异性结合。但是，当我们将VNTR寡核苷酸与ROS细胞核提取物(骨来源的细胞系)孵育时，与许多核蛋白都有特异性结合。
这些蛋白的确切性质还有待于确定。但是，该特定区域对PTHrP的表达非常关键，并且，与寡核苷酸序列(SEQ ID NO.1)结合的蛋白会促使骨骼疾病的新的治疗方法和诊断标记物的发现。
本发明还包括一种核酸，在适度严格或优选在严格条件下，该核酸与所有或部分SEQ ID NO.1的寡核苷酸序列、或其互补序列杂交。严格的条件是与序列有关的，并且在不同的情况下是不同的。长序列杂交尤其需要在更高的温度下进行。关于核酸杂交的广泛指南可参见Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)(Elsevier Science，Inc.，New York)。一般地，所选的严格条件比确定的离子强度和pH下特定序列的热解链温度(Tm)要低5-10℃。Tm是指在特定的离子强度和pH下，50％的目标序列与完全匹配的探针结合时的温度。通常，严格条件是盐浓度小于大约1.0M钠离子，优选为0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH7.0-8.3，并且对于短探针(例如10-50个核苷酸)需要温度至少为大约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)需要至少大约60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择性的或特异性的杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。示意性的严格杂交条件可以是如下50％甲酰胺，5×SSC，1％SDS，在42℃下孵育，或者5×SSC，1％SDS，在65℃下孵育，接着用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。根据本发明的目的，合适的“适度严格条件”包括，例如在5×SSC、0.5％SDS和1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预冲洗，在50℃-65℃的5×SSC中杂交过夜，接着在65℃用0.5×和0.2×SSC(含0.1％SDS)冲洗两次，共20分钟。这种杂交DNA序列也属于本发明保护的范围。
本发明的实施方式仅仅是用于示意性的。本发明要求保护的范围是由所附的权利要求书所确定。
序列表<110>麦吉尔大学<120>根据PTHrP预测和诊断骨骼疾病<130>9-16408-1PCT<150>60/384,122<151>2002-05-31<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述寡核苷酸<400>1tatatacgta tatatatata cgtatatata tacgta 3权利要求
1.诊断个体的骨骼疾病的方法，该方法包括a)从所述的个体中获得生物样品，该样品适合用来检测所述个体的甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的基因；b)在所述个体的PTHrP基因中筛选出骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；c)根据步骤(b)中的结果诊断所述个体的骨骼疾病。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述筛选出一个或多个遗传指示子的步骤包括筛选出所述PTHrP基因内数目可变的串联重复(VNTR)区域。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括根据长度确定所述PTHrP基因内的数目可变的串联重复(VNTR)区域；其中所述VNTR区域的长度与诊断骨骼疾病或骨骼疾病的诱因有关。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述VNTR区域的长度为252bp到460bp。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的VNTR区域包括数目可变的串联重复片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述VNTR区域的长度为252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。
7.根据权利要求5所述的方法，其中PTHrP基因中数目可变的串联重复片段(VNTR)包含九个核苷酸重复片段；其中所述的九个核苷酸的重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
8.根据权利要求3所述的方法，其中确定数目可变的串联重复(VNTR)区域进一步包括测定PTHrP基因内具有数目可变的九个核苷酸重复片段的等位基因，其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的骨骼疾病选自骨质疏松症、骨软化病、骨质减少、骨胳硬化症、佩吉特氏病和肾性骨质营养不良。
10.根据权利要求3所述的方法，其中确定数目可变的串联重复(VNTR)区域包括扩增VNTR区域。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的筛选步骤包括特异性针对所述的一个或多个所需的遗传指示子的探针。
12.PTHrP基因的等位基因作为骨骼疾病和/或骨骼疾病的诱因指示子的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述的等位基因选自含PTHrP基因VNTR区域的等位基因。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述的PTHrP基因中的VNTR区域包含数目可变的九个核苷酸重复片段，其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
15.根据权利要求12所述的应用，其中所述的等位基因选自252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp和460bp的等位基因。
16.一种诊断个体对骨骼疾病易感性的方法，所述个体具有PTHrP基因，该方法包括从所述的个体中获得生物样品，该样品适合用来筛选出骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；筛选所述生物样品，从所述个体的PTHrP基因中得到骨骼疾病的一个或多个遗传指示子；根据步骤(b)中的结果诊断所述个体的骨骼疾病；其中当检测到骨骼疾病的一个或多个遗传指示子时，则所述个体被诊断为对骨骼疾病具有易感性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，根据所检测到的一个或多个遗传指示子的特征来确定个体对骨骼疾病的易感性程度。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述的一个或多个遗传指示子包含PTHrP基因内含子中数目可变的串联重复(VNTR)区域。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述的一个或多个遗传指示子的特征包含根据长度确定所述PTHrP基因中的VNTR区域；其中所述VNTR区域的长度与个体对骨骼疾病的易感性程度相关。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述VNTR区域的长度为252bp到460bp。
21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述的VNTR区域包括数目可变的串联重复片段。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述VNTR区域的长度为252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的PTHrP基因中数目可变的串联重复片段(VNTR)包含九个核苷酸重复片段；其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
24.根据权利要求19所述的方法，其中确定数目可变的串联重复(VNTR)区域进一步包括测定PTHrP基因内具有数目可变的九个核苷酸重复片段的等位基因，其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
25.根据权利要求19所述的方法，其中确定数目可变的串联重复(VNTR)区域包括扩增VNTR区域。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述的筛选步骤包括特异性针对所述的一个或多个所需的遗传指示子的探针。
27.对患有骨骼疾病或具有骨骼疾病易感性的病人进行治疗的方法，所述病人具有PTHrP基因，该方法包括鉴定所述患者PTHrP基因中数目可变的串联重复(VNTR)区域内检测到的变化；根据所述基因的VNTR区域中所检测到的变化，采用治疗方案对病人进行选择性治疗。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的治疗方案是一种基因型特异性的治疗方案。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述的治疗方案随时间而改变。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述的治疗方案包括调节PTHrP基因的表达来影响造骨细胞的活性。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述的治疗方案包括增强PTHrP基因的VNTR区域。
32.根据权利要求31所述的方法，其中增强所述PTHrP基因的VNTR区域包括在体内将一个或多个拷贝的数目可变的串联重复片段(VNTR)传递至所述的基因。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述的数目可变的串联重复片段包含九个核苷酸重复片段；其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述的VNTR区域位于PTHrP基因的内含子中。
35.用来诊断和/或预测个体患骨骼疾病的商用试剂盒，该试剂盒包括试剂，用来在所述个体的PTHrP基因中检测骨骼疾病和/或对骨骼疾病的易感性的至少一个遗传指示子；说明书，用来确定所述的至少一个遗传指示子并由此与骨骼疾病的诊断和/或预测相联系。
36.根据权利要求35所述的方法，其中用来检测至少一个遗传指示子的所述试剂包括检测PTHrP基因的数目可变的串联重复(VNTR)区域内所发生变化的试剂。
37.根据权利要求35所述的方法，进一步包括用来确定所述至少一个遗传指示子长度的试剂。
38.根据权利要求35所述的方法，进一步包括用来扩增PTHrP基因的VNTR区域的试剂。
39.根据权利要求35所述的方法，其中用于检测的试剂包括特异性针对PTHrP基因VNTR区域的探针。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述的探针是特异性针对九个核苷酸重复片段的探针，其中所述的九个核苷酸重复片段选自GTATATATA和ATATATATA。
41.转基因的纯合体非人哺乳动物，其中PTHrP基因在造骨细胞中受损，但在其它非造骨细胞中未受损。
42.根据权利要求41所述的非人哺乳动物，其中所述哺乳动物的体细胞包含能够特异性地在造骨细胞中破坏PTHrP基因，而不在非造骨细胞中破坏PTHrP基因的PTHrP基因破坏机制。
43.根据权利要求42所述的非人哺乳动物，其中造骨细胞特异性的PTHrP破坏机制包括处于造骨细胞特异性的启动子控制下的Cre重组酶基因；和与PTHrP基因或该基因的一部分的侧面连接的loxP位点。
44.根据权利要求43所述的非人哺乳动物，其中所述的造骨细胞特异性启动子是类型1的胶原蛋白启动子。
45.根据权利要求43所述的非人哺乳动物，其中所述PTHrP基因的一部分是PTHrP基因的外显子4。
46.根据权利要求41所述的非人哺乳动物，其中所述的哺乳动物是小鼠。
47.权利要求41所述的非人哺乳动物在研究骨骼发育和骨骼疾病上的用途。
48.权利要求41所述的非人哺乳动物在筛选化合物和/或制剂上的应用，该化合物或制剂对骨骼疾病具有治疗和/或预防作用，和/或能够减缓骨骼疾病的发展。
49.单链核酸，具有包含一个或多个GTATATATA或ATATATATA重复片段的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列能与PTHrP基因区域互补。
50.权利要求49所述的单链核酸用作骨骼疾病和/或骨骼疾病诱因的指示子。
51.根据权利要求50所述的单链核酸，其中所述的核苷酸序列的长度为252，288，332，356，378，393，414或460个核苷酸。
52.至少包含GTATATATA或ATATATATA的单链寡核苷酸在鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物中的应用。
53.包含两个或两个以上GTATATATA或ATATATATA重复片段的单链寡核苷酸在鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物中的应用。
54.包含SEQ ID No1或其互补序列的单链寡核苷酸在鉴定能调节PTHrP表达的候选化合物中的应用。
55.权利要求54所述的寡核苷酸在鉴定能在体内调节PTHrP表达的蛋白质中的应用。
56.分离的核酸，包含在严格条件下能与杂交探针杂交的序列，所述杂交探针的核苷酸序列由SEQ ID NO1或其互补序列构成。
全文摘要
本发明提供了一种诊断个体的骨骼疾病和/或对骨骼疾病的易感性的方法。该方法包括从所述的个体中获得生物样品，筛选生物样品以在所述个体的PTHrP基因中得到骨骼疾病的一个或多个遗传指示子，根据检测到的遗传指示子的特性来诊断个体的疾病。本发明的遗传指示子优选包括PTHrP基因的遗传片段。更优选地，PTHrP基因的遗传片段包括含VNTR的区域。本发明进一步提供了一种转基因的非人哺乳动物用作骨骼疾病和/或病症的研究，该哺乳动物的PTHrP基因或尤其是造骨细胞中的PTHrP基因的部分被破坏或失活。
文档编号G01N33/15GK1671866SQ03818116
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月30日 优先权日2002年5月31日
发明者安德鲁·卡拉普利斯, 大卫·多尔特兹曼 申请人:麦吉尔大学
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