亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种小麦组织活性氧荧光标记方法
技术领域：
本发明属于植物逆境胁迫与生理响应技术领域，涉及一种植物组织活性氧定位及相对含量检测的荧光标记方法，特别涉及一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。
背景技术：
植物在生长发育过程中时时遭受各种逆境以及不可避免的衰老过程，从而造成植物细胞活性氧(reactive oxygen species)代谢失调，即植物体内活性氧如超氧物阴离子 (OH ·_)，过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(-0H)、单线态氧(1O2)等猝发；而活性氧的清除剂，如超氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)、类胡萝卜素、维生素E、维生素C等生物合成或活性水平下降，导致活性氧产生与清除动态平衡紊乱，活性氧积累。活性氧积累对植物产生伤害的一个重要机制是直接或间接启动膜脂的过氧化作用，导致细胞膜、类囊体片层结构、线粒体膜、核膜等细胞膜系统损伤、降解，丙二醛(MDA)含量增加，叶绿素降解和光合作用酶活性下降，植物光合效率下降，植物不能维持正常的生长和发育，组织过早衰老死亡。小麦是两年生作物，在整个生活史中要遭受冬季冻害、春季干旱、初夏热害等自然逆境，以及病虫害等生物逆境，同时花后灌浆过程又是一个不可避免的衰老过程。因此，检测小麦组织活性氧产生部位与含量是衡量小麦抗逆性、高产稳产的一个关键指标，是育种学家筛选优良小麦品种的一个重要措施。以前的文献中，对活性氧的标记一般用硝基四氮唑蓝(NBT)标记超氧物阴离子(活性氧中的一种)，3，3’ - 二氨基联苯胺(DAB)标记H2O2活性氧中的一种)。然而，植物组织中活性氧种类繁多，其产生量也相差很大，因此，难以用1-2 种活性氧含量的变化说明植物的抗逆性或衰老进程。更重要的是，目前对小麦组织、特别是较大体积的材料中活性氧综合产生量还没有科学的检测方法。2’，7’ - 二氯氢化荧光素双乙酸酯(DCFH-DA)可以通过细胞膜进入细胞内，被细胞内非特异性脂酶催化生成2’，7’ - 二氢二氯荧光黄(DCFH)，DCFH不能发出荧光。当细胞内有活性氧存在时，DCFH可以被氧化成2’，7’- 二氯荧光黄(DCF)，在488 nm波长激光激发下发出波长530 nm左右的绿色荧光。DCF形成量与细胞氧化产物水平呈正比。因此， DCF荧光强度间接反映细胞内活性氧的综合水平(Schopfer et al.，2001)。DCFH-DA标记活性氧首先在动物细胞上应用，在植物上的应用还只限于如悬浮培养细胞、菌类、原生质体等单个细胞或体积很小的材料，如剥离的叶片表皮层细胞。本发明应用DCFH-DA荧光标记，首先在小麦叶片、茎杆等较大组织材料中标记活性氧的产生、定位及相对含量的检测，最大限度保留细胞活性、对小麦植株内产生的活性氧进行精准标记。

发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境
3与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。本发明提供了一种活性氧荧光标方法，采用DCFH-DA对小麦不同组织材料中的活性氧进行综合标记、定位及相对含量检测。该方法包括下述的步骤
a.配制小麦组织样品标记负载缓冲液，吸取样品标记负载缓冲液5 ml置入容积 6-10ml的器皿中；
以上的标记负载缓冲液通过如下方法配制
配制10 mM Tris-HCl或磷酸盐(PBS)缓冲液(pH 7. 2-7. 5);用DMS0、醇溶液配制 DCFH-DA母液(可冻存于 20°C- 80°C条件下)，浓度为3_5 mM ;用缓冲液配制荧光标记负载液，含最终浓度为30-50 μ M的DCFH-DA、终浓度为50 mM的KCl和终浓度为2. 2-2. 8% (体积百分比)的戊二醛。b.用锋利刀片，如剃须刀片或手术刀片，将小麦茎杆、叶片等材料切割成长度为 O. 5 cm组织块；
c.用样品标记负载缓冲液漂洗步骤b制得组织块，至少漂洗两次，然后将组织块置于步骤a中盛有标记负载缓冲液的器皿中，密封后抽气，使植物组织块全部沉到器皿底部，促使负载缓冲液快速进入材料内部；
d.在25°C下避光放置20-30分钟；
e.将步骤d中的材料放置在显微镜载玻片上，用激光激发装置激发，荧光显微镜下观察、CXD图像采集系统拍照，显微镜工作条件为激发波长为460-500 nm,发散波长为 510-560 nm。以上的醇溶液为乙醇或者是甲醇。本发明适用于O. 5 cm长、厚度小于I mm的各种植物组织材料,特别是在小麦材料上本发明已经成功使用。本发明的有益效果在于
(1)传统的DAB、NBT等对活性氧种类的标记需要2-12小时，时间较长，而本发明对活性氧的标记只需要20-30分钟，避免了样品长时间标记负载期间活性氧含量及部位的失真；
(2)采用本发明的方法可对较大的组织材料中活性氧综合产生量进行更科学的检测； 例如可以对厚度小于1_的植物叶片组织、壁厚小于1_的茎杆组织如小麦茎杆中的活性氧进行检测；
(3)本发明所用样品标记负载缓冲液含有终浓度为2.2-2. 8% (体积百分比)戊二醛，可在DCFH-DA对活性氧标记的同时，对材料进行固定，保证活性氧标记的精确性；同时，用注射器对密封后放置材料的器皿进行抽气，使负载缓冲液快速进入材料内部，提高固定与负载效果；
(4)本发明能对较大体积的组织材料中活性氧综合产生量进行检测，更能精准反映植物的抗逆性或衰老进程；
(5)本发明对实验材料的前处理以及所用的器材要求简单，易于操作。


图I为实施例I小麦叶片组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果；图2为实施例2小麦叶片组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果；
图3为实施例3小麦叶片组织荧光激发后在荧光显微镜下观察的结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
来对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。实施例I
一种植物组织活性氧荧光标记方法，在营养胁迫(氮素缺乏)下小麦(济麦22)茎杆组织中的应用，具体操作如下
a.配制小麦组织样品标记负载缓冲液，吸取样品标记负载缓冲液5 ml置入容积为10 ml的器皿中；
配制10 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7. 2);用DMSO配制DCFH-DA母液，浓度为5 mM ;用缓冲液配制荧光标记负载液，含最终浓度为50 11|1的00 ! ^、终浓度为50 mM的KCl和终浓度为2. 5% (体积百分比)的戊二醛。b.将小麦茎杆切成长度为O. 5 cm的组织块，并沿纵轴平均切开，一分为二 ；
c.用样品标记负载缓冲液漂洗步骤b制得组织块两次，然后置于步骤a中盛有标记负载缓冲液的器皿中，密封后抽气，使植物组织块全部沉到器皿底部；
d.在25°C下避光放置30分钟；
e.将茎杆组织块外侧朝上放置在显微镜载玻片上，用荧光显微镜(LeicaDM 2500)观察并用CXD图像采集系统(Leica DFC 420)拍照，显微镜工作条件为激发波长为495 nm, 发散波长为518 nm。将最终制作的小麦茎杆组织材料用荧光激发装置激发，在荧光显微镜下观察，观察结果如附图I所示，图中箭头所指为性氧产生部位与相对含量，高亮度部位说明活性氧含量较高，低亮度部位活性氧含量相对较低，标尺=200 Mm)。
权利要求
1.小麦组织活性氧荧光标记方法，包括下述的步骤a.配制小麦组织样品标记负载缓冲液，吸取小麦组织样品标记负载缓冲液5ml置于器皿中；以上的样品标记负载缓冲液通过如下方法配制配制10 mM Tris-HCl或磷酸盐PBS缓冲液，其pH 7. 2-7. 5 ；用DMS0、醇溶液配制浓度为3-5 mM DCFH-DA的母液；用缓冲液配制的荧光标记负载液，含最终浓度为30-50 μ M的DCFH-DA、终浓度为50 mM的KCl和终浓度为2. 2-2. 8%的戊二醛，其中戊二醛的浓度为体积百分比；b.用刀片将小麦茎杆、叶片材料切成长度为O.4 - O. 6cm组织块；c.用样品标记负载缓冲液漂洗步骤b中的组织块，然后置于步骤a中盛有样品标记负载缓冲液的器皿中，密封后抽气；d.在25°C下避光放置20-30分钟；e.将步骤d中的材料放置在显微镜载玻片上，用激光激发装置激发，在荧光显微镜下观察CCD图像采集系统拍照，显微镜工作条件为激发波长为460-500 nm,发散波长为 510-560 nm。
2.如权利要求I所述的小麦组织活性氧荧光标记方法，其特征在于，步骤b中所述的醇溶液为甲醇或者是乙醇中的任一种。
全文摘要
本发明属于植物逆境胁迫与生理响应技术领域，特别涉及一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。该标记方法的步骤是配制标记负载缓冲液、准备材料组织块、负载缓冲液漂洗组织块、在25℃下避光放置、用激光激发装置激发，观察并拍照。本发明的方法相对于传统的DAB、NBT等对活性氧种类的标记方法节省了时间，避免了样品长时间标记负载期间活性氧含量及部位的失真；可在DCFH-DA对活性氧标记的同时，对材料进行固定，保证活性氧标记的精确性；所用的器材要求简单，易于操作。
文档编号G01N1/28GK102589942SQ201210015479
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者冯波, 司纪升, 孔令安, 张宾, 李升东, 王法宏 申请人:山东省农业科学院作物研究所