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专利名称：一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，具体涉及一种微波辅助血浆样品前处理方法及在血浆代谢组学分析中的应用。
背景技术：
代谢组学(metabonomics/metabolomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，通过组群指标分析，进行高通量检测和数据处理，研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化，特别是对内源代谢、遗传变异、环境变化乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响。其常用的分析技术为气相色谱-质谱联用(GC/MS)技术、液相色谱-质 谱联用(LC/MS)技术和核磁共振(NMR)等。其中气-质联用在代谢组学研究中被称作代谢物分析的“黄金标准”(参见文献 I :Fischer E, Sauer U. Metabolic flux profilingof Escherichia coli mutants in central carbon metabolism using GC-MS. EuropeanJournal of Biochemistry, 2003, 270 (5) :880_891.参见文献 2 :Zimmermann D，HartmannM，Moyer M P，et al. Metabolomics of human colon cell lines. Metabolomics，2007，3(1) :13-17.)，但采用GC/MS进行分析，大多数样品都需要在室温或升温的条件下进行衍生化处理，传统的血浆代谢组学样品前处理条件为35°C下肟化2h后再在70°C下衍生化反应Ih (参见文献3 :简伟雄，袁肇凯，黄献平，等.冠心病心血瘀阻证血浆代谢组学的检测分析，中国中西医结合杂志，2010，30 (6) 579-584)，这不仅工作量大而且耗时、效率低。已有文献报道微波能促进有机化学反应(参见文献4 :樊兴君，尤进茂，谭干祖，等.微波促进有机化学反应研究进展，化学进展，1998，10 (3) :285-295)，采用微波辅助衍生化来有效地缩短衍生化时间，但对于耗时最长的肟化反应并未缩短，仅靠微波辅助衍生化并不能完全提高效率。目前国内外尚无文献报道在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种在血浆代谢组学研究中，采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理的方法。本发明在微波能有效促进化学反应的前提下，尝试采用微波技术辅助肟化来进一步缩短血浆样品处理时间，从而更有效地提高效率。本发明的技术方案即同时采用微波辅助肟化及衍生化技术对血浆样品进行前处理，然后结合GC/MS法进行血浆代谢组学研究。本发明米用Box-Behnken (参见文献 5 S. L. C. Ferreira, R.E. Bruns，
H.S.Ferreira, et al. Box-Behnken design An alternative for the optimizationof analytical methods. Analytica Chimica Acta，2007，597 :179-186.)设计优化法来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。具体操作为取血浆样品按如图I所示的微波辅助方法与传统方法分别处理样品，并以传统方法作为参考，同时按表I所示采用Design-ExpertS. O. 5b软件进行实验设计，然后对所得数据进行处理，面积归一化后，将微波辅助肟化、衍生化方法所得的数据与传统方法所得数据进行相关性分析，以相关系数为指标，对各因素进行拟合，结果如表2所示；绘制各指标与两个自变量的三维曲面图，另外两个变量取中值，如图2a-f所示。根据所得结果，采用Design-Expert8. O. 5b软件得到理论的优化方案。以本发明的微波辅助方法与传统方法的相关系数为指标(越接近I越好)来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。微波技术辅助肟化技术优化条件为加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；微波技术辅助衍生化技术优化条件为加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应。本发明提供了一种微波辅助血浆样品前处理方法，该方法是将血浆样品去蛋白处理后，加入肟化反应试剂，混匀，密闭，在微波能量为60 73W的条件下微波辅助肟化75 125s后；加入衍生化试剂，在微波能量为200 260W的条件下微波辅助衍生化150 210s。上述的微波辅助血浆样品前处理方法，其中的肟化反应试剂是甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，加入量与血浆样品的体积比为I : 2。上述的微波辅助血浆样品前处理方法，其中的衍生化试剂是BSTFA TMCS (N，
O-双-三甲硅基三氟乙酰胺三甲基氯硅烷)=99 1，V/V，加入量与血浆样品的体积比为 I : 2。上述的微波辅助血浆样品前处理方法，较佳地，在微波能量为65W的条件下微波辅助厢化IOOs后；上述的微波辅助血浆样品前处理方法，较佳地，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180s。本发明还提供了上述微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用，如图I所示的“微波辅助方法”，具体步骤为A.采集动物模型组与对照组血液样品，分离血浆；B.将血浆进行蛋白沉淀处理，并在氮气流下挥干；C.加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；D.加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应；E.待样品冷却后加入内标溶液，混勻，并进样，采用GC/MS进行样品信息采集；F.对所采集的数据进行格式转化，然后采用XCMS软件对转化后的数据进行峰校正和峰积分等前处理。采用修正80%规则来去除缺失值，及去除某一组中出现频率(非零值)低于80%质谱离子。然后筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息。为校正质谱响应，对筛选后每个样品的总峰面积进行归一化。将归一化的数据导入到SIMCA-PVII. O软件(Umetrics, Sweden),经Par标度化后进行偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分析；G.多标准评价方法(Multi-criterion Assessment, MCA)获取差异性内源代谢物。本发明提供的新的样品前处理方法适用于血浆样品的处理，可以在达到样品处理要求，满足代谢组学分析需要的基础上，显著提高分析效率。


图I为本发明“微波辅助方法”与“传统方法”的操作流程图。图2中图2a为微波辅助肟化能量与微波辅助肟化时间的三维曲面图。图2b为微波辅助衍生化能量与微波辅助肟化能量的三维曲面图。图2c为微波辅助衍生化时间与微波辅助肟化能量的三维曲面图。图2d为微波辅助衍生化能量与微波辅助肟化 时间的三维曲面图。图2e为微波辅助衍生化时间与微波辅助肟化时间的三维曲面图。图2f为微波辅助衍生化能量与微波辅助衍生化时间的三维曲面图。图3为选择的理论所得微波辅助优化方案验证相关性曲线图。图4为传统方法的PLS-DA得分图。图5为传统方法获得的S-plot图。图6为传统方法获得的VIP图。图7为传统方法获得的含jack-knifed置信区间(CIJFjk)载荷图。图8为微波辅助方法的PLS-DA得分图。图9为微波辅助方法获得的S-plot图。图10为微波辅助方法获得的VIP图。图11为微波辅助方法获得的含jack-knifed置信区间(CIJFjk)载荷图。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例I.传统方法与本发明的“微波辅助方法”的比较操作流程如图I所示，具体实施方法如下I.血样的采集健康SD大鼠12只，体重200±10g，随机分成2组(正常组、模型组)。正常组按
3.5mg/kg体重腹腔注射生理盐水，模型组按3. 5mg/kg体重腹腔注射芥子气。由大鼠腹主动脉采集血液样本，3500rpm离心lOmin，分离上层血浆，置-20°C保存待测。2.血样的前处理2. I样品去蛋白处理移取于室温下解冻后的血浆100 μ 1，置于I. 5ml EP管中，按I : 3比例(v/v)加入300 μ I乙腈，润旋混合3min后，于12000rpm、4°C条件下高速离心IOmin,分取上清液200μ I至5ml玻璃离心管中，在55°C氮气流下吹干，以备进一步样品处理。2. 2传统的肟化和衍生化方法取2. I项下吹干的样品，加入50 μ I甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，混勻，密闭，35°C条件下肟化2h后，加入衍生化试剂(BSTFA TMCS = 99 1，v/v) 50 μ 1，在70°C条件下衍生化反应lh，反应结束后，振荡10s，室温下放冷，加入100 μ I内标溶液(O. lmg/ml 二十二烷的庚烷溶液)，混匀，转移至进样小瓶，待测。2. 3微波辅助肟化和衍生化取2. I项下吹干的样品，加入50 μ I甲氧胺吡啶溶液(15mg/ml)，混匀，密闭，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化IOOs后，加入衍生化试剂(BSTFA TMCS = 99 1，v/v) 50 μ 1，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180s，反应结束后，振荡10s，室温下放冷，加入100 μ I内标溶液(O. lmg/ml 二十二烷的庚烷溶液)，混匀，转移至进样小瓶，待测。3.代谢指纹图谱的获取分别将2. 2项下和2. 3项下处理好的样品采用气相色谱-质谱联用法(GC/MS)进行测定。仪器条件为，升温程序起始70°C保持2min后以6°C /min升至225°C并保持3min，再以10°C/min升至300°C保持7min ;进样量luL，不分流进样；进样口温度260°C;GC-MS传输线温度270°C ;离子源温度150°C ;电离电压70ev ;扫描方式全扫描，50_550m/Z ;扫描速率5张/s ;载气为高纯氦气，流速为O. 10mL/min。4.数据处理从GC-MS得到的原始数据(.raw)经Xconvert转换为通用数据格式(· cdf)后，进一步通过XCMS软件进行峰校正和峰积分，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵。XCMS 参数除设定 fwhm = 4, snthresh = 3, max = 200 和 profmethod= ”binlinbase”以外，其他参数均采用默认值。采用修正80%规则来去除缺失值，即去除在某一组中出现频率(非零值)低于80%的质谱离子。并筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息。为校正质谱响应，采用每个样品的总峰面积进行归一化。将归一化的数据导入到SIMCA-P VII. O软件(Umetrics, Sweden),经过Par标度化后,进行偏最小二乘投影判别分析(PLS-DA)分析。5.微波辅助肟化、衍生化方法的优化由于微波辅助肟化、衍生化反应受微波能量及微波时间的影响，因此，本发明采用Box-Behnken设计优化法来优化微波辅助肟化、衍生化方法的条件。具体操作为取QC样品先按2. I项下方法将血浆样品吹干，然后按2. 2项下处理样品作为参考标准，同时按表I所示采用Design-ExpertS. O. 5b软件进行实验设计，然后按“4.数据处理”项下方法对所得数据进行处理，面积归一化后，将微波辅助肟化、衍生化方法所得的数据与传统方法所得数据进行相关性分析，以相关系数为指标，对各因素进行拟合，结果如表2所示；绘制各指标与两个自变量的三维曲面图，如图2所示。根据所得结果，采用Design-Expert8. O. 5b软件得到理论的优化方案。表I Box-Behnken设计优化因素
权利要求
1.一种微波辅助血浆样品前处理方法，该方法是将血浆样品去蛋白处理后，加入肟化反应试剂，在微波能量为60 73W的条件下微波辅助肟化75 125秒后，加入衍生化试剂，在微波能量为200 260W的条件下微波辅助衍生化150 210秒。
2.根据权利要求I所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，其中的肟化反应试剂是15mg/ml的甲氧胺吡啶溶液，加入量与血浆样品的体积比为I : 2。
3.根据权利要求I所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，其中的衍生化试剂是N，O-双-三甲硅基三氟乙酰胺三甲基氯硅烷为99 1，V/V，加入量与血浆样品的体积比为1:2。
4.根据权利要求1、2或3所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，在微波能量为65W的条件下微波辅助肟化100秒。
5.根据权利要求1、2或3所述的微波辅助血浆样品前处理方法，其特征在于，在微波能量为230W的条件下微波辅助衍生化180秒。
6.一种如权利要求I所述的微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用。
7.根据权利要求6所述的微波辅助血浆样品前处理方法在血浆代谢组学分析中的应用，具体步骤如下 A.采集动物模型组与对照组血液样品，分离血浆； B.将血浆进行蛋白沉淀处理，并在氮气流下挥干； C.加入肟化反应试剂，在微波能量为60 73W的条件下微波辅助肟化75 125秒； D.加入衍生化试剂，在微波能量为200 260W的条件下微波辅助衍生化150 210秒； E.待样品冷却后加入内标溶液，混匀，并进样，采用GC/MS进行样品信息采集； F.对所采集的数据进行格式转化，然后采用XCMS软件对转化后的数据进行峰校正和峰积分等前处理，采用修正80%规则来去除缺失值，及去除某一组中出现频率低于80%质谱离子，然后筛选出每个保留时间下丰度最大的碎片离子的积分信息，为校正质谱响应，对筛选后每个样品的总峰面积进行归一化，将归一化的数据导入到SIMCA-P VlL O软件，经Par标度化后进行PLS-DA分析； G.多标准评价方法获取差异性内源代谢物。
全文摘要
本发明涉及分析化学和生物化学技术领域，传统的血浆代谢组学样品前处理为35℃下肟化2小时后70℃下衍生化1小时，工作量大且耗时效率低。本发明提供了一种微波辅助血浆肟化、衍生化的样品前处理方法，将血浆样品加入肟化反应试剂，在较低能量及较短时间的微波条件下进行肟化反应；加入衍生化试剂，在较高能量和中等时间条件下进行衍生化反应。本发明还将该处理方法应用于气相色谱-质谱联用法分析血浆代谢组学中。本发明的方法适用于血浆样品的处理，达到样品处理要求，满足代谢组学分析需要，显著缩短前处理时间，极大提高分析效率。
文档编号G01N1/44GK102680310SQ20121007500
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者娄子洋, 张俊平, 张黎明, 朱臻宇, 林泽彬, 柴逸峰, 洪战英, 范国荣 申请人:中国人民解放军第二军医大学