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专利名称：一种测定甘草及其炮制品中7种成分含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种中药成分含量的测定方法，特别是涉及一种应用高效液相色谱法同时测定甘草及其炮制品中7种成分含量的方法。甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhizauralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflate Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根及根茎。收载于中国药典 2010年版(一部)，味甘，平；归心、肺、脾、胃经。具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。主要产于内蒙古、甘肃、新疆、陕西、东北、山西等地区。主要有效成分为皂苷类和黄酮类化合物。甘草黄酮类的代表成分主要有甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素等；皂苷类的主要代表成分为甘草酸。现代研究表明，甘草酸可用于皮质激素的替代治疗并能防治肝炎，对慢性肝炎的肝细胞亦有良好的保护作用； 甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷等为代表的甘草总黄酮类，具有抗心肌缺血以及抑制艾滋病病毒增殖的作用；异甘草苷具有抗溃疡作用；甘草素、异甘草素具有显著的抗溃疡和解痉作用；异甘草素还具有雌性激素样作用，可以抑制乳腺癌细胞的增殖。2010版药典仅同时测定了甘草酸、甘草苷两种成分的含量，采用HPLC法固定波长进行了含量测定。评价指标较少，对药材质量的评价不够全面；且使用同一波长检测，系统检测灵敏度有一定局限性。因此，需要建立一种选取每种待测指标最大吸收波长，同时测定多指标的含量测定方法。采用本方法一波长切换高效液相色谱法建立了同时测定甘草药材中7种成分含量的分析方法，以更好地控制甘草质量。该方法利用C18色谱柱，选取合适的流动相系统，利用波长切换技术，用梯度洗脱的方式使7种成分达到了很好的分离。经过线性关系、精密度、 准确度、稳定性、重复性、加样回收率等方法学考察，结果表明，该方法简便、快速、准确、重复性好，为更好地控制甘草药材及其炮制品的质量提供依据。

发明内容
本发明的目的是提供一种全面、准确、简便的甘草成分含量测定方法。该测定方法选择了甘草及其炮制品中7种成分作为含量测定指标，评价信息更加全面。利用HPLC法进行梯度洗脱，特别加入了波长切换技术，该技术选用每种待测指标的最大吸收波长进行检测，保证仪器在测定每种物质时的检测灵敏度达到最大，使得测定结果更加准确、简便、快速。采用的技术方案是
一种测定甘草及其炮制品中7种成分含量的方法，其特征在于采用波长切换和梯度洗脱同时测定7种成分含量，包括下述工艺步骤
1、供试品溶液的制备取不同来源及不同炮制品甘草药材粉末，过60目筛，约0.3 Ig,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定浓度的乙醇50 100ml，密塞，称定重量，超声处理20 50min，放冷，再称定重量，用相同浓度的乙醇补足损失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得；
2、混合对照品溶液的配制精密称取芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素对照品适量，分别加甲醇溶解，制成浓度分别为0. 3 2. Omg-mL-1 的对照品储备液，备用。分别精密量取一定体积上述对照品储备液溶液，加甲醇稀释，制成每Iml含芹糖甘草苷20 30μβ、甘草苷30 50μβ、芹糖异甘草苷20 30μβ、异甘草苷1 10Pg、甘草素1 lOPg、甘草酸100 200μβ、异甘草素1 的混合溶液，即得。3、甘草及其炮制品中7种成分含量的测定取步骤1制备的供试品溶液和混合对照品溶液各一份，上色谱柱，进样测定并计算样品中7种成分的含量。色谱柱采用Cw柱， 流动相为乙腈与一定浓度磷酸水混合液；梯度洗脱采用七次洗脱，第一梯度洗脱采用乙腈 磷酸水为15% :85%的洗脱液；第二次梯度洗脱采用乙腈磷酸水为25% :75%的洗脱液；第三梯度洗脱采用乙腈磷酸水为32% 68%的洗脱液；第四梯度洗脱采用乙腈磷酸水为34% 66%的洗脱液；第五梯度洗脱采用乙腈磷酸水为36% 64%的洗脱液；第六梯度洗脱采用乙腈磷酸水为42% 58%的洗脱液；第七梯度洗脱采用乙腈磷酸水为51% 49%的洗脱液；检测波长选择第一梯度洗脱阶段检测波长为276nm，第二梯度洗脱阶段检测波长为360 nm, 第三梯度洗脱阶段检测波长为276 nm，第四梯度洗脱阶段检测波长为对8 nm，第五梯度洗脱阶段检测波长为370 nm，第六梯度洗脱阶段检测波长为254 nm，第七梯度洗脱阶段检测波长为370 nm，流速为0. 5—2. OmL/min ；柱温20—30°C ；在上述色谱和梯度洗脱条件下能精确测得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸和异甘草素含量， 理论塔板数以甘草酸计不低于3000，分离度> 1. 5 ；上述百分比为体积百分比。线性关系的考察分别精密量取上述混合对照品溶液2、5、10、15、20μ 注入高效液相色谱仪，测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。精密度考察取甘草药材样品粉末0.5 l.Og，精密称定。按供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下连续进样6次，测得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素的RSD值均应小于1。重复性考察取甘草药材样品6份，每份粉末0.5 l.Og，精密称定。按供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下进样，测得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素的RSD值均应小于m。稳定性考察取同一供试品溶液，在室温下放置，在Mh内，分别取不同时间点进样分析，测定峰面积。芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素峰面积的RSD均应小于m。加样回收率考察称取已知含量的甘草药材6份，每份约0. 3 0. 5g，精密称定。 分别准确加入芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素对照品储备液 2. 0 3. 0ml,3. 0 4. OmUO. 4 0. 5ml、1. 7 2. OmUO. 4 0. 8ml,5. 0 6. Oml.O. 2 0. 3mL·按供试品溶液制备的方法操作，在上述色谱条件下进行测定，计算回收率均应大于95%，RSD均应小于3. 0%。在流动相系统的选择方面，本方法分别考查了乙腈-水、乙腈-不同浓度的磷酸水、甲醇-水等不同流动相系统，从中筛选出色谱基线平稳，7种成分的分离效果好的流动相系统。在检测波长的选择方面，由于7种成分结构不同，本方法利用可变波长紫外检测器波长切换的功能，选择各成分最大吸收波长为检测波长。结合7种成分的出峰顺序，依次为芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸、异甘草素，他们的最大吸收波长分别为276nm、276nm、360nm、360nm、276nm、254nm、370nm。最终达到了检测灵敏度高， 干扰小的目的。 本发明测定结果准确、简便、快速，甘草及其炮制品有效成分含量评价信息更加全面，完善了质量标准。
权利要求
1. 一种测定甘草及其炮制品中7种成分含量的方法，其特征在于采用波长切换和梯度洗脱技术，同时测定7种成分含量，包括下述工艺步骤(1)、供试品溶液的制备取不同来源及不同炮制品甘草药材粉末，过60目筛，0.3 Ig,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入一定浓度的乙醇50 100ml，密塞，称定重量，超声处理20 50min，放冷，再称定重量，用相同浓度的乙醇补足损失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得；(2)、甘草及其泡制品中7种成分含量的测定取步骤1制备的供试品溶液，上色谱柱，进样测定样品中7种成分的含量；色谱柱采用C18柱，流动相为乙腈与一定浓度磷酸水混合液；梯度洗脱采用七次洗脱，第一梯度洗脱采用乙腈磷酸水为15% 85%的洗脱液；第二次梯度洗脱采用乙腈磷酸水为25% 75%的洗脱液；第三梯度洗脱采用乙腈磷酸水为 32% 68%的洗脱液；第四梯度洗脱采用乙腈磷酸水为34% 66%的洗脱液；第五梯度洗脱采用乙腈磷酸水为36% 64%的洗脱液；第六梯度洗脱采用乙腈磷酸水为似％ 58%的洗脱液；第七梯度洗脱采用乙腈磷酸水为51% 49%的洗脱液；检测波长选择第一梯度洗脱阶段检测波长为276nm，第二梯度洗脱阶段检测波长为360 nm,第三梯度洗脱阶段检测波长为 276 nm，第四梯度洗脱阶段检测波长为对8 nm，第五梯度洗脱阶段检测波长为370 nm，第六梯度洗脱阶段检测波长为254 nm，第七梯度洗脱阶段检测波长为370 nm，流速为0.5— 2. OmL/min ；柱温20—30°C ；在上述色谱和梯度洗脱条件下能精确测得芹糖甘草苷、甘草苷、 芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸和异甘草素含量，理论塔板数以甘草酸计不低于 3000，分离度> 1.5 ；上述百分比为体积百分比。
全文摘要
一种测定甘草及炮制品中7种成分含量的方法，是取炮制品甘草粉末过60目筛，约0.3-1g，加乙醇50-100ml，超声处理20-50min，放冷后同70%乙醇补失量后，上C18色普柱，并进行七次梯度洗脱，洗脱液为乙腈与磷酸水混合液，7次洗脱液乙腈与磷酸水配比分别为15%85%、25%75%、32%68%、34%66%、36%64%、42%56%、51%49%，对应7次洗脱的波长选择为276nm、360nm、276nm、248nm、370nm、254nm和370nm，流速为0.5-2.0ml/mis，柱温20-30℃。能测得芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、甘草素、甘草酸和异甘草素含量，塔板数以甘草酸计不低于3000，分离度＞1.5。
文档编号G01N30/74GK102297917SQ201110027139
公开日2011年12月28日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者于天禹, 周萃, 夏林波, 张振秋, 张鹏, 徐晶, 才谦, 李可强, 李峰, 杨燕云, 訾慧 申请人:辽宁中医药大学