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专利名称：系列琼胶低聚糖的制备和检测方法
技术领域：
本发明涉及了一个天然的系列有机聚合物一琼胶低聚糖。特别是涉及一个系列琼胶低聚糖的制备和检测方法。
利用琼胶酶制备琼胶低聚糖的研究仍然着重于对结构的分析。其降解产物多为对最终产物的研究，。有关琼胶的降解无论是酸解还是酶解主要是在降解终产物的分离和结构分析方面的研究和报告。没有降解琼胶的全部可溶性的低聚糖制备和检测方法的报告和相关专利的提出。国外对降解琼胶的研究多集中在对最终产物的结构分析，而国内对降解琼胶没能提出有效地检测方法。
Jorge Vera等1998年(Identification of a Marine Agarolytic Pseudoalteromonas Isolate andCharacterization of Its Extracellular Agarase.Applied and Environmental Microbiology.，1998 64(11)4378-4383)利用微生物产生的琼胶酶降解琼胶，NMR检测降解的终产物是新琼四糖和新琼六糖。
美国专利6,599,729(A-AGARASE AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME.，Jun Tomono，Kyoto(Japan)；Yoshiko Nomura，Kyoto(Japan)；Hiroaki Sagawa，Shiga(Japan)；Takeshi Sakai，Aomori(Japan)；andIkunoshin Kato，Kyoto(Japan).，Assigned to Takara Shuzo Co.，Ltd.，Kyoto(Japan).)报道了利用基因工程的方法生产具有α-琼胶酶活性的多肽和利用多肽制备琼胶寡糖的方法，其最终的产物为琼二糖，琼四糖和琼六糖。
美国专利5,418,156(Agarase enzyme system from alteromonas strain 2-40.，Stosz；Sarah K，et al)报道了琼胶酶降解琼胶的最终产物为新琼二糖，新琼四糖和新琼六糖。
美国专利5,834,257(alpha-agarase and production process of oligosaccharides and monosaccharides.，Sugano；Yasushi(Tokyo，JP)；Terada；Ichiro(Kanagawa，JP)；Kodama；Hisashi(Tokyo，JP))利用vibrio sp.JT0107产生的琼胶酶制备琼寡糖，最终产物为琼五糖，琼三糖，3，6-内醚-L-半乳糖。以上均没有关于系列低聚糖产物的报道。
中国专利申请号00136891.8报道了一种利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，可将包括纤维素、人参、黄芪、甘草等天然产物以及壳聚糖、果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等多糖原料降解成具有一定生物活性的小分子的功能物质和聚合度为3-20的寡聚糖。但无系列低聚糖产品的制备和检测方法。
中国专利申请号00115094.7报道了一种琼胶低聚糖及琼胶寡糖的制备方法。此方法使用酸降解，且没有说明寡糖的不同分子量范围的制备和检测方法。
本发明的目的是提供一种制备过程简单，结果清晰的一系列琼胶低聚糖的制备方法，以及对低聚糖产物组成和分子量范围的检测方法。该降解产物包括了分子量小于5000Da的水溶性琼胶低聚糖的任意片断。该系列产品可用于有效地活性分析，用于药物和保健食品的开发。
系列琼胶低聚糖的制备和检测方法，包括使琼胶溶于水，加入琼胶酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，浓缩后乙醇分级，冷冻干燥后用离子交换色谱分离琼胶低聚糖片段，基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)确定低聚糖片断的组成和分子量范围。
本发明的制备方法对环境设备要求不高，简单易行，成本低廉，适于推广。
下面通过实施例说明本发明。
2％的琼胶底物1000mL.，加热使其充分溶解，冷却至40℃左右。加入100mL琼胶酶制品，35℃反应12h，沸水浴加热使酶失活加入2倍体积的乙醇离心3000rpm，10min去除杂质，得到上清液。旋转蒸发得到浓缩液，依次加入同等体积的乙醇，调pH7.0-8.0，依次离心得到系列低聚糖产品。
乙醇分级的降解产物采用阴离子交换柱进行分离。将具有相近分子量，不同硫酸基团的降解产物分离开。
基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析降解产物以9倍体积乙醇分级得到产物为例，经阴离子交换柱层析分离出两个样品峰F1和F2。质谱分析(见

图1，图2)可知F1为不带有硫酸基、聚合度6-22的琼胶低聚糖的混合物。
F2为带有1个硫酸基、聚合度16-24的偶数糖的混合物。
本发明通过控制琼胶酶水解琼胶的工艺条件制备不同聚合度的低聚糖片段。再通过乙醇分级法将降解产物进行分级。用阴离子交换柱层析将有硫酸基团取代和没有硫酸基团取代的，具有相同分子量范围的分级产物进行分离。基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析得到不同聚合度的降解产物。利用此种方法可获得分子量低于5000Da的水溶性琼胶低聚糖的任意片段。
权利要求
1控制琼胶酶水解琼胶的工艺条件制备不同聚合度的低聚糖片段。再通过乙醇分级法将降解产物进行分级。用阴离子交换柱层析将有硫酸基团取代和没有硫酸基团取代的，具有相同分子量范围的分级产物进行分离。
2保护利用基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测低聚糖片断的组成和分子量范围。
全文摘要
本发明涉及了一个天然的系列有机聚合物－琼胶低聚糖。特别是涉及一个系列琼胶低聚糖的制备和检测方法。本发明的目的是提供一种制备过程简单，结果清晰的一系列琼胶低聚糖的制备方法，以及对低聚糖产物组成和分子量范围的检测方法。该降解产物包括了分子量小于5000Da的水溶性琼胶低聚糖的任意片断。该系列产品可用于有效地活性分析，用于药物和保健食品的开发。系列琼胶低聚糖的制备和检测方法，包括使琼胶溶于水，加入琼胶酶进行反应，用沸水浴加热使酶失活，离心后除去沉淀杂质，浓缩后乙醇分级，冷冻干燥后用离子交换色谱分离琼胶低聚糖片段，基体辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI－TOF－MS)确定低聚糖片断的组成和分子量范围。本发明的制备方法对环境设备要求不高，简单易行，成本低廉，适于推广。
文档编号G01N33/00GK1546500SQ200310114439
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者江晓路, 王静雪 申请人:中国海洋大学