专利名称：通过对定向序列聚合物的组合物进行基于血清蛋白的检测，改进含定向序列聚合物的组 ...的制作方法
通过对定向序列聚合物的组合物进行基于血清蛋白的检测，改进含定向序列聚合物的组合物的设计、生物利用度和
效能的方法
相关申请本申请要求2009年11月17日递交的美国临时申请No. 61/281，470和2010年9月27日递交的美国临时申请No. 61/386,909的优先权益。
背景技术：
复杂的肽混合物是肽治疗剂的一个新兴的类型，其中考帕松(醋酸格拉默)是一个领先的例子。复杂的肽混合物包括有一个或几个共享特征(如氨基酸组成和/或序列 相似)的多样性肽，并包括改变了的肽配体(APL)、肽库、肽文库、含随机序列聚合物(RSP)的组合物(如醋酸格拉默，及W003/029276、WO 05/112972和WO 05/085323中公开的组合物)及含定向序列多肽(DSP)的组合物(见例如WO 2007/120834、WO 2009/051797和WO2009/128948)。DSP和RSP组合物在如下方面是相似的二者都包含大量不同的肽，它们的序列在某些确定的公共参数上是随机变化的。在RSP组合物中，序列的相似性起源于肽的氨基酸含量有限，因为所有肽由相同的为数不多的氨基酸以随机顺序排列而组成。在DSP组合物中，序列的相似性则起源于共享的基础肽序列，其中某些氨基酸位置被有限的氨基酸标记以有限的频率随机地取代。现有技术中已有检测简单多肽的方法，但是只有较少方法适合于检测和测定复杂的肽混合物。检测定向序列聚合物(DSP)有效血浆浓度的方法是复杂的，因为与具有明确氨基酸序列的各别肽相比，DSP是肽的复杂混合物。需要对多种制造方法制备的DSP组合物的均一性和组成进行评估的改进方法。确定DSP组合物在体内的状态具有重要的免疫学意义，因为取决于给药途径和/或给药频率及血清蛋白与DSP的结合，这种肽混合物可能激发初级炎症反应(THl型)或初级调控反应(TH2型)，导致其在受试对象中的药代动力学和药效学改变。更加严谨的设计和坚持给予DSP组合物可能提高治疗效果或者减少潜在的不良炎症应答反应。因此，为了治疗目的，需要定量分析DSP组合物的方法，例如促进这种肽混合物在体内状况的评估和确定合适的剂量及给药方式。
发明概述本申请提供检测和评价DSP组合物的改进的方法。本发明提供检测和定量分析DSP组合物的方法。本发明提供基于肽亚组与特定捕获多肽相互作用的测定，和富集DSP组合物中多肽亚组亚组的方法。本发明进一步提供对需要接受治疗的患者给予DSP组合物的方法，其中可根据上述检测和定量方法来确定或评估给药方案和剂量。本申请还提供检测DSP组合物的方法，包括以下步骤(a)将所述DSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白质生物液体接触；(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述结合蛋白产物；(e)将(c)所述蛋白质附着于定量检测所述DSP组合物用的工具上；和(f)测定所述DSP组合物与(e)所述蛋白每一种的结合。本说明书也提供一种改进DSP组合物设计的方法，包括以下步骤(a)将所述DSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述的结合蛋白产物；(e)使(C)所述蛋白质附着于定量检测DSP组合物用的工具上；(f)测定所述DSP组合物与(e)所述蛋白质结合的每一种肽；(g)调整所述DSP组合物的设计以增加或减少与(e)所述一种或多种蛋白质的结合；(h)重复步骤(f) ；(i)任选地重复步骤(f_h)，其中调整所述DSP组合物的设计可导致一种或多种效果提高生物利用度、减少毒性和提高效能。此外，本申请提供一种检测DSP组合物中肽种类的方法，包括以下步骤(a)将所述DSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；(C)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所 述结合蛋白制品；(e)使(C)所述蛋白质附着于固相支持物上；(f)使(e)所述固相支持物与所述DSP组合物接触；(g)测定所述DSP组合物中每种肽与(f)所述固相支持物的结合。另外，本申请提供一种改进DSP组合物中肽种类设计的方法，包括以下步骤(a)使所述DSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；(C)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述结合蛋白制品；(e)使(C)所述蛋白质附着于固相支持物上；(f)使(e)所述固相支持物与所述DSP组合物接触；(g)测定所述DSP组合物中与(f)所述固相支持物结合的每一种肽；(h)调整所述DSP组合物的设计以增加或减少与(f)所述一种或多种蛋白质的结合；(i)重复步骤(g) ；(j)任选地重复步骤(g_j)，其中调整所述DSP组合物肽种类的设计可导致一种或多种效果提高生物利用度、减少毒性，和提高效能。通过应用本申请所述方法，研究者不仅可以更可靠地检测DSP组合物中的低含量组分，而且可以特异性地检测DSP组合物中与生物活性如毒性或效力有关或对其有贡献的肽种类。本发明的基础是，发现YEAK或YFAK组合物中的一种肽或多种肽可与某些具有蛋白质性质的物质特异性结合。相反，具有蛋白质性质的物质在本说明书称为“捕获多肽”，这种物质较佳地也结合DSP组合物。相反，一旦“捕获多肽”被鉴定，便可利用一种或多种这类捕获多肽定量分析DSP组合物中所含的肽，并分离DSP组合物中功能更优良的肽亚组，或者根据结合特异性给DSP组合物中的各组分分类。为了实施本发明，鉴定到能与(DSP组合物所含)肽结合的捕获多肽后，即可将其制备成可用于实施本发明的形式，即对其进行分离和纯化，纯度达到足以结合(DSP组合物所含)肽而不受到存在的其他组分干扰。本发明的一个方面提供了一种评价或测定DSP组合物不同制造的制剂、用不同方法制造的、或不同的制造后加工的产品的差异的方法。本发明的具体方法是，比较不同的DSP组合物制品与捕获多肽的结合来确定各制品之间的相似性和/或差异。本发明的另一方面提供一种定量分析DSP组合物或含DSP组合物的样品中所含肽的方法。本发明的一些实施方式是检测给予DSP组合物后其在体内的生物可利用含量或浓度(如血浆浓度)的方法。本发明的方法是检测受试对象组织中存在的DSP组合物，所述受试对象先前曾接触过DSP组合物或用其治疗过，在这种接触后立即、或在接触后至少大约10、20、30、或45分钟，或者 1、2、4、6、12、24、36 或 48 小时，或 3、4、5、6、7 或 10 天，或 2、3、4、6、8 或 12 周进行
一次或多次所述方法的检测。本发明的一种具体方法是检测哺乳动物血清或血浆中存在的DSP组合物的各组分，所述哺乳动物在进行所述方法前曾在上述期间内用所述DSP组合物治疗过。在某些具体实施方案中，所述哺乳动物是人。在某些实施方案中，本发明方法包括通过使DSP与一种或多种预先确定的捕获多肽结合然后用例如免疫检测方法检测DSP组合物的存在，和任选地检测其含量。因此。本发明的一个方面包括选择或鉴定能与DSP组合物优先结合的血清蛋白。在某些实施方案中，鉴定一种或多种血清蛋白的方法包括使DSP组合物与包括血清的生物样品接触；如果样品中存在DSP组合物中的肽，则检测其与血清中一种或多种组分的结合；分离得到结合组分，鉴定一种或多种结合组分。在一些实施方式中，分离这种结合组分的方法是，使样品接触设计的能与DSP组合物所含肽结合的亲和柱、随后洗脱结合组分，然后鉴定结合组分。任何能与DSP组合物所含肽结合的血清结合蛋白可用于上述方法。合适的检测方 法包括直接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹法、免疫流式细胞检测法、放射免疫检测法(RIA)，或者任何其他能定量检测特异性抗原的免疫学检测方法。本发明的一个方面是一种检测生物样品中DSP组合物存在与否的方法，包括使生物样品与至少一种捕获多肽接触；检测捕获多肽与DSP组合物有无结合，其中存在这种结合表明在生物样品中存在DSP组合物中的肽组分。可进一步延伸用这种方法检测样品中DSP组合物的含量或浓度。本发明的另一个方面是测量DSP组合物在哺乳动物中的生物利用度的方法，包括给予哺乳动物一定剂量的DSP组合物；取得对象的生物样品；使该生物样品与至少一种捕获多肽接触；进而检测该生物样品中DSP组合物的生物利用度或者生物可利用的程度。本发明的另一个方面是提供给予哺乳动物对象DSP组合物的方法，给药量取决于用上述检测方法或者本说明书描述的其他方法检测的该剂量的生物可利用部分。在某些实施方式中，本发明方法还包括对照样品，和进行药效学试验，通过比较样品与对照两者的检测结果，测定生理标志(例如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、免疫调节剂，或者这些功能蛋白的效应物或调节剂)的变化，并确定能引起所需药效学参数变化的有效剂量。在某些实施方案中，观察对象报告的行为改变、自觉症状改变，例如疼痛或疾病症状的减轻或其他间接效应。在一些具体实施例中，所述哺乳动物是小鼠或大鼠等啮齿动物，其他的实施例中，所述对象是人。本发明这个方面的某些实施方案，提供确定给予需要的受试对象DSP组合物合适剂量的方法包括(a)给予受试对象一个剂量DSP组合物；(b)取得受试对象的生物样品；
(c)使此生物样品与至少一种捕获多肽接触；(d)检测该生物样品中DSP组合物各组分的水平；(e)任选地用不同剂量重复步骤(a)至(d) ；(g)将所测得的水平与预先确定的生物样品中的DSP组合物合适水平作比较；其中所述合适剂量是导致生物样品中DSP组合物达到预定合适水平的剂量。本发明的某些实施方案提供预测DSP组合物所含的有生物利用价值组分的方法。这种方法包括使含DSP组合物的样品与DSP组合物给予和递送后预期可到达部位原位的预定捕获多肽接触，测定DSP组合物与该捕获多肽的结合。被大量DSP组合物结合，可表明较大比例的肽是与治疗和/或生理相关的肽，结合较紧密(对每种肽测定其解离常数)可能表示延长那些肽体内半衰期的保护作用。本发明的又一个方面提供根据从实验对象获得的数据预测拟给予治疗对象(如人)的DSP组合物的治疗有效量的方法。在某些实施方案中，该方法包括给予非人哺乳动物实验对象DSP组合物，测定该剂量的生物可利用部分(例如用本说明书所述的定量测定方法)，测定功能读出，根据从哺乳动物实验对象获得的数据和治疗对象与实验对象之间的相关比率，预测拟给予治疗对象的DSP组合物的治疗有效量。为了本发明的目的，“功能读出”可以是受试对象的表型或功能、受试对象细胞的表型或功能、或受试对象产生的一种或几种液体的组成。功能读出还可包括或者包括测量一种或几种生物合成或代谢产生的组分，如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、趋化因子、生长因子、免疫调节剂，或所述功能读出的效应物或调节剂。在某些实施方式中，检测步骤可以各种有规律或无规律的时间间隔后重复进行，来测定给予DSP组合物后其生物利用度、代谢和/或清除的时间进程。在某些实施方案中，可用此方法测定一组DSP组合物的血浆半衰期。在又一个实施方案中，可用此方法 测定DSP组合物中一种肽类的半衰期。在具体实施方案中，实验对象是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。本发明另一个方面提供通过给予DSP组合物治疗患者的有效方法，包括通过合成肽(例如同时利用每轮延伸合并的氨基酸单体)制备DSP组合物，制备所述DSP组合物的药学上可接受的制剂，给予治疗对象所述DSP组合物，取得治疗对象的组织样品，测定所述组织样品中DSP组合物的含量和/或浓度，测定功能读出，将DSP组合物含量与功能读出相关联，及调整给予治疗对象的DSP组合物剂量以改善功能读出。本发明的另一个方面是治疗或预防治疗对象产生不希望有的免疫应答反应的方法，包括给予治疗对象合适剂量的DSP组合物，确定合适剂量可通过(i)给予治疗对象一个剂量的DSP组合物；(ii)取得治疗对象的生物样品；(iii)使该生物样品与至少一种捕获多肽接触；(iv)检测生物样品中该捕获多肽的水平；(V)任选地用不同剂量重复步骤(i)至(iv) ;(vi)将测得的水平与预定的生物样品中DSP组合物的合适水平作比较；其中合适剂量是导致生物样品中DSP组合物达到预定合适水平的剂量。在前述某些方面和实施方案中，捕获多肽是标记的多肽。在某些实施方案中，捕获多肽附着于固相支持物。在某些实施方案中，检测和/或分离包含捕获多肽的复合体和DSP组合物的一个或多个肽组分。在具体实施方案中，用对所述复合体而不是对捕获多肽或DSP组合物的肽组分具有特异性的抗体来检测和/或分离这种复合体。本发明另一个方面提供一种分离所选择的组成DSP组合物的肽亚组的方法。在特别的例子中，该亚组由氨基酸序列不同的一种或多种肽组成。在其他例子中，可根据结合特异性利用捕获多肽对DSP组合物所含组分分类。在某些实施方案中，分离含DSP组合物样品中肽的方法包括(a)使该样品与至少一种捕获多肽接触；(b)分离混合物中结合于捕获多肽的肽。在这样的实施方案中，捕获多肽附着于固相支持物上。在一些实施方式中，捕获多肽是表位示踪或标记的多肽。在一些实施方式中，该方法还包括分离与捕获多肽结合的肽，以分离得到这些肽。在具体实施方式
中，该方法还包括测定该分离肽的特性，例如合并的分离肽中的氨基酸组成和/或分离肽的氨基酸序列。
在某些实施方案中，鉴定在受试对象中DSP组合物的生物可利用肽的方法包括(a)给予受试对象DSP组合物；(b)在执行步骤(a)后取得受试对象的生物样品；(c)鉴定该样品中结合于至少一种捕获多肽的肽。在某些实施方案中，鉴定能结合捕获多肽的肽亚组的方法包括按拟定方案制备DSP组合物，使所述DSP组合物与预先确定的捕获多肽(如适合作为体内靶标或运载体的多肽)接触，测定DSP组合物中的结合肽，鉴定能区别结合肽和未结合肽的特征，制备能反映一种或多种差别特征的改进的DSP组合物。本发明的另一个方面是改进含DSP组分的组合物制备工艺的方法。在某些实施方案中，根据鉴定结合捕获多肽的肽亚组的上述方法设计DSP组合物。在某些实施方案中，设计的DSP组合物其氨基酸组成和/或氨基酸序列接近于结合捕获多肽的肽亚组的氨基酸组成和/或氨基酸序列。在某些实施方案中，DSP组合物与参比DSP组合物相比效力增强，其中参比DSP组合物与接触捕获多肽的最初DSP组合物的效力相同或基本相同。在其他实施方式中，DSP组合物的毒性比参比DSP组合物低。 在可替代的实施方案中，一种方法包括按拟定方案制备DSP组合物，配制含DSP的组合物，通过检测功能读出的水平或程度确定所述组合物中生物可利用的DSP组分的含量，将功能读出与标准值作比较，和调整拟定方案或组合物的配方以获得满意的生物利用度。本发明还有一个方面是通过将DSP组合物(例如参比DSP组合物或用本说明书所述方法产生的改进的DSP组合物)或DSP组合物的一个组分与受关注的治疗剂缔合而使该药物靶向特定组织，其中所述DSP组合物或其组分与具有组织特异性靶向性能的捕获多肽结合，可将这种缔合药剂给予患者使所述药物靶向能与相应捕获多肽结合的组织。本发明这一方面的一些实施方式提供了将治疗剂转运到治疗对象特定组织的方法，该方法包括(a)使DSP组合物与组织特异性肽接触并分离混合物中结合于该组织特异性肽的肽，得到标记肽；(b)将标记肽与治疗剂偶联，(C)给予治疗对象该偶联物。本发明的其它实施方式包括通过上述方法的步骤(a)和(b)制备这种靶向治疗剂的方法，及用此方法制备的靶向治疗剂。本发明的又一个方面是上述方法之一中有用的组合物。本发明这一方面的一个实施方式是一种用于检测生物样品中DSP组合物的组合物，这种组合物包含至少一种捕获多肽。在一些实施方式中，所述捕获多肽选自正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中的一种组分，哺乳动物HDL蛋白质组的一种组分，哺乳动物LDL蛋白质组的一种组分，补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(BLAST检索表明它是IgM重链)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，IgM的C链，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK轻链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
在一些具体的实施方式中，捕获多肽可以是血清结合蛋白。在更具体的实施方式中，捕获多肽选自α-1-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-I、α-1-Β-糖蛋白、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白D和前白蛋白，或选自本段落前一段所枚举的捕获多肽，或选自本说明书公开的血清多肽。在上述任何一个实施方式中，DSP组合物所含肽可在生理上相关的其它组分存在下与捕获多肽(例如血清蛋白)进行结合。在具体实施方式
中，其它组分是脂质，如胆固醇或甘油三酯。在具体实施方式
中，其它组分是除捕获多肽外基本上没有蛋白成分的HDL或LDL复合物。
附图的简单描述图I是测定DSP组合物与血清结合蛋白(已结合于支持物上)结合所用的试验的示意图。在血清蛋白被鉴定后，将其结合于固相支持物。将DSP组合物(单独或包含于血清中)加到支持物上。加入抗DSP组合物(或抗DSP组合物与血清蛋白的偶联物)的第一 抗体，再用第二抗体和检测试剂检测第一抗体与其靶标的结合。图2显示当抗体结合于它们的靶标后，结合了抗YFAK和抗YEAK抗体的HRP组合物的Α450比色吸光度。靶标包括含有与正常人血清中所含(或所加)血清蛋白结合的YEAK或YFAK肽的复杂肽混合物。在复杂肽混合物浓度较高时，用抗YEAK或YFAK抗体检测的偶合物高于较低浓度复杂肽混合物。在病人中，12. 5ng/mL对应于大约2mg剂量。图3显示能结合PI-2301或考帕松(Copaxone)的血清蛋白列表。血清蛋白的来源是正常小鼠血清或正常人血清(已标明)。PI-2301可以是乙酰化或非乙酰化的。用抗YFAK和抗YEAK抗体识别PI-2301或考帕松的结合复合体，并用第二抗体和检测试剂加以检测。洗脱该复合体中的血清蛋白并鉴定。根据检测试剂的A450吸光度给蛋白评分。与背景吸光度相比，70分对应的P值< O. 001，认为具有统计学显著意义。图4显示小鼠静脉内给予4mg/kg或皮下给予21mg/kg剂量的YEAK后血清中的YEAK,用比色法和偶联有HRP的抗-YEAK抗体检测YEAK与其结合于正常人血清所含血清蛋白的靶标YEAK肽结合后的A450吸光度。该图显示，给予GA(乙酸格拉默)片段后约15分钟,GA达到了血清最高浓度1800ng/mL。皮下给予Copaxone 的估计生物利用度为静脉给予Copaxone⑧的12%。给药后2小时仍可测到GA组分。图5显示给予小鼠YEAK后血清或血浆中对YEAK应答产生的可溶性因子紧急释放的示范例，此例中为CCL22，也称为MDC。如该图所示，皮下给予小鼠的YEAK剂量与观察到的最大CCL22血浆浓度之间存在线性相关。图6显示用LC-MS观察从固定于CNBr-S^h柱的YEAK片段洗脱所得血清蛋白的肽图像。用Mascot搜索引擎鉴定肽序列。简言之，将胰蛋白酶消化产生的YEAK片段偶联于溴化氰Sepharose (CNBr-Seph) 4b,与人或小鼠血清一起室温培育2小时。用0. IM甘氨酸-盐酸，PH 2. 8液洗脱结合于YEAK片段的血清蛋白，在50%甲醇/50mM碳酸氢铵中用胰蛋白酶消化，干燥后用液相色谱法(LC)分离，除去溶剂，电离后喷雾到质谱仪(MS)中，直视观察并用Mascot搜索引擎鉴定。图7显示用图I所示的本发明方法进行ELISA试验，其中，将YEAK加入到男性和女性正常人血清后合并男性和女性正常人血清。该试验显示检测血清YEAK浓度的线性范围在l-100ng/ml之间。用小鼠血清或用无关对照，如抗匙孔戚血兰蛋白(KLH)多克隆血清，不能重复该试验。图8 显示第 P53218 和 119142 批次 Copaxone (YEAK)分子量的 SE-HPLC 图形，二批的图形相似。图9显示用图I所示本发明方法检测图8中两批Copaxone⑧的结果。
图10显示，对图8和图9所用的两批Copaxone 作的生物试验，其中单核细胞系RAW264. 7细胞接触YEAK后以浓度依赖方式释放CCL22。图11显示，用MALDI-T0F检测，长度明确不同的YEAK共聚体的实际平均分子量与理论平均分子量之间有严格的线性关系。将计算的理论值乘以共聚体的氨基酸长度，即
20、40、60和80乘以一个氨基酸加一个水分子的理论平均分子量。用Y、E、A和K各自的质量减去在氨基酸偶联过程中丢失的一个水分子的质量，计算出一个氨基酸的理论质量，这4个氨基酸的比例为1.0 : 1.5 : 4.5 : 3.6。 图12显示固相合成制备的长度不同YEAK共聚体的氨基酸分析，按100个氨基酸标准化后的输出比例，以及对图8、9和10所示的两批Copaxone 进行的相同分析。用含20、40、60和80个氨基酸的YEAK共聚体产生标准曲线。为了比较，也用Copaxone产生标准曲线。图12显示YEAK共聚体的大小与基于竞争性ELISA的PK试验检测结果之间的关系。20-聚YEAK共聚体的抑制作用很�。�80-聚YEAK共聚体产生的标准曲线与用Copaxone获得的曲线重叠。图13显示ELISA试验结果,其中家兔多克隆血清的Ig组分与Copaxone 相互作用强烈，表明随着固相合成的YEAK共聚体长度增加，其识别能力也提高。图14显示用先前PCT公开文本W02009/075854(其内容整体纳入本说明书作为参考)所描述的PK方法与固相合成的YEAK共聚体所作的ELISA试验结果，证明YEAK共聚体的大小与用上述试验方法测得的结果之间相关。图15显示，单核细胞系RAW264. 7细胞与图12、13和14所示固相合成的大小不同的共聚体一起培育后，随着共聚体长度的增加，CCL22的产量也增加。图16显示，图8、9、10和12所用的两批Copaxone 与图12、13、14和15所用的固相合成的长度不同的YEAK共聚体,能在体内诱导用2. 5mg/kg Copaxone⑧每周一次X 3周免疫的小鼠的脾细胞增殖。最后一次皮下给予后，收集脾脏，制备细胞悬液，将脾细胞与不同浓度的不同共聚体一起培养4天。用本领域熟知的方法通过测定氘化胸腺嘧啶的掺入检测脾细胞增殖。
发明详述
定向序列聚合物(DSP)的组合物DSP是一种所含序列衍生于已知基础肽序列的肽，可以是但不限于与免疫应答反应相关的天然表位，如起始位点。可按确定的规则进行置换，使DSP具有一个或多个与所述基础肽的序列不同的氨基酸残基。由于DSP组合物序列的半随机多样性，该组合物中存在大量的肽序列。多样性的肽序列可赋予比多样性少的组合物更高的效力，特别是当发生表位漂移和扩散时。在一些实施方式中，利用包含多种DSP的DSP组合物来调控不希望有的免疫应答反应，或在所述基础肽免疫原性微弱或不能测到时用其来诱导免疫应答反应。对DSP进行设计以包含在基础肽序列的任何给定位置引入明确比例的明确的氨基酸残基变异。不像产生的肽RSP如Cop-I那样，虽然它们可在不同程度上被置换，但其特定长度的明确预定肽序列仍能维持它们与天然序列的氨基酸残基相似性。每个氨基酸位置的改变，应根据一组明确的规则，这样的取代氨基酸选自基础肽异基因同工蛋白质中所见的化学性质相关的氨基酸，空间结构相似的氨基酸，种系发育改变的氨基酸，不会导致基础肽功能障碍的已知等位基因变异，或导入后不会破坏肽的二极结构的小氨基酸残基。在某些实施方式中，按照Kosiol等，J. Theoretical Biol, 2004, 228 :97-106所述方法置换氨基酸。或者，可按照PCT/US2004/032598第10-11页所述的示例性置换方法改变氨基酸。可用固相肽合成法制备DSP，每轮合成时，用按上述理由选定的明确比例混和的受适当保护的氨基酸混合物，而不是单个的氨基酸掺入合成的多肽中。根据该混和比例，所选氨基酸的引入(肽链)有所不同。因此，与RSP组合物相同，DSP组合物不是以单一的肽合 成的，而总是以共同的模板序列为基础合成含多种相关DSP肽组成的组合物，可重复产生整个混和物，这与所采用的合成规则相一致。产生的是有用的理论上相关蛋白质的混合物，本说明书将其称为包含“定向序列聚合物”或“DSP”的组合物。对于固相合成法，肽中给定位置氨基酸的混合物是按比例一一限定的。开始合成前，对肽的每个决定要改变的位置确定氨基酸的混和比例。得到的定向顺序肽混和物包含多种相关的肽序列。可用于本发明的一些 DSP 包括国际专利申请 TO 2007/120834、TO 2009/051797、TO 2009/128948 和美国申请公布公报US 2009/0036653中所描述的那些DSP。这些参考文献描述了合成DSP的方法、包含DSP的组合物、DSP的治疗制剂，给予治疗对象DSP组合物的方法、可用DSP治疗的疾病和可以与DSP共同给予治疗对象的其他治疗有效制剂。所有这些专利、专利申请和出版物均以整体内容纳入本说明书作为参考，特别注意讨论DSP结构、制备和功能的部分。通过选择没有已知功能、具有已知或预期的研究价值、具有已知或预期的诊断价值、或具有已知或预期的与疾病相关性的蛋白质，及选择蛋白中的一个部分，该部分可以是如下免疫原性范围内的表位(从没有已知的免疫原性到弱免疫原性到强免疫原性，或已知其与疾病病理相关)，来设计和制备DSP。对于制备DSP组合物，可从不同来源选择基础肽序列。在某些情况下，可通过相关表位的实验研究来鉴定对疾病状态或不良反应有某些意义的肽序列。这些序列可包括已证明对治疗疾病或病况有用的天然存在的肽序列，一个例子可参见国际专利申请WO 2006/031727，美国专利No. 6,930, 168和相关的科学出版物Stern等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005，102 :1620-25。另外，凭经验确定可能作为表位的基础肽序列，方法可以是通过对合成的组合肽文库进行位置扫描鉴定候选序列(例如，参见D. Wilson等，同上；R. Houghten等，同上；Hernandez等，Eur. J. Immunol, 2004, 34 :2331-41),或标出受关注的整个蛋白的重叠肽序列，和测试肽的免疫反应活性，所用的方法有例如适合于寻找疾病和物种有关表位的体外或体内试验系统中对此类目的有用的任何读出试验，如HI试验，病毒攻击模型，或NIH，John Wiley 父子公司出版的由 John E Coligan, Ada M Kruisbeek, David H Margulies,Ethan M Shevach, Warren Strober 编著的“免疫学当代方案(Current Protocols inImmunology) ”中描述的方法。候选分子可包括合成期间或合成后修饰的肽，例如加入糖基或修饰的糖基，如糖基化和糖原化(可以是N-连接或S-连接)，脂肪酸修饰，如十四烷酰化，或产生二硫键。鉴定到候选表位后，可利用病原的次代品系变异、簇群变异、漂移变异、替换变异，通过目前易于得到的参考文献(如WO 2000/042559)中所述的模拟算法和预测算法，如对突变、可能的抗体接触表位进行对比和分析，或利用2005/103679、WO 2002/073193和WO99/45954中描述的预测方法来预测这些可能表位的结合，从而制备可能的一组额外相关的表位。在一些实施方式中，设计DSP用的基础肽序列是与选自多发性硬皮病、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、重症肌无力、类风湿关节炎和寻常型天疱疹等自身免疫疾病相关的表位。在其他实施方式中，基础肽序列是与选自白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、veticulum细胞瘤、骨髓瘤、骨巨细胞瘤、小细胞肺癌、胰岛细胞瘤、淋巴细胞、粒细胞、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样瘤、嗜铬细胞瘤、卵巢肿瘤、宫颈非典型增生、原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、卡波西肉瘤和骨肉瘤的癌症病理学相关表位。 在其他实施方式中，基础肽序列是与病毒感染疾病病理上相关的表位，这些疾病选自AIDS、AIDS相关综合征、水痘、感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多蜱传热、登革热、埃博拉出血热、头足口病、肝炎、单纯性疱疹、带状疱疹、HPV、流感(Flu)、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、传染性单核细胞增多症、流行性腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多病灶白细胞脑病、狂犬病、风疹、SARS、天花、病毒性脑炎、病毒性胃肠炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼洛河病和黄热病。在其他实施方式中，基础肽序列是与细菌染疾病病理上相关的表位，这些疾病选自炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、布鲁氏杆菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、淋病、脓疱病、军团菌病、麻风病、钩端螺旋体病、李斯特杆菌病、莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、诺卡氏菌病、百日咳、鼠疫、肺炎球菌性肺炎、鹦鹉热、Q热病、落矶山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、土拉菌病、伤寒热、斑疹伤寒(包流行性斑疹伤寒)和尿道感染。在其他实施方式中，所述基础肽序列是寄生虫传染疾病病理上相关的表位，这些疾病选自阿米巴病、蛔虫病、巴贝西虫病、南美洲锥虫病、支睾吸虫病、隐孢子虫病、囊虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、蛲虫病、片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、自由活动的阿米巴感染、贾第虫病、腭口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、黑热病、利什曼病、疟疾、后殖吸虫病、蝇咀病、盘尾丝虫病、虱病、蛲虫感染、疟原虫感染、疥疮、血吸虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓浆虫病、旋毛虫病、鞭虫病、滴虫病和锥虫病(包括非洲锥虫病)。在一些实施方式中，基础肽序列是与影响中枢和/或外周神经系统的蛋白质构象无序病理上相关的表位，这些疾病选自阿尔茨海默病(AD)、荷兰遗传性脑出血伴淀粉样变(又名脑血管淀粉样变)、congophilic血管�。黄た瞬 ⒔行院松下楸灾�、家族性英国痴呆、帕金森氏病(PD)、Lewy体相关病、多系统萎缩症、哈施二氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、享廷顿氏病(HD)、脊髓小脑共济失调症、神经元核内包涵体病、遗传性齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩病、朊蛋白相关疾病如羊瘙痒症、�：Ｃ拮茨圆�、变体型克雅二氏症、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征、库鲁症、致命性家族性失眠症；及随着疾病发展以脑萎缩和检测到细胞内和/或细胞外纤丝凝聚为特征的其他疾病。
在一具体实施方式
中，所述蛋白构象无序疾病是帕金森氏病。在另一具体实施方式
中，所述蛋白构象无序疾病是阿尔茨海默病。在一具体实施方式
中，所述构象无序疾病是朊蛋白相关疾病。在一具体实施方式
中，所述构象无序疾病是肌萎缩性脊髓侧索硬化症。在一具体实施方式
中，所述构象无序疾病是享廷顿氏病。在其他实施方式中，用于加工制备DSP组合物的基础肽序列是与影响中枢神经系统外的多个器官的蛋白构象无序病理上相关的表位，这些疾病选自脊髓和延髓性肌萎缩、遗传性全身和脑淀粉样变性、芬兰型家族淀粉样变性、老年性全身淀粉样变性(又名老年性心脏淀粉样变)、家族性淀粉样多神经病、II型糖尿病特别是胰岛淀粉样变性、透折相关性淀粉样变性(DRA)、炎症相关性反应性全身淀粉样变(又名AA淀粉样变)、主动脉中层淀粉样变性、甲状腺髓质癌、遗传性肾淀粉样变性、轻链相关性淀粉样变性、轻链沉积病、轻链管型肾病、轻链心肌病、心房淀粉样变性、注射局部淀粉样变性、囊性纤维化病(CF)、镰状细胞贫血症，以及在受累器官或组织中观察到有原纤维形成的 其他疾病。天然未折叠的蛋白质和肽，那些怀疑经历原纤维形成的天然展开因而与蛋白构象无序相关、可用作制备DSP组合物的基础肽来源序列的蛋白质和肽，例子包括朊蛋白及其片段，淀粉样β蛋白及其片段，abri蛋白、微管相关蛋白、α突触核蛋白及其中心片段、胰岛淀粉样多肽(也称为糊精)、享廷顿病外显子I、前胸腺素α、雄激素受体蛋白氨基末端结构域、虾红素-l(ataxin-l)、DRPLA蛋白(也称为萎缩素-I)和降钙素。经历原纤维形成因而与蛋白构象无序相关、可用作DSP组合物基础肽来源序列的球蛋白的例子包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、运甲状腺素蛋白、β-2微球蛋白、血清淀粉样蛋白A及其片段、享廷顿蛋白、免疫球蛋白轻链可变区、胰岛素、溶菌酶(特别是人溶菌酶)、α乳清蛋白和莫尼糖蛋白、雄激素受体蛋白的配体和DNA-结合结构域、Iactadherein及其特异性片段(如残基245-294片段，也称为medin)、凝溶胶蛋白、载脂蛋白Al、纤维蛋白素原及其片段，和心房利钠因子。作为一个具体例子，在病理学上，阿尔茨海默病与存在4kDa淀粉样β (Αβ)肽强烈相关，这种肽系早老素I (PSl)酶切割Αβ肽的前体(APP)而产生。大多数Αβ长40个氨基酸，称为Aβ 40、Aβ 1-40，或氨基末端含变异的ΑβΧ-40。此外，研究表明微纤维形式的Αβ 1-40能激活通常认为在阿尔茨海默病病理发生中具有重要作用的小胶质细胞(Jekabsone,A 等，J. Neuroinflammation 3 :24(2006))。Aβ 1-40 的妝序列见表 I 中的 SEQID Ν0:7。另一方面，Αβ1-42是空斑形成Αβ的微小组分，认为其帮助启动了纤丝状Aβ的生成。该肽“全长形式”见表I的SEQ ID NO 8ο因此，所述基础肽序列可以是SEQ ID NO 8所示的Αβ肽。该基础肽序列也可以是较短的肽，即ΑβΧ-40、Αβ 1-11，在一些报导中具有临床意义的有A β 14-23 或A β 16-20οTjernberg, L. O.等，Biochem. J. 366 :343-351 (2002)。
表I :表位的不例
权利要求
1.一种检测DSP组合物的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于定量检测DSP组合物的工具；和 c.测定DSP组合物与一种或多种所述捕获多肽的结合。
2.一种改进DSP组合物设计的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于定量检测DSP组合物的工具； c.测定DSP组合物与一种或多种所述捕获多肽的结合； d.调整所述DSP组合物的设计以增加或减少其与一种或多种捕获多肽的结合； e.重复步骤(C)； f.任选地重复步骤(c_e), 其中调整所述DSP组合物的设计导致提高其生物利用度、减小毒性和提高效能中的一种或多种。
3.一种检测DSP组合物中肽种类的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于固体支持物上； c.使所述固体支持物与DSP组合物接触；和 d.测定所述DSP组合物中单个肽种类与固体支持物的结合。
4.一种改进DSP组合物中肽种类设计的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于固体支持物上； c.使所述固体支持物与DSP组合物接触； d.测定所述DSP组合物中单个肽种类与固体支持物的结合； e.调整所述DSP组合物的设计以增加或减少所述DSP组合物与一种或多种捕获多肽的结合； f.重复步骤⑷； g.任选地重复步骤(d-f), 其中调整所述DSP组合物的设计导致提高生物利用度、减小毒性和提高效能中的一种或多种。
5.如权利要求1-4之一所述的方法，其中(a)所述一种或多种捕获多肽通过以下步骤进行鉴定 i.使DSP组合物附着于固体支持物上； ·使(i)中所述固体支持物与含蛋白质生物液体接触； iii.鉴定特异性结合于(i)所述固体支持物的(ii)中所述的蛋白质； 其中，(ii)中所述的蛋白质是一种捕获多肽。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其中所述捕获多肽选自补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
7.一种测定DSP组合物存在的方法，包括以下步骤 a.使一种或多种蛋白质附着于定量检测样品中所述DSP组合物的工具，所述一种或多种蛋白质选自以下物质补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白产 物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链；和 b.测定所述样品中所述DSP组合物的水平。
8.如权利要求1-4之一所述的方法，其中所述捕获多肽选自补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
9.一种检测生物样品中DSP组合物存在的方法，包括以下步骤 a.使生物样品与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触；和 b.检测捕获多肽与DSP组合物的结合存在与否， 其中，存在这种结合表明生物样品中DSP组合物的存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述捕获多肽选自包括HDL蛋白质组、LDL蛋白质组的至少一种组分或至少一种血清蛋白的多肽。
11.一种检测生物样品中包含YFAK或YEAK肽的DSP组合物存在的方法，包括以下步骤 (a)使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 (b)检测捕获多肽与DSP组合物的结合存在与否， 其中，存在这种结合表明生物样品中YEAK或YFAK肽的存在。
12.—种检测生物样品中包含YFAK肽或YEAK肽的DSP组合物含量的方法，包括以下步骤 a.使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白， α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 b.定量测定捕获多肽与DSP组合物的结合水平， 其中，结合水平表示生物样品中DSP组合物的含量。
13.一种测定DSP组合物在哺乳动物体内生物利用度的方法，包括以下步骤 a.给予哺乳动物一个剂量的含DSP组合物的组合物； b.从受试对象取生物样品； c.使该生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； 从而确定生物样品中DSP组合物的生物利用度。
14.一种确定对有需要的对象给予DSP组合物的合适剂量的方法，包括以下步骤 a.给予受试对象一个剂量DSP组合物； b.从受试对象取生物样品； c.使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； d.检测该生物样品中捕获多肽的水平； e.任选地用不同剂量重复步骤(a)至(d);和 f.将生物样品中测得的这些水平与DSP组合物预定的合适水平比较； 其中合适剂量是导致生物样品中DSP组合物达到预定合适水平的剂量。
15.一种治疗或预防受试对象不希望有的免疫应答反应的方法，包括以下步骤 a.给予受试对象合适剂量的DSP组合物，其中所述合适剂量由如下步骤确定 (i)给予受试对象一个剂量的DSP组合物； (ii)从受试对象取生物样品； (iii)使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； (iv)检测生物样品中该捕获多肽的水平； (v)任选地用不同剂量重复步骤(i)至(iv);和 (vi)将生物样品中测得的水平与预定的DSP组合物合适水平作比较； 其中合适剂量是导致生物样品中DSP组合物达到预定合适水平的剂量。
16.如权利要求11-15之一所述的方法，其中所述捕获多肽是被标记的多肽。
17.如权利要求11-15之一所述的方法，其中所述捕获多肽附着于固体支持物上。
18.如权利要求11-15之一所述的方法，还包括分离含结合于DSP组合物的捕获多肽的复合物。
19.如权利要求11-15之一所述的方法，还包括用抗捕获多肽的抗体检测捕获多肽与DSP组合物的结合。
20.如权利要求11-15之一所述的方法，其中所述组合物是皮下注射给予的。
21.一种用于检测生物样品中DSP组合物的组合物，其包含至少一种捕获多肽，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
22.—种分离含DSP组合物样品中的肽的方法，包括以下步骤 a.使样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur,富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 b.从混合物中分离结合于捕获多肽的肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述捕获多肽固定于固体支持物上。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述捕获多肽是表位标记的多肽。
25.如权利要求22所述的方法，还包括从捕获多肽分离结合的肽。
26.如权利要求22所述的方法，还包括测定所分离的肽的特性。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述测定所述特性包括测定结合肽的氨基酸序列或测定结合肽中氨基酸的相对比例。
28.一种在受试对象上鉴定DSP组合物中生物可利用肽的方法，包括以下步骤 a.在第一时间给予受试对象DSP组合物； b.在给药后的第二时间从受试对象取组织样品；和 c.鉴定样品中结合于至少一种捕获多肽的肽，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No.CAA28659)，及 IgJ-链。
29.一种制备含毒性减弱的DSP组合物的方法，包括以下步骤 a.使DSP组合物与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； b.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离； c.测定所分离肽的特性；和 d.制备具有所分离肽的特性的一系列肽。
30.一种制备效应增强的DSP组合物的方法，包括以下步骤 a.使DSP组合物与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； b.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离； c.测定所分离肽的特性；和 d.制备具有所分离肽的特性的一系列肽。
31.一种治疗或预防受试对象不希望有的免疫应答反应的方法，包括 a.提供一种DSP组合物； b.给予受试对象该DSP组合物； c.从受试对象取生物样品； d.使此生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下组的肽序列补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； e.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离； f.测定所分离肽的特性； g.制备具有所分离肽的特性的一组肽；和 h.将这组新的肽给予受试对象。
32.如权利要求28或31所述的方法，其中所述肽给予受试对象一次以上。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述肽以1，2，3，4，6，12，18，24，36，48或72小时的间隔给予受试对象。
34.一种比较DSP组合物不同制剂的方法，包括以下步骤a.使第一种DSP组合物与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触； b.使第二种DSP组合物与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触； c.必要时重复步骤(b)； d.从步骤(a-c)的混合物中分离结合于捕获多肽的肽； e.测定步骤(d)分离的肽的特性；和 f.比较具有步骤(d)分离的肽的特性的所述一组分离肽。
35.一种制备靶向受试对象组织的治疗剂的方法，包括以下步骤 a.提供DSP组合物；和 b.将治疗剂与DSP组合物偶联以形成偶联物。
36.一种向受试对象特定组织递送治疗剂的方法，包括以下步骤 a.通过以下步骤分离标记肽 (i)使DSP组合物与组织特异性肽接触，所述组织特异性肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； (ii)从混合物中分离结合于组织特异性肽的肽； b.将标记肽与治疗剂偶联；和 c.将偶联物给予受试对象。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述治疗剂是有机小分子或生物大分子。
38.如权利要求35或36所述的方法，其中所述组织是脑、肺或肝组织。
39.如权利要求35或36所述的方法，其中所述标记肽通过共价键、包络物、离子键或氢键偶联于治疗剂。
全文摘要
本领域已有检测简单肽的方法。然而，检测定向序列聚合物(DSP)有效血浆浓度的方法是复杂的，因为与具有明确氨基酸序列的各别肽相反，DSP是肽的复杂混合物。本申请提供检测和评估DSP组合物的改进方法，检测和定量测定DSP组合物的方法，根据肽亚组与某些捕获多肽的相互作用确定和富集DSP组合物中肽亚组的方法，和对需要的对象给予DSP组合物的方法，其中，剂量方案和用量可根据上述检测和定量方法加以确定和评估。
文档编号G01N33/53GK102869990SQ201080052758
公开日2013年1月9日 申请日期2010年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者E·扎内利, J·克里格, J·康诺利, K·H·柯林斯 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司
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