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专利名称：一种利用红球菌jzx-01对石油污染物的降解及检测方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用红球菌JZX-01对石油污染物的降解及检测方法。具体的说是涉及利用在实验室模拟的条件下红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法研究与优化，即利用红球菌JZX-Ol在实验室模拟条件下对石油降解情况的优化和研究。
背景技术：
石油是远古时期由动植物的有机残骸经过漫长的地质作用所形成的黒褐色粘稠液体，密度一般为O. 83-1. 00t/m3。石油的组成因地域的不同而异，地质成分很复杂，主要包括饱和烃类、芳香类、浙青质和树脂类以及含硫、氧、氮等元素的有机物及钒、镍等重金属，按其组分的不同可以将石油分为富石蜡石油、富环烷烃石油以及混合石油。烃类化合物占石油的绝大部分，约有几万种，各种烃类的结构和所占比例相差甚大，石油烃类的相对分子质量的跨度范围很大，包含从分子质量为16的甲烷到分子质量为2000的烃类。石油及成品油是国民生产及经济发展的重要能源物质，但是在开采、冶炼、储存、运输和使用的过程中的泄露以及世界各地频繁发生的漏油事故等引起了世界范围严重的石油污染问题。目前，全球的石油污染物以每年I. OX IO3万吨的石油排放到大气、陆地和海洋中，其中我国的石油污染物増加量也以每年11. 5万吨的数量激増。据报道，近50年来由于石油的泄露等造成的污染已经使超过1000种的海生生物灭绝，海洋生物的总量减少40%。石油泄漏后引起的海域和陆地的污染也是对当地自然景观的极大损害，受污染的盐碱滩中，溢油的滲透可以达到很深的深度，难以清除，产生长期的有害影响。整治石油污染物已经成为亟待解决的重大环境问题。对石油污染物的处理方法主要有三种物理法、化学法以及生物法。其中，物理方法处理石油污染物只能在石油尚未分散和稀释的情况下通过某些材料和设备进行收集；但是由于石油在水中会极快的分散和稀释，所以很难回收到全部的石油污染物；化学方法是通过添加化学试剂对石油污染物进行分散，达到肉眼不可见的程度，但是并未有将石油转化为其他的环境友好物质，相反，由于小颗粒的石油颗粒在水相中更容易扩散以及被动植物吸收会造成更加严重的污染问题，另外，由于添加的化学物质本身就是环境中的外来人エ合成物质，其自身就具有对环境的污染效应；生物处理石油污染物的方法由于可以从根本上克服物理法和化学法的弊端，而且具有成本低廉、环境友好、处理方法简单、处理速率高效，降解程度彻底的优势而成为近年来研究的热点。环境的改变能够很大程度地影响到石油降解菌的降解效率和降解程度。微生物降解石油烃的能力取决于石油中各种组分的组成，碳链和多环芳烃的复杂程度，环境情況、菌株种类，表面活性剂以及产生表面活性剂的细菌是否存在等诸多因素的综合影响。石油烃中许多物质的吸收速率和矿化速率取决于环境中石油的浓度，如果石油的浓度过高，不仅会形成难以分散的厚油层和油颗粒，造成物理性的分散不均匀，而且降解效率和速率会由于相对N和P元素的缺失、相对氧气浓度的下降以及高浓度的石油对微生物的毒害而形成的降解抑制作用。石油的可降解能力根据其组分的不同会有很大的差异。微生物对石油中四种主要成分即饱和烃、芳香烃、浙青质和蜡质以及非烃类物质的可利用程度不同。非烃类物质由于成分不确定，无法判定，其他三种主要成分的降解能力大小依次为饱和烷烃>芳香烃〉浙青纸和蜡质。其中在饱和烷烃中，直链烷烃最容易降解，C1-C6范围内的烃类可以被极少的微生物利用，大部分通过挥发除去，C10-C22范围内的直链烷烃的生物降解性能最好而且毒性也是最小的，超过C22的直链烷烃由于其水溶性低，在ー环境温度下一般是固态形式存在，因此降解缓慢。支链烷烃的可降解能力比直链烷烃差很多，原因是由于分支结构产生了“空间效应”及在降解过程中由分支结构产生的三碳和四碳原子对氧化的阻滞作用。环烷烃的环数越多越难降解，但是在ClO以下的环烷烃由于其自身含有较高的膜毒性而使其生物降解カ较低。芳香烃中苯环的数目越多越难以降解，而且芳香烃在石油中虽然含量不多但是对微生物有毒害作用。近年来，以有毒多环芳烃为唯一底物筛选降解多环芳烃的细菌也是环境领域内研究的热点。浙青质和蜡质属于极难被微生物降解利用的物质，在降解的最终阶段会残留在降解体系内。在深海中，压カ对石油的降解作用很明显，即随着压カ的増大，石油降解菌降解能力下降，这是因为深海环境下的氧气浓度降低，微生物对石油的可降解能力减弱。氮源、磷源和某些微量元素如铁离子等对降解菌的降解作用比氧气还要重要。在受石油污染的环境中，作为碳源的石油含量很高，而微生物生 长需要的其他营养物质如Ν、Ρ等含量相对低很多。微生物的生长需要一定的C Ν Ρ的比例，Wonjae Chang等在2010年发现石油降解菌的最适合C:N:P比例是100:9:1,而受石油污染区域的氮磷的相对含量远远少于这个比例。所以无论是在实验室内模拟还是在石油污染区域的现场修复过程中，添加适量的氮源和磷源都会増加微生物降解菌的降解速率和降解程度。微生物生长环境中PH变化对其自身的生长和降解作用的影响较大，尤其在极端的酸性或者碱性条件下这种影响变得更加明显。降解石油的细菌的一般适宜的PH是7. 0-7. 4，不同的菌株的最适PH不相同。在石油的生物降解过程中，温度对石油的降解作用主要表现在两个方面。第一是影响石油降解菌的生长速度以及酶的活性和微生物的种群组成；第ニ是通过影响石油的物理组成和化学成分影响微生物对石油的降解速率。研究表明，微生物对石油的降解能力在30°C到40°C的降解能力最高。温度过低时，石油的粘性变大，可溶解能力降低，微生物的活性以及酶的活性也变得很低。温度过高时，微生物的活性受高温的影响下降，而且高温的下石油的膜毒性增大导致生物降解能力降低。石油的降解体系是ー个油-水共存体系，微生物主要在油-水界面处活动。完全在水相中的微生物难以和石油接触，不产生降解作用，而完全处于石油中的微生物由于缺水及水相中微生物生长和降解所必需的营养物质，不会产生降解作用。所以，油-水体系中，要达到微生物的高效降解作用，必须増大石油在水相中的分散程度，増大微生物与石油的接触面积。利用生物表面活性剂对是有进行乳化为石油小液滴，这样不仅能够最大程度的増大石油与微生物的接触面积，而且微生物更容易从水相中获得生长所必需的氧气和营养物质。菌株产生生物表面活性剂的能力对石油污染物的降解会起到很大的增强作用，生物表面活性剂除了具有一般化学表面活性剂所有的降低表面张力，发泡及稳定乳化液的共性外，还因为自身具备独特的性质而受到广泛关注，这些优势包括(I)具有较高的水溶性，在石油和水相的表面能产生较高的表面活性；(2)具有很强的乳化石油的能力，能分散石油，并将油膜剥落下来，使含有的岩石和沙砾表面产生两高的润湿性；(3)反应得到的产物具有生物活性，具有新型的，化学方法很难合成的反应基团；(4)对固体物质的吸附量比化学表面活性剂�。�能在反应介质中均勻分散；(5)对自然环境无毒无害、安全、可以被自然界中的生物降解。本发明涉及的利用红球菌JZX-Ol降解石油污染的方法中，考察了实验室模拟条件下石油的装载量对石油降解率的影响；探讨了不同的环境条件(温度、盐度、培养基pH)下的石油降解表现；研究了红球菌JZX-Ol对石油中不同成分的降解行为；分析了红球菌JZX-Ol在降解石油污染物的过程中产生生物表面活性剂的能力以及生物表面活性及对石油降解的促进作用。经过考察，本方法对石油污染物的降解具有效果显著、速率快速、范围广泛的优势，对石油污染物降解机理的考察和石油污染区域的修复将产生有效的理论优势和丰富的实践经验。

发明内容
本发明的目的是提供了一种新的石油污染物的降解方法，即利用红球菌JZX-Ol在实验室模拟条件下对石油降解情况的优化和研究。
本发明所使用的红球菌JZX-Ol已于2012年4月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏的编号为CGMCC No. 5958，分类命名为红球菌JZX-Ol(Rhodococcus sp.JZX-01)。本发明的具体技术方案如下ー种利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法，首先配置降解石油污染物的无机盐培养基，培养基为硝酸钠l_3g/L，磷酸ニ氢钾l_2g/L，磷酸氢ニ钾l_3g/L，硫酸铵l_3g/L，氯化钠5-30g/L，硫酸镁O. Ι-lg/L，微量元素IOmL ;无机盐培养液的pH值为
6.0-8. 0，取IOOmL无机盐培养液分装到250mL的三角瓶中，通过控制NaCl控制培养液的盐度范围为O. 5%-5%，在121°C的高压灭菌锅中灭菌20分钟；待无机盐培养基冷却后，接种红球菌JZX-Ol，使得最終的0D_达到O. 5，在每IOOmL的无机盐培养基中添加石油5_15mL ;将三角瓶放在温度为25-35°C，培养转速是200rpm的摇床中降解石油污染物，降解时间为10天。所述的微量元素溶液为MnSO4·4Η20 O. 4g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 5g/L,Na2MoO4 · 2H200. 2g/L, CuSO4 · 5H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 2. Og/L, CaCl2 I. Og/L, NaSO4 5. Og/L 或 H3BO3 0. 5g/L利用红球菌JZX-01降解石油污染物后的測定方法，其特征是所述方法包括a利用こ醇破解培养液中絮状漂浮物的紫外分光光度法；b通过利用离心后的正己烷萃取石油污染物的比重法测定总石油降解效率的方法;c气相色谱-质谱联用法测定石油内各种物质的降解情况；d通过测量培养液的表面张カ考察生物表面活性剂对石油污染物降解的影响。所述的步骤a是利用こ醇破解培养液中絮状漂浮物的紫外分光光度法，利用こ醇对菌液进行定量洗涤，破除菌液中未降解的石油与菌体形成的絮状漂浮物，使用漩涡振荡器震破絮状漂浮物，形成均匀的相后，使用紫外分光光度计测量菌体浓度。所述的步骤b是将降解完的培养液在12000rpm的转速下离心，除去菌体后，上清液用正己烷进行萃取，得到剰余的石油；萃取的石油用氮气在通风橱中进行通风，除去正己烷和水分。
所述的步骤c是利用气相色谱-质谱联用技术对降解前后的石油分别进行分析，考察石油中不同物质的降解情况；石油在进行气质联用分析前需要用100:1体积比的正己烷进行稀释。所述的步骤d是在无机盐培养基中加入石油烃为唯一碳源，接种红球菌JZX-Ol使最終的0D_为O. 5，放置于30°C，200rpm的摇床中进行培养，每隔8小时取样测量培养液的表面张力。石油烃为石油与柴油1:4体积比的混合液。本发明中，考察了不同条件石油污染物的降解方法研究，具体的考察方法为分别在20、25、30和35°C下考察温度对石油降解率的影响，在pH为6. 0,7. 0,7. 2和8. O下考察不同的酸碱度对降解率的影响，在盐度为O. 5g/L、lg/L、2g/L和3g/L的情况下考察盐度对石油降解率的影响。本发明的目的还包括提供了新的降解石油污染物的測定方法，即不同的条件下考 察红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法、改进的紫外分光光度法、萃取比重法测定总的石油降解效率、气相色谱-质谱联用法測定石油内每种物质的降解情况以及通过测量培养液的表面张カ考察生物表面活性剂对石油污染物降解的影响。本发明的目的还有利用こ醇剥离培养液中附着在悬浮物内外的菌体，得到均匀的菌液，然后测定菌液中菌体的浓度，具体的原因是由于红球菌JZX-01在降解石油的过程中，上层培养液中未降解的石油会与旺盛生长的菌体相互附着，形成难以均匀分散的絮状漂浮物。本发明中，JZX-Ol对石油的降解能力测定采用比重法进行测量，具体的说是在降解进行到预定的时间后，将培养液置于低温下停止菌体的生长，降低酶的活性，离心除去菌体后萃取上清液中的剰余石油。萃取物置于通风橱中用惰性气体进行通风除去萃取剂和水分，得到纯净的剰余石油。通过剩余石油与初始石油的质量比可以得到石油降解率。本发明中，JZX-Ol对石油的降解能力还采用了气相色谱-质谱分析联用的方法进行定量化測量。具体的说是将在上述降解前和降解后的石油溶解在100倍体积的正己烷中，注射到气相色谱-质谱联用分析仪中进行分析。本发明中，使用表面张カ仪测得红球菌JZX-Ol在降解2%体积比的石油烃(石油与柴油按1:4均匀混合)时，表面张カ随时间变化的情況。


图I是不同石油装载量对石油降解效果的影响；图2a是石油降解前进行气相色谱-质谱联用分析得到的含量变化；图2b是石油降解后进行气相色谱-质谱联用分析得到的含量变化；图3是红球菌JZX-Ol在含2%的石油烃中培养5天，得到的表面张カ变化趋势。
具体实施例方式通过下面结合具体实例将有助于进一歩理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此实施例I利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物
在用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培养基成分是硝酸钠lg/L、磷酸ニ氢钾lg/L、磷酸ー氢钾lg/L、硫酸铵3g/L、NaC15g/L，硫酸镁lg/L。微量元素10mL，调节pH到6.0，在IOOmL的三角瓶中添加石油5mL的石油。25°C下，盐度O. 5%，200rpm的转速下，降解实验进行9天后，发现石油降解率达到39%。实施例2利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物在用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培养基成分是硝酸钠2g/L、磷酸ニ氢钾I. 5g/L、磷酸ー氢钾2g/L、硫酸铵2g/L、NaCl 10g/L，硫酸镁O. 5g/L。微量元素10mL，调节PH到7. 0，在IOOmL的三角瓶中添加石油IOmL的石油。30°C下，盐度2. 0%, 200rpm的转速下，降解实验进行9天后，发现石油降解率达到54%。实施例3
利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物在用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培养基成分是硝酸钠3g/L、磷酸ニ氢钾2g/L、磷酸ー氢钾3g/L、硫酸铵lg/L、NaCl 15g/L，硫酸镁O. lg/L。微量元素10mL，调节pH到8.0，在IOOmL的三角瓶中添加石油15mL的石油。35°C下，盐度3. 0%，200rpm的转速下，降解实验进行9天后，发现石油降解率达到42%。实施例4利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物在用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法中，培养基成分是硝酸钠lg/L、磷酸ニ氢钾2g/L、磷酸ー氢钾3g/L、硫酸铵lg/L、NaC15g/L，硫酸镁O. lg/L。微量元素10mL，调节pH到8. 0，在IOOmL的三角瓶中添加石油5mL的石油。30°C下，盐度O. 5%，200rpm的转速下，降解实验进行9天后，发现石油降解率达到78%。实施例5石油污染物降解过程中菌体生长量的測定方法石油污染物在摇瓶中经过红球菌JZX-Ol的降解，形成漂浮在培养液上层的很多絮状漂浮物。在取样时，难以得到均匀的菌液，为解决这个问题，将摇瓶在漩涡振荡器上低速震荡，形成较为均匀的混合相，用移液枪移除适量的菌液。菌液与こ醇以1:1体积比进行混合，高速漩涡震荡破除菌体与未降解石油的附着作用，得到均匀混合的菌液，然后在600nm的紫外分光光度计中測定其紫外吸收值，用以考察菌体的浓度。实施例6石油污染物经过红球菌JZX-Ol降解前后的比重分析方法JZX-Ol对石油的降解能力采用比重法进行測定，在含有初始OD值为O. 5的红球菌JZX-Ol的培养基中，30°C下，200rpm的摇床下进行9天实验后，将培养液置于低温下停止菌体的生长，降低酶的活性，12000rpm的转速下离心除去菌体，上清液中加入正己烷进行萃取得到剰余的石油。萃取物置于通风橱中用惰性气体进行通风除去正己烷和水分，得到纯净的剰余石油。通过剩余石油与初始石油的质量比可以得到石油降解率。本方法中用正己烷进行萃�。�能够达到良好的萃取效果，简单快捷，无重复操作，而且结果精准。实施例7气相色谱-质谱联用技术分析石油降解前后组分变化的方法
技术领域：
本发明中所用到的石油是重质石油，粘着性很高，难以在水溶液中分散，采用JZX-Ol菌株在30°C，200rpm的条件降解装载量为5%体积比的石油，接种2天之后，石油与水相已经形成了非常均匀的混合状态。9天后，萃取并且除去萃取剂和水分，得到纯净的剩余石油。用100倍体积的正己烷溶解剰余石油和未接种JZX-Ol的石油，分别进样到气相色谱质谱联用分析仪安捷伦6890 (Agilent6890)中，测得的降解前后的效果如说明书附2所示，分析得到的数据显示利用本方法进行石油的降解，石油中短链烷烃和中长链烷烃的降解效果好于长链烷烃的降解效果，对难于被降解的姥鲛烷和植烷等物质也具有良好的降解效果。烷烃的降解范围广泛，长链烷烃如C38等也被降解了 30-50%。实施例8考察JZX-Ol在降解石油烃过程中表面张カ的降低作用本方法中所涉及的石油烃是石油与柴油按体积比I : 4的比例进行混匀的混合液。将2%体积比的石油烃加入到无机盐培养基中，在30°C下，200rpm的条件下，每隔8小时使用表面张カ仪測量上清液的表面张力。具体的说是将培养液在12000rpm的条件下离心除去沉淀的菌体，保留上清液。将上清液放置到全自动表面张カ测试仪下进行测量。测量结果如

中图3所示，培养液的表面张カ自接种后的第8个小时开始下降，在第24小时后下降速度显著增強，达到第80个小时后，下降速度变得很缓慢，最終在第100小时后，保持在31. 3X 10_3N/m。本方法用于考察石油污染物降解过程中，红球菌JZX-Ol产生表满活性物质的能力，表明了在以石油烃为底物的降解过程中可以产生丰富的生物表面活性齐U，降低液体的表面张力，增大水相与油相的接触面积，提高石油的降解效率和降解程度。
本红球菌JZX-Ol是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏的登记号为CGMCC No. 5958的红球菌；保藏日期是2012年4月9日；保藏单位是中国科学院微生物研究所，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号。
权利要求
1.ー种利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物的方法，其特征是首先配置降解石油污染物的无机盐培养基，培养基为硝酸钠l-3g/L，磷酸ニ氢钾l_2g/L，磷酸氢ニ钾l_3g/L，硫酸铵l_3g/L，氯化钠5-30g/L，硫酸镁O. Ι-lg/L，微量元素IOmL ;无机盐培养液的pH值为6.0-8. 0，取IOOmL无机盐培养液分装到250mL的三角瓶中，通过控制NaCl控制培养液的盐度范围为O. 5%-5%，在121°C的高压灭菌锅中灭菌20分钟；待无机盐培养基冷却后，接种红球菌JZX-Ol，使得最終的OD_达到O. 5，在每IOOmL的无机盐培养基中添加石油5_15mL ;将三角瓶放在温度为25-35°C，培养转速是200rpm的摇床中降解石油污染物，降解时间为10天。
2.如权利要求I所述的方法，其特征是所述的微量元素溶液为=MnSO4· 4H200. 4g/L，ZnSO4 · 7H20 O. 5g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L, CuSO4 · 5H20 0. 3g/L, FeSO4 · 7H20 2. Og/L, CaCl2I.Og/L, NaSO4 5. Og/L 或 H3BO3 0. 5g/L。
3.利用红球菌JZX-Ol降解石油污染物后的測定方法，其特征是所述方法包括 a利用こ醇破解培养液中絮状漂浮物的紫外分光光度法； b通过利用离心后的正己烷萃取石油污染物的比重法测定总石油降解效率的方法； c气相色谱-质谱联用法測定石油内各种物质的降解情况； d通过测量培养液的表面张カ考察生物表面活性剂对石油污染物降解的影响。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的步骤a是利用こ醇破解培养液中絮状漂浮物的紫外分光光度法，利用こ醇对菌液进行定量洗涤，破除菌液中未降解的石油与菌体形成的絮状漂浮物，使用漩涡振荡器震破絮状漂浮物，形成均匀的相后，使用紫外分光光度计测量菌体浓度。
5.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的步骤b是将降解完的培养液在12000rpm的转速下离心，除去菌体后，上清液用正己烷进行萃�。�得到剰余的石油；萃取的石油用氮气在通风橱中进行通风，除去正己烷和水分。
6.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的步骤c是利用气相色谱-质谱联用技术对降解前后的石油分别进行分析，考察石油中不同物质的降解情況；石油在进行气质联用分析前需要用100:1体积比的正己烷进行稀释。
7.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的步骤d是在无机盐培养基中加入石油烃为唯一碳源，接种红球菌JZX-Ol使最終的OD6tltl为O. 5，放置于30°C，200rpm的摇床中进行培养，每隔8小时取样測量培养液的表面张力。石油烃为石油与柴油1:4体积比的混合液。
全文摘要
本发明涉及一种利用红球菌JZX-01对石油污染物的降解及检测方法；首先配置降解石油污染物的无机盐培养基，通过控制NaCl控制培养液的盐度范围为0.5%-5%，在121℃的高压灭菌锅中灭菌20分钟；待无机盐培养基冷却后，接种红球菌JZX-01，使得最终的OD600达到0.5，在每100mL的无机盐培养基中添加石油5-15mL；将三角瓶放在温度为25-35℃，培养转速是200rpm的摇床中降解石油污染物，降解时间为10天。利用乙醇破解培养液中絮状漂浮物的紫外分光光度法；通过利用离心后的正己烷萃取石油污染物的比重法测定总石油降解效率的方法；气相色谱-质谱联用法测定石油内各种物质的降解情况；通过测量培养液的表面张力考察生物表面活性剂对石油污染物降解的影响。
文档编号G01N9/36GK102814020SQ20121019997
公开日2012年12月12日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者贾晓强, 周征西, 闻建平 申请人:天津大学