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专利名称：Il-18结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及白细胞介素18(IL_18)结合蛋白，特别涉及它们在急性和慢性炎症疾 病的预防和/或治疗中的用途。
背景技术：
最早在1989年白细胞介素-18(IL-18)被描述为干扰素诱导因子(IGIF)，并 且是促炎症细胞因子，除了具有诱导Y-干扰素的能力外，还具有多方面功能。这些生物 学性能包括NF- κ b的激活，Fas配体表达，CC和CXC趋化因子的诱导，感受态人免疫缺陷 病毒的增加的产生。由于IL-18有诱导T细胞和巨噬细胞中Y-干扰素产生的功能，它在 Thl-型免疫应答中和参与先天和后天免疫性中起着重要作用。IL-18就其结构和功能来说 涉及IL-I家族。有关IL-18结构，功能和生物学活性，参见，例如Dinarellc)，C.等(1998) J. Leukoc. Biol. 63 :658_654 ；Dinarello, C. A. (1999)Methods 19 :121_132 ；禾口 Dinarello， C. Α. (1999)J. Allergy Clin. Immunol. 103 11-24 ； (Mclnnes, I. B.等(2000)Immunology Today 21:312_315 ；Nakanishi，K.等(2001)Ann. Rev. Immunol 19 :423474。细胞内IL-18-原在内毒素-刺激的细胞中经胱天蛋白酶1 (Ghayur，Τ.等， (1997) Nature 386 619-623 ；Gu, Y.等，(1997) Science 275 :206_209)，在 Fas-L 或细菌 DNA刺激细胞中经胱天蛋白酶4，5和6蛋白酶解加工成18kDa活性形式(Tsutsui，H.等， (1999) Immunity 11 359-67 ；Ghayur, T.，没有出版的 Observations)。IL-18-原还被其 他蛋白酶解加工，例如嗜中性白细胞蛋白酶3(Sugawara，S.等，(2001) J. Immunol.，167， 6568-6575)，胱天蛋白酶 3(Akita，K.等，(1997) J. Biol. Chem. 272，26595-26603)，和丝 氨酸蛋白酶弹性蛋白酶和组织蛋白酶(Gracie J.A.，等，(2003)Journal of Leukocyte Biology 73,213-224)。人和鼠IL-18没有常规的前导序列，并且细胞成熟IL-18释放的原 理还不十分清楚。IL-18的生物活性通过IL-18与由两个亚基构成的异二聚体IL-18受体(IL-18R) 结合而介导α-亚基(IL-1R家族中的一员，也称作IL-IR-相关蛋白_1或IL-IRrpl)和 β-亚基(也称作IL-18R辅助蛋白，IL-18AP或AcPL)。IL_18Ra亚基直接结合IL-18，但 是不能信号传导。亚基本身不结合IL-18，但是与α-亚基联合形成信号转导必需的高 亲和性受体(Kd= 0.3nM) (Sims, J. Ε.，(2002) Current Opinlmmunol. 14 117-122)。通过 IL-18 α β复合体的IL-18信号传导类似于IL-IR和Toll样受体(TLR)系统。IL-18R信号 传导利用信号传导分子，例如MyD88，IRAK,TRAF6,并且产生和IL-I产生的相似的响应(例 如，NIK, IkB激酶，NF-kB，JNK和p38MAP激酶的激活)。介导IL-18生物活性对IL-18R α和信号传导分子的需要已经分别使用IL-18Ra -亚基(Hoshino K.，等(1999) J. Immunol. 162 5041-5044 ；)，MyD88(AdachiO.，等(1998)Immunity 9 143-150)或 IRAK(Kanakaraj P.， (1999) J.Exp. Med. 189 1129-1138)敲除证实了。结合IL-18的抗体是本领域公知的。EP O 974 600公开了能中和IL-18的小鼠抗 体。抗IL-18人抗体在PCT公开WO 0158956中公开，这里引作参考。本发明提供了能以高 亲合力结合IL-18，结合并中和IL-18的结合蛋白质的新的家族，人抗体，及其片段。

发明内容
发明概述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是人IL-18的抗体，以及制备和使用这样的蛋白 质的方法。本发明的一个方面是提供使用IL-18调谐子调节基因表达的方法。本发明的一个方面是提供包括能结合人IL-18的抗原结合结构域的结合蛋白质。 在一个实施方案中，抗原结合结构域包括至少一个包括选自下面的氨基酸序列的⑶R CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:42)，其中X1 是 S，N，H，R，或 Y;父2是丫，6，1 ，5，或C;父3是1，6，丫，0，5，￥，或1;父4是1，!1，1，￥，1，1^，或0;X5 是6，Y，S，N，或 H;X6是W，或者不存在；和S，G，或者不存在；CDR-H2. XfX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 43), 其中；X1 是 F，Y，H，S，或 V;&是1，或 F;X3 是 Y，S，或 W;X4 是 P，Y，或 S;父5是6，5，札或0;X6 是 D，或 G;&是5，1\6，或1 ;X8是E，T，I，或 N;X9 是 T，Y，N，I，X，或 H;Xio是R，Y，或S ;
Xll是Y，N，或S ；
Xl2是 S，P，A，或 V ；
Xl3是P，S，或D ；
X14是T，L，或S;
Xl5是F，K，或V;
Xl6是Q，S，或K ；和
X17是G，或者不存在；CDR-H3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xltl-X11-X12-X13-X14-X15-Xl6-X17-Xl8 (SEQ ID NO 44)，其中；父1是￥，0』，5，或C;X2 是6，R，D，S，K，L，Y，或 A ；&是5，6，￥，或1 ;X4 是 G，S，Y，N，T，或 D;&是1，S，A，G，Y，或 T ；X6 是 Y，G，S，F，W，或 N;X7 是 P，S，F，Y，V，G，W，或 V;父8是丫，卩，0，卩，厘，I，或N;父9是1\1，0^』，卩，卩，或6;Xltl 是 F，D，Y，H，V，Y，或者不存在;X11是0，Y，F，L，或者不存在；X12是I，D，Y，或者不存在；X13是Y，或者不存在；X14是Y，或者不存在；X15是G，或者不存在；X16是M,或者不存在；X17是D，或者不存在；禾口X18是V，或者不存；CDR-L1. XfX2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO 45), 其中；X1 是 R，或 K ；X2 是 A，G，或 S ；X3 是 S ；X4 是 E，R，Q，或 H;&是5，1，1\或 N;X6 是 I，V，L，或 F;X7 是 S，G，L，N，或 R;父8和S，G，Y，R，N，H，或 D ；X9 是 N，G，Y，R，或 S;Xltl 是 L，Y，S，或 D ；X11 是 A，L，N，V，G，或 D;父12是六^4，1(，6，或者不存在;X13是K，T，N，或者不存在；X14是N，Y，T，或者不存在；X15是Y，L，或者不存在；X16是L，C，Y，或者不存在；禾口
乂17是六，0，或者不存在；CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (SEQ ID N0:46)，其中X1 是1\ G，S，W，或 E ；父2是六，V，T，I，或L;X3 是 S，或 F;X4 是 T，I，N，S，R，或 Y;X5 是 R，或 L ；X6 是 A，Q，E，或 F ；和X7 是 T，或 S;和X1 是 Q，或 M ；X2 是 Q，H，或 Y ；X3 是 Y，N，G，S，或 R ；父4是队！^，0，6，￥，1^，或1;X5是N，G，I，Y，S，Q，F，或E;X6 是 W，S，T，L，I，或 F ；X7 是 P，L，T，D，或 I ；父8是5^，(，1，I，或F;X9是I，T，S，或者不存在；和Xltl是T，或者不存在。优选地，抗原结合结构域包括至少一个包括选自由下面的残基构成的组的氨基酸 序列的 CDR:SEQ ID NO. :6 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. :6 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :6 的残 基 99-110 ；SEQ ID NO. 7 的残基 24-34 ；SEQ ID NO. 7 的残基 50-56 ；SEQ ID N0. 7 的残 S 89-98 ；SEQ ID NO. :8 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :8 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :8 的残 基 100-110 ;SEQ ID NO. :9 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :9 的残基 21-27 ;SEQ ID NO. :9 的残 基 90-98 ；SEQ ID N0. 10 的残基 31-35 ； SEQ ID N0. 10 的残基 50-65 ；SEQ ID N0. 10 的 残基 98-107 ;SEQ ID NO. 11 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. 11 的残基 50-56 ;SEQ ED NO. 11 的残基 89-97 ；SEQ ED N0. 12 的残基 31-37 ； SEQ ID N0. 12 的残基 52-67 ；SEQ ID N0. 12 的残基 100-108 ； SEQ ID N0. 13 的残基 24-35 ； SEQ ID N0. 13 的残基 51-57 ； SEQ ED N0. 13 的残基 90-98 ;SEQ ID NO. 14 的残基 31-35 ;SEQ ID NO. 14 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. ID NO. : 15 的残基 24-40 ;SEQ ID NO. : 15 的残基 56-62 ;SEQ ID NO. :15 的残基95-103 ;SEQ ID NO. :16 的残基31-37 ;SEQ ID NO. : 16 的残基52-67 ;SEQ ID NO. 16 的残基 100-109 ； SEQ ID NO. 17 的残基 24-35 ； SEQ ID NO. 17 的残基 51-57 ； SEQ ID NO. 17 的残基 90-98 ； SEQID NO. 18 的残基 31-35 ； SEQ ID N0. 18 的残基 20-36 ； SEQ ID N0. 18 的残基 99-108 ;SEQ ID NO. 19 的残基 24-34 ;SEQ ID NO. 19 的残基 50-56; SEQ ID N0. 19 的残基89-97 ;SEQ ID NO. :20 的残基31-35 ;SEQ ID NO. :20 的残基52-67; SEQ ID N0. 20 的残基 100-108 ；SEQ ID N0. 21 的残基 24-35 ；SEQ ID N0. 21 的残基 51-57 ；SEQ ID N0. 21 的残基 90-98 ；SEQ ID N0. 22 的残基 31-35 ；SEQ ID N0. 22 的残S 50-66 ；SEQ ID NO. :22 的残基99-116 ;SEQ ID NO. :23 的残基 24-39 ;SEQ ID NO. :23 的 残基 55-61 ;SEQ ID NO. :23 的残基 94-102 ;SEQ ID NO. :24 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. 24 的残基52-67 ;SEQ ID NO. :24 的残基 100-109 ;SEQ ID NO. :25 的残基24-35 ;SEQ ID NO.
25的残基51-57 ;SEQ ID NO. 25 的残基90-98 ；SEQ ID NO. :26 的残基31-37 ;SEQ ID NO.
26的残基 52-67 ；SEQ ID N0. 26 的残基 100-109 ；SEQ ID N0. 27 的残基 24-35 ；SEQ ID NO. :27 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :27 的残基90-98 ;SEQ ID NO. :28 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. 28 的残基 52-67 ；SEQ ID N0. 28 的残基 100-108 ；SEQ ID N0. 29 的残基 24-35 ；SEQ ID NO. :29 的残基 51-57 ;SEQ BD NO. :29 的残基 90-98 ;SEQ ID NO. :30 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :30 的残基52-67 ;SEQ ID NO. :30 的残基99-109 ;SEQ ID NO. :31 的残基24-35 ;SEQ ID NO. :31 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :31 的残基 90-98 ;SEQ ID NO. :32 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. 32 的残基 52-67 ；SEQ ID N0. 32 的残基 100-109 ；SEQ ID N0. 33 的残基 24-35 ； SEQ ID NO. :33 的残基51-57 ;SEQ ID NO. :33 的残基90-98 ;SEQ ID NO. 34 的残基31-37 ； SEQ ID N0. 34 的残基 52-67 ；SEQ ID N0. 34 的残基 100-108 ；SEQ ID N0. 35 的残基 24-35 ；SEQ ID NO. :35 的残基51-57 ;SEQ ID NO. :35 的残基90-98 ;SEQ ID NO. :36 的残基 31-35 ；SEQ ID NO. :36 的残基 50-66 ;SEQ ID NO. :36 的残基 99-116 ;SEQ ID NO. :37 的残 S 24-39 ；SEQ ID NO. :37 的残基 55-61 ；SEQ ID NO. :37 的残基 94-102 ;SEQ ID NO. :38 的 残基 31-35 ;SEQ ID NO. :38 的残基 50-66 ;SEQID NO. :38 的残基 99-108 ;SEQ ID NO. 39 的残基 24-35 ;SEQ ID NO. :39 的残基 51-57 ;SEQ ID NO. :39 的残基 90-98 ;SEQID NO. 40 的残基 31-37 ;SEQ ID NO. :40 的残基 52-67 ;SEQ ID NO. :40 的残基 97-109 ;SEQ ID NO. 41 的残基 24-40 ;SEQ ID NO. :41 的残基 56-62 ;SEQ ID NO. :41 的残基 95-103。优选地， 结合蛋白包括至少3个⑶Rs。在另一个优选实施方案中，结合蛋白包括一个Vh结构域。优选地，Vh结构域包括选 自下面的氨基酸序列SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQID NO 18 ；SEQ ID NO 20 ；SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ；SEQ ID NO 34 ；SEQ ID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；和SEQ ID NO :40。在另一个实施方案中，结合蛋白包括一个Vl结构域。优选地， Vl结构域包括选自下面的氨基酸序列=SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SET M NO 29 ；SEQID NO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQID NO 39 ；禾口 SEQID NO :41。在一个优选的实施方案中，结合蛋白包括一个Vh和一个\结构域。更优选地，结 合蛋白包括包括选自下面的氨基酸序列的Vh结构域SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQ ID NO 18 ；SEQ ID NO 20 ；SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ； SEQID NO 34 ；SEQ ID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；和SEQ ID NO :40和包括选自下面的氨基酸序 列的 \ 结构域SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ；SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ IDNO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQ ID NO :39 JPSEQ ID NO :41。最优选地，结合蛋白包括包括SEQ ID NO :7的氨基酸序列的Vl结构域和包括SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Vh结构域。在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人IgM恒定区；人IgGl恒定区； 人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免 疫球蛋白恒定区。优选地，重链免疫球蛋白恒定区是人IgGl恒定区。优选地，重链恒定区 中至少一个氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改变。更优选地，人IgGl恒定区 包括选自SEQ ID NO. :2，和SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人IgK恒定区，和人IgX恒定区 的轻链免疫球蛋白恒定区。优选地，人IgK恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4，人化入 恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO. :5ο在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻 链恒定区；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 7的氨基 酸序列的Ig轻链可变区。在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重链恒 定区；具有SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 6的氨基酸序列 的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。在另一个实施方案中，结合选自免疫球蛋白分子或者本领域公知的其功能变体， 所述变体保持结合蛋白的特征结合性质。具体免疫球蛋白实施方案的例子包括但不限于 scFv ；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab'片段； F(ab' )2;Fv;二硫键连接的Fv，和双特异性或双重特异性抗体。最优选地，结合蛋白是人 抗体。本发明的另一方面提供了中和结合蛋白，其包括上文公开的结合蛋白的任一种， 其中中和结合蛋白能中和IL-18。优选地，中和结合蛋白能结合中和人IL-18原；成熟-人 IL-18或截短的-人IL-18中的任何一种。在另一个实施方案中，中和结合蛋白减小了 IL-18结合其受体的能力。优选地，中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截 短的-人IL-18结合其受体的能力。在另一个实施方案中，中和结合蛋白能抑制选自下面的IL-18生物活性中的一 种或几种Thl 调节；Th2 调节(Nakanishi K.，等(2001)Cytokine and Growth Factor Rev. 12 53-72) ；Nk调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞 调节；e嗜酸性细胞调节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细 胞募集调节。在优选的实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(Kd)最大大约 IO-7M ；最大大约ΙΟ-、；最大大约ΙΟ-、；最大大约10_10M ；最大大约IiT11M ；最大大约ICT12M ； 最大大约1(Γ13Μ。在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的生成速率至少大约 IO2IT1S-1 ；至少大约IO3IT1S-1 ；至少大约IO4MY1 ；至少大约IO5MY1 ；至少大约IO6MW在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的离解速率最大大约ΙΟ、—1 ； 最大大约ΙΟ、—1 ；最大大约ΙΟ、—1 ；最大大约KTfV1。本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中任何一种的标记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物结合。优选地，可检测标记物选自放射性标记物，酶，荧光 标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。更优选地，放射性标记物是 3H, 14C, 35S, 90Y, "Tc, 111In, 125I，131I，177Lu, 166Ho,或 153Sm。本发明的另一方面提供一种包括上面公开的结合蛋白中任何一种的结合蛋白，其 中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质结合。优选地，所述治疗性或细胞毒性物质选自 抗_代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗_血管生成药物；抗_有丝分裂 物质；蒽环霉素A ；毒素；编程性细胞死亡剂。一个实施方案允许分离编码上述公开的结合蛋白中的任何一种的核酸。另 一个实施方案提供包括分离的上面公开的核酸的载体，其中所述载体选自pcDNA; pTT (Durocher 等，Nucleic Acids Research 2002, Vol 30，No. 2) ；pTT3 (有另外多个克隆位 点的 pTT ;pEFBOS(Mizushima，S.禾口 Nagata，S. ， (1990) Nucleic acids Research Vol 18， No. 17) ；pBV ；pJV ；和 pBJ0在另一个实施方案中，用载体转染宿主细胞。优选地，宿主细胞是原核细胞。更优 选地，宿主细胞是大肠杆菌。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地，所述真核 细胞选自原生生物细胞，动物细胞，植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物 细胞，包括但不限于，CHO和COS ；或者真菌细胞，例如啤酒糖酵母；或昆虫细胞，例如Sf9。本发明的另一方面提供结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括在足以产生结 合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养上面公开的宿主细胞中的任何一种。另一 个实施方案提供根据上面公开的方法制备的结合蛋白。本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中的任何一种的结晶结合蛋白， 其中所述结合蛋白以晶体存在。优选地，所述晶体是没有载体的药学控制释放晶体。在一 个实施方案中，作为晶体存在的结合蛋白具有比结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留 期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留其生物活性。一个实施方案提供用于释放结合蛋白的成分，其中所述成分包括含有上面公开的 结晶结合蛋白和成分；和至少一种聚合物载体的组合物。优选地，所述聚合物载体选自下面 的一种或几种聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)， 聚(酯)，聚(乳酸)，聚(乳酸_共-羟基乙酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚(γ-己 内酯)，聚(二氧六环酮) ’聚(乙二醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚[(有机)磷 腈]，聚(原酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，马来酸酐_烷基乙烯基醚共聚物，多 聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖， glycaminoglycans，硫酸多糖，它们的混合物和共聚物。优选地，所述成分选自白蛋白，蔗 糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基_ β _环糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。另一个实施方 案提供对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动物施用有效量的上述组合物的步骤。本发明的另一方面提供一种感兴趣的基因的基因表达的调节方法，包括下面的步 骤提供IL-18多肽或IL-18调节剂；和多肽或调节剂接触细胞，其中感兴趣的基因选自下 面 Genbank 鉴定号确定的基因ΝΜ_000389，ΝΜ_002198，ΝΜ_002163, ΝΜ_006144, ΝΜ_006515, ΝΜ_007185, ΝΜ_002288, ΝΜ_003661, ΝΜ_021958, ΝΜ_001335, Hs. 382006, ΝΜ_020125, ΝΜ_007210,ΝΜ_021798,ΝΜ_013324，Μ11313，D88152,ΝΜ_001103,U37519,ΝΜ000697,J03600, ΝΜ_014578, S66793, U47054, L19871, Μ81181, NM 001188， U15460, ΝΜ014417, Ζ23115,NM_001713, U45878, U37546, U72649, U49187, J03507, U50360, XM_071866, NM_005623, Z32765, Z11697, XM071866, U51096, M83667, D87469, L07765, U66468, X14830, L29217, X15880, NM_001851, M27691, M37435, X13589, X16866, X59131, Nu004393, U73328, L19267, U53445, X68277, U48807, NM001950, U87269, M57730, X52541, J04076, X63741, L07077, M62831, M60830, U53786, NM_001988, NM_000141, M23668, U60062, NM_000141, U49973, U89995，U27326，A28102，M25667，L34357,U19523,L01406,U03486,X68285,Z18859,D49958, D43772, AC000099, M57731, X53800, M91036, D16583, X64877, X58431, M16937, NMO14468, X92814, L19314, M26665, D10995, L41147, M24283, S81914, J03171, J00219, NM_000619, NM_000585, U31628, X04500, M27492, X01057, M26062, Y00081, Y00787, Z31695, X06256, X57206, U20734, NM014879, D31762, D42038, NM_005551, NM_014846, X06182, Nu005551, X07730, M13955, M57710, S83362, NM_002314, NM_005569, U49957, U89922, X14008, U59914, D14497, X59727, NM000429, U43944, X72755, NM021230, NM005951, X78710, X70991, M32011, S77763, M58603, S76638, M69043, U91616, D86425, L13740, U44848, U79251, M27288, AF000234, D50640, L20971, L10343, U77735,NM003579,U17034,AB000584,X63131,D11428, NM_032940, NM_005035, NM_003579, M18255, L01087, D38128, Y10375, D15049, M31166, U59877, NM_003579, U64675, S57153, NM_002903, NG_000013, X75042, M83221, NM_000537, U22314, S59049, U70426, U22377, U38480, L10338, M23178, M69203, NM_005409, D79206, NM_005065, NM_004186, J03764, NM_006802, D89077, NM_003037, M91463, D82326, L05568, U96094, X83301，D21267，L31529, M62800, NM_021014, Z35093, NM_005816, L25444, M95787, NM005421, L47345, M57732, NM_003205, M96956, U19878, M92357, M59465, X83490, U37518, NM_003294, U19261, U78798, S69790, U53476, L15309, U78722, X57809, U79249, AB000464, X77744,U79248，AI420129，HG2981-HT3127，HG3548-HT3749，HG870-HT870，HG4333-HT4603， HG3111-HT3287, HG4593-HT4998， HG961-HT961, HG1877-HT1917, HG3115-HT3291， HG4115-HT4385，和 HG3925-HT4195。优选地，调节剂是拮抗剂。更优选地，调节剂是结合蛋白或中和结合蛋白。本发明还提供含有上述结合蛋白或中和结合蛋白和药学可接受载体的药物组合 物。在另一个实施方案中，药物组合物含有至少一种用于治疗其中IL-18活性是有害的 疾病的另外的治疗药物。优选地，所述另外的药物选自血管生成抑制剂(包括但不限于 抗-VEGF抗体或VEGF-诱捕剂)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)；共 同-刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7. 1，抗-B7.2，CTLA4-Ig，抗-⑶20)；粘着分子阻 断剂(包括但不限于抗-LFA-I Abs，抗-E/L选择蛋白Abs，小分子抑制剂)；抗-细胞因子 抗体或者其功能片段(包括但不限于抗-IL-12，抗-TNF，抗-IL-6/细胞因子受体抗体)； 甲氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非甾类抗炎药物。另一方面，本发明提供一种抑制人IL-18活性的方法，包括使人IL-18接触上述结 合蛋白，使得人IL-18活性被抑制。在相关方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有 害的疾病的人患者抑制人IL-18活性的方法，包括对人患者施用上述结合蛋白使得人患者 中的人IL-18活性被抑制，从而实现治疗。优选地，所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关 节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊 椎关节�。�全身红斑狼疮，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状
16腺炎，哮喘，变态反应疾�。�牛皮癣，皮炎硬皮�。�移植物抗宿主�。�器官移植排异(包括但 不限于骨髓和实体器官排异)，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾�。�肉状瘤�。�动脉 粥样硬化，传播性血管凝固，Kaw阿司匹林ki' s�。珿rave' s�。�肾病综合征，慢性疲劳 综合征，Wegener' s内芽肿�。琀enoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝 炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染病，由寄生虫引 起的疾�。�后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髓炎，Huntington' s舞蹈�。�帕金森�。�早老 性痴呆，中风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞， Addison' s病，散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt' s综合征，成人(急性) 呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节�。�关节�。琑eiter' s�。�牛皮癣关节 �。�溃疡性结肠关节�。�肠滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙门氏菌相关关节�。�脊椎关节�。�动脉粥 样化疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱�。�寻常性天疱疮，落叶性天疱疮，类 天疱疮，线性IgA�。�自身免疫溶血性贫血，Coombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年 恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free�。�慢性粘膜皮肤念珠菌�。�巨细胞关节炎，原发硬 化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾�。�乙 肝，丙肝，普通各式各样的免疫缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀心肌�。�女 性不孕症，卵巢衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺�。�起因不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后 间质肺�。�间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾�。�与肺病相关的混合缔结组织 疾�。�与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性关节炎，与肺病相关的全身 红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的Sjogren' s�。�与肺病相关的 僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺�。�与肺病相关的含铁血黄素沉着�。�药物引起的间质肺 �。�辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸润性肺�。�传染病后间 质肺�。�痛风关节炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)， 2_型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘 皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾�。�与器官移植相关的慢性免疫疾 �。�骨关节炎，原发硬化胆管炎，1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性 白细胞减少，肾病N0S，肾小球肾炎，肾microscopic vasulitis,莱姆�。�盘形红斑狼疮，特 发性男性不孕症或N0S，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔结组 织疾病继发性高血压，Goodpasture' s综合征，结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类 风湿性脊椎炎，Still' s�。�全身硬化，Sjogren' s综合征，Takayasu' s病/动脉炎，自 身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺�。�甲状腺机能亢进，甲状腺肿自 身免疫甲状腺机能亢进(Hashimoto' s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢进，原发性粘 液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。�慢性肝�。�酒精性 肝硬化，酒精引起的肝损伤，choleosatatis,特应性肝�。�药物引起的肝炎，非酒精性脂肪 性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁症和精神分裂 症)，Th2型和Thl型介导的疾�。�和癌症，例如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，结肠癌，胰腺癌， 卵巢癌，前列腺癌和直肠癌，和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)。
另一方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患者治疗的方法， 包括在施用上述第二种药物之前，同时，或之后对患者施用上述结合蛋白中的任何一种的 步骤。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和 结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特异性结合人IL-18原。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和 结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和 结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接枝抗体的中和 结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2. 5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争 结合人IL-18。在优选的实施方案中，结合蛋白能结合成熟_人IL-18，但是不特异性结合人 IL-18原。在另一个实施方案中，结合蛋白能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。在另一个 实施方案中，结合蛋白不能与125-2H抗体竞争结合人IL-18。在另一个实施方案中，结合蛋白不能与选自2. 5(E)mgl抗体和IL-18BP的结合蛋 白竞争结合人IL-18。在优选的实施方案中，结合蛋白包括包括SEQ ID NO :9的氨基酸序列的\，和包括 SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Vho在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :2，和SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO :4，和SEQ ID NO 5的氨基酸序列的IG轻 链恒定区；具有SEQ ID NO 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 9的氨基 酸序列的Ig轻链可变区。在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO :3的氨基酸序列的Ig重 链恒定区；具有选自SEQ ID NO 4的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO 8的氨 基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO 9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
具体实施例方式本发明的详细描述本发明提供IL-18结合蛋白，特别是抗-11-18抗体，或者与其结合的其抗原-结 合部分。本发明的各方面涉及抗体和抗体片段，及其药物组合物，以及制备这样的抗体和片 段的核酸，重组表达载体和宿主细胞。本发明还包括使用本发明的抗体体外或体内检测人IL-18，抑制人IL-18活性，和 调节基因表达的方法。本发明还提供截短的IL-18。在相关方面，本发明还提供用于制备截 短的IL-18的核酸，重组表达载体和宿主细胞。除非在这里另有定义，与本发明相关使用的科学和技术定义应该具有本领域技术 人员通常理解的定义。此外，除非上下文必需说明，单数应该包括复数，而复数应当包括单 数。在本说明书中，除非另有说明"或"的意思是"和/或"。此外，术语"包括"，以及 其他形式，例如，第三人称的和过去式的"包括"的使用，是非限制性的。还有，除非另有说 明，术语，例如"元素"或"成分"包括包括一个成分的元素和成分以及包括一个以上子 单位的元素和成分。一般情况下，与这里描述的细胞和组织培养，分子生物学，免疫学，微生物学，遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的术语是本领域公知的和通常使用的。本发 明的方法和技术一般根据本领域公知的常规方法和本说明书引述的和讨论的各种概述性 的和更专业的参考文献来进行，除非另有说明。根据厂商说明书进行酶促反应和纯化技术， 如本领域常规实现的或者如这里描述的。与这里描述的实验步骤，分析化学，合成有机化 学和药物化学技术相关的术语是本领域公知的和通常使用的。化学合成，化学分析，药物制 备，制剂和送药和对患者的治疗是标准技术。下面定义选择的术语，可以更容易理解本发明。这里使用的术语"多肽"指任何氨基酸的聚合链。术语"肽"和"蛋白质"与术 语多肽互换使用，也指氨基酸的聚合链。术语"多肽"包括天然或人造蛋白质，蛋白质片段 和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。术语"分离的蛋白质"或"分离的多肽"是由于其来源或产生来源不与其天然 态下伴随它的天然相关成分相关；基本上没有来自相同物种的其他蛋白质；由不同物种的 细胞表达；或者在自然中不存在的蛋白质或多肽。因此，化学合成或在不同于其天然起源细 胞不同的细胞系中合成的多肽是与其天然相关成分"分离的"。利用本领域公知的蛋白质 纯化技术，通过分离，可以使得蛋白质基本上没有天然相关成分。这里使用的术语"回收"指，例如，利用本领域公知的蛋白质纯化技术，通过分 离，使得化学物质例如多肽基本上没有天然相关成分的方法。这里使用的术语〃 IL-18"，指也已知为干扰素-Y的细胞因子，包括因子 (IGIF)，那是一种促炎性细胞因子，除了诱导扰素-γ的能力外还具有各种功能。与术 语〃 hIL-18"互换使用的术语〃人IL-18"包括SEQ ID NO 1的多肽及其片段，包括但不 限于，人IL-18原，成熟人IL-18原，和保留这里描述的IL-18的生物活性的任何截短的人 IL-18。这里使用的术语〃人IL-18原〃指SEQ ID NO :1的多肽。这里使用的术语〃成熟人 IL-18"，指SEQ ID NO :1的残基37-193，这里使用的术语"截短的人"，指SEQ ID N0:1的 残基59-193。优选地，IL-18，及其片段是生物活性的。这里使用的术语〃重组人IL-18" 或〃 rhlL-18"指利用重组DNA技术体外制备的人IL-18。这里使用的〃 IL-18的生物活性〃指细胞因子IL-18的所有固有的生物学性质。 IL-18的生物学性质包括但不限于结合IL-18受体；促进Thl和Tcl细胞的成熟和激活； 通过几种细胞型促进细胞因子例如TNF，IFN γ和IL-I β的产生；促进巨噬细胞释放细 胞因子例如TNF和IFNy，产生NO ；促进FasL表达，细胞毒性和细胞因子从NK细胞释放 (IFN γ )；促进细胞因子/趋化因子释放，突发性呼吸，颗粒释放，嗜中性白细胞中粘着分子 表达；促进内皮细胞迁移从而促血管生成；促进GAG释放，软骨细胞中MMP和NO产生；促进 某些细胞中C0X2表达；和在某些细胞中减少细胞增殖。关于抗体，蛋白质，或肽与第二化学物质相互作用的这里使用的术语"特异性结 合"或"特异地结合"，意思是相互作用取决于化学物质上特定结构(例如抗原决定簇或 表位)的存在；例如，抗体识别和结合特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对于 表位"Α"是特异性的，含有标记的"Α"和抗体的反应中，含有表位A(或者游离的，没有 标记的Α)，的分子的存在，会减少与抗体结合的标记的A的量。这里使用的术"抗体"，广义上指由四个多肽链构成的任何免疫球蛋白(Ig)分 子两个重链(H)和两个轻链(L)，或者保留Ig分子的基本表位结合特征的其任何功能片段，突变体，变体，或衍生物。这样的突变体，变体，或衍生物抗体形式是本领域公知的。下 面讨论非限制性实施方案。在全长抗体中，每条重链由一个重链可变区(这里缩写为HCVR或VH)和一个重链 恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3构成。每条轻链由一个轻链可变 区(这里缩写为LCVR或VL)和一条轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。 VH和VL区能进一步分为高变区，称作互补性决定区(CDR)，期间散布着更保守的称作构架 区(FR)的区。每条VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨基末端至羧基末端以下面 的顺序排列FR1，CDRl，FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。这里使用的术语，抗体的"抗原-结合部分"(或者简单地"抗体部分")，指保 留特异性结合抗原(例如，hIL-18)能力的抗体的一个或几个片段。已经证明通过全长抗体 的片段能完成抗体的抗原_结合功能。这样的抗体实施方案还可以是双特异性的，双重特 异性的，或多特异性的形式；特异性结合两个或多个不同的抗原。术语抗体的"抗原-结 合部分"所包括的结合片段的实施例包括(i)Fab片段，由VL，VH, CL和CHl结构域构成 的一价片段；(ii)F(ab' )2片段，包括在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片 段；(iii)由VH和CHl结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的 Fv 片段，(v)dAb 片段(Ward 等，(1989)Nature 341 :544_546)，其包括一个可变区；和(vi) 分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL和VH，由不同的基因编码， 利用重组方法，通过使它们制备成其中VL和VH区对形成一价分子(已知是单链Fv(SCFV)； 参见，例如，Bird 等(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)的蛋白质单链的合成接头，能将它们连接。这样的单链抗体也包 括在术语，抗体的"抗原-结合部分"中。也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双 抗体是二价，双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单链多肽上表达，但是使用太短不能在 相同链上两个结构域之间配对的接头，从而使结构域与另一个链的互补结构域配对，产生 两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.，等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 ；Poljak, R. J.，等(1994) Structure 2:1121-1123)。这样的抗体结合部分是本 令页域公知的(Kontermann 禾口 Dubel 编著，Antibody EnRineerinR (2001) SprinRer-VerlaR. New York. 790pp. (ISBN 3-540-41354-5)。此外，抗体或其抗原-结合部分可以是更大的免疫粘着分子，是通过抗体或抗体 部分与一个或几个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的。这样的免疫粘着分子 的；例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区形成四聚体scFv分子(Kipriyanov，S. Μ.， 等(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)，标记肽和 C-末端多组氨酸 标签形成二价的和生物素化 scFv 分子(Kipriyanov, S. Μ.，等(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。抗体部分，例如Fab和F (ab' ) 2片段，能应用常规技术，例如分别对全抗体进 行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化而从全抗体制备。此外，应用这里描述的标准重组DNAa技术 能获得抗体，抗体部分和免疫粘着分子。这里使用的术语"分离的抗体"，意指基本上没有具有不同抗原特异性的其他 抗体的抗体(例如，特异性结合hIL-18的分离的抗体基本上没有特异性结合hIL-18以外 抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-18的分离的抗体具有与其他抗原例如来自其他物种 的IL-18分子的交叉反应性。此外，分离的抗体基本上没有其他细胞材料和/或化学品。
这里使用的术语"人抗体"意指包括具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和 恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基 (例如体外随机或定点诱变或通过体内体突变诱导的突变)，例如在CDRs中，特别是在CDR3 中。然而，这里使用的术语"人抗体"不包括其中CDR序列来自另一个哺乳动物种系例如 小鼠的种系的抗体接枝到人构架序列上。这里使用的术语"重组人抗体"意在包括通过重组方法制备，表达，产生或分 离的所有的人抗体，例如利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(在下面 Il C章节进一步描述)，从重组组合人抗体库分离的抗体(Hoogenboom H. R.，(1997) TIB Tech. 15 :62_70 ；Azzazy H.，和 Highsmith W. E.，(2002)Clin. Biochem. 35 :425_445 ； Gavilondo J. V.，禾口 Larrick J. W. (2002)BioTechniques 29 128-145 ；HoogenboomH., 和Chames P. (2000) Immunology Today 21 :371_378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动 物(例如小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor, L. D.，等(1992) Nucl. Acids Res. 20 6287-6295 ；Kellermann S-A·,禾口 Green L. L. (2002)Current Opinion in Biotechnology 13 593-597 ；Little Μ.等(2000) Immunology Today 21 :364_370)或者通过涉及人免疫球 蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备，表达，产生或分离的抗体。这样的 重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。但是在一些实施方案中，对 这样的重组人抗体体外诱变(或者，当体内体诱变使用人Ig序列的转基因动物时)，从而 重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是来自体内人抗体种系全部中天然并不存在的人种系 VH和VL序列或者与人种系VH和VL序列相关的序列。术语"嵌合抗体"指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个 物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重链和轻链可变区的抗体。术语"⑶R-接枝抗体“指包括来自一个物种的重链和轻链可变区，但是其中序 列中VH和/或VL中一个或几个CDR区被另一个物种的CDR序列置换，例如具有其中一个 或几个鼠⑶Rs (例如，⑶R3)被人⑶R序列置换的鼠重链和轻链可变区的抗体。术语"人源化抗体"指包含来自非人物种(例如小鼠)但是其中VH和/或VL序 列中至少一部分被变为更“人_样”，即人种系可变序列更相似的重链和轻链可变区序列的 抗体。人源化抗体的一种类型是CDR-接枝抗体，其中人CDR序列导入非人VH和VL序列置 换相应的非人CDR序列。如这里使用的，术语〃 hIL-18中和结合蛋白〃指特异性结合hIL-18并且中和 hIL-18的生物活性的蛋白质。优选地，中和结合蛋白是其与hIL-18的结合导致hIL-18的 生物活性被抑制的中和抗体。优选地，中和结合蛋白结合hIL-18并且将hIL-18的生物活 性减小至少大约20%，40%，60%，80%，85%或更多。中和结合蛋白对hIL_18的生物活性 的这种抑制作用能通过测定hIL-18生物活性的一个或几个指标来评定。hIL-18生物活性 的这些指标能通过本领域公知的体外或体内分析的几种标准方法中的一种或几种来评定。术语"表位"包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。 在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基这样的分子的化 学活性表面基团，并且在一些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定电荷 特征。表位是抗体结合的抗原的区。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大 分子复合混合物中其靶物抗原时，抗体特异性结合抗原。
21Koff"，意指本领域公知的抗体从抗体/抗原复合体离解的 Kd"，意指本领域公知的特定抗体_抗原相互作用的离解常如这里使用的术语"表面等离振子共振"指一种光学现象，它使得通过检测生物 传感器基体中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用，例如利用BIAcore系统 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)。为了进一步描述，参 见 Jonsson，U.，等(1993)Ann. Biol. Clin. 51 19-26 ;Jonsson，U.，等(1991)Biotechniques 11 620-627 Johns son, B.，等(1995) J. Mol. Recognit. 8 125-131 ；和 Johnnson, B.，等 (1991)Anal. Biochem. 198 :268_277。如这里使用的术语〃 K。n"，意指本领域公知的抗体与抗原缔合生成抗体/抗原复 合体的生成速率常数。如这里使用的术语' 离解速率常数。如这里使用的术语" 数。如这里使用的术语"标记的结合蛋白"，指带有插入的标记物提供结合蛋白鉴定 的蛋白质。优选地，标记物是可检测标记，例如插入放射性标记的氨基酸或连接标记的抗生 物素蛋白能检测的生物素基部分的多肽(例如，包含荧光标记物或者光学或比色方法能检 测的酶活性的链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记物的例子包括但不限于下面的放射性同 位素或放射性核素(例如，3H，14C，35S，9°Y，99TC，mIn，125I，131I，177LU，166H0，或 153Sm)；荧光标 记物(例如，FITC，罗丹明，镧系磷光剂)，酶学标记(例如，辣根过氧化物酶，荧光素酶，碱 性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；预先确定的第二报告基团识别的多肽表位(例 如，亮氨酸拉链对序列，二次抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)；和有吸引力的 试剂，例如钆螯合剂。术语"缀合结合蛋白"指与第二化学部分，例如治疗性药物或细胞毒性试剂， 化学连接的结合蛋白。术语"试剂"在这里用来指化合物，化合物的混合物，生物大分 子，或者从生物材料制备的提取物。优选地，治疗性药物或细胞毒性试剂包括但不限于， 百日咳毒素，紫杉酚，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷， tenoposide,长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素二酮，二羟蒽 二酮，光辉霉素，放线菌素D，l_脱氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘 洛尔，和嘌呤霉素，和它们的类似物或同系物。这里使用的术语"结晶结合蛋白"指以晶体形式存在的多肽。晶体是一种固态形 式，它与其他形式例如无定形固态或液晶态截然不同。晶体由原子，离子，分子(例如蛋白 质，象抗体)，或分子集合体(例如抗原/抗体复合体)有序的重复的三维排列组成。这些三 维排列根据本领域公知的特殊数学关系排列。晶体中重复的基础单元，或者构件，称作不对 称单元。证实给出确定的结晶学对称性的排列中重复的不对称单元提供晶体的"晶胞"。 所有三个方向规则转换的晶胞的重复得到晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach,2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)“。这里称作"多核苷酸"的术语在这里指两个或多个核苷酸，核糖核酸或脱氧核糖 核酸或任何类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语包括单链和双链形式的DNA，但是优 选双链DNA。
这里使用的术语"分离的多核苷酸"意思是多核苷酸(例如基因组的，cDNA，或 者合成来源，或者它们的组合)，其由于其来源，“分离的多核苷酸"与自然界发现"分离 的多核苷酸"的多核苷酸的全部或部分不相缔合；与自然界不连接的多核苷酸操作连接； 或者在自然界不作为更大序列的部分而存在。这里使用的术语"载体"意指能将它所连接的另一个核酸转运的核酸分子。载体 的一种类型是"质粒"，它指其中可以连接另外的DNA片段的环状双链DNA环。载体的另 一种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段连接到病毒基因组中。一些载体能在导入它们 的宿主细胞中自主复制(例如，有细菌复制起点的细菌载体和游离基因哺乳动物载体)。其 他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能被整合到宿主细胞的基因 组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能指导它们操作连接的基因的表达。这 样的载体在这里称作"重组表达载体"(或者简单地，"表达载体")。一般情况下，重 组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书中，“质粒"和"载体"可以互 换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意在包括这样的表达载体的其他形 式，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒，腺病毒和腺-相关病毒，它们起着同等的功 能。术语"操作连接"指其中将描述的成分相关联使得它们以期望的方式发挥功能 的连接。与编码序列"操作连接"的调控序列以这样的方式连接使得在与调控序列相匹配 的条件下实现编码序列的表达。“操作连接"序列包括与感兴趣的基因邻接的表达调控序 列和以反式起作用或者与感兴趣的调控基因有距离的表达调控序列。这里使用的"表达调控序列"指进行表达和加工它们连接的编码序列所必需的 多核苷酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序列，中止序列，启动子和增强子序列； 有效RNA加工信号，例如剪接和多腺苷酸酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率 的序列(剂，Kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；如果期望，增强蛋白质分泌的序 列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这样的调控序列一般包括 启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，一般情况下，这样的调控序列包 括启动子和转录终止序列。术语"调控序列"意在包括其存在对于表达和加工是必须的成 分，并且还包括其存在是有利的附加成分，例如前导序列和融合配对物序列。这里定义的"转化"指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。利用本领域公知的各 种各样的方法在天然或人为条件下可以发生转化。转化可以依赖公知的方法将外来核酸 序列插入原核或真核宿主细胞。根据转化的宿主细胞选择方法并且包括但不限于，病毒感 染，电穿孔，脂质转染，和粒子轰击。这样的"转化"细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的 DNA能作为自身复制质粒或者作为宿主染色体的部分复制。它们还可以包括瞬时表达插入 的DNA或RNA有限时间的细胞。这里使用的"重组宿主细胞"(或者简单地"宿主细胞")意指其中已经导入外 源DNA的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定受体细胞，而且还有这样的细胞的后 代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生一些改变，这样的后代事实上可能与母本 细胞不同，但是它仍然包括在这里使用的术语"宿主细胞"的范围内。优选地，宿主细胞包 括选自生命界任何原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生物，真菌，植物和动物细 胞。最优选地，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO和COS ；
23昆虫细胞系Sf9 ；和真菌细胞啤酒糖酵母。标准技术可以用于重组DNA，寡核苷酸合成，和组织培养和转化(例如，电穿孔， 脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据厂商说明书进行或者以本领域常规做法或者 根据这里的描述进行。上述技术和方法一般根据本领域公知的常规方法和各种概述和更 具体说明的参考文献的描述进行，这些参考文献在本说明书中引述并讨论。参见，例如， Sambrook 等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二版，冷泉港出版社，冷泉港， 纽约(1989))，这里为了所有的目的引作参考。正如本领域公知的和这里使用的，“转基因生物"，指有包含转基因的细胞的生 物，其中导入生物体中的转基因(生物体的祖先)表达在生物体中天然并不表达的多肽。“ 转基因"是DNA构建体，其稳定操作整合导产生转基因生物体的细胞的基因组中，在转基 因生物的一种或几种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。术语"调控"和"调节"互换使用，如这里使用的，指感兴趣的分子活性(例如， hIL-18的生物活性)的变化或改变。调控可以是感兴趣的分子的某些活性或功能大小的增 加或减小。举例的分子的活性和功能包括但不限于，结合特征，酶活性，细胞受体激活，和信 号转导。相应地，这里使用的术语"调节剂"是能改变或变化感兴趣的分子的活性或功能 (例如，hIL-18的生物活性)的化合物。例如，调节剂可以引起分子的某些活性或功能的大 小与不存在调节剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大或降低。在一些实施方案中， 调节剂是抑制剂，其降低分子的至少一种活性或功能大小。举例的抑制剂包括但不限于蛋 白质，肽，抗体，，P印tibodies，碳水化合物或小有机分子。P印tibodies描述于，例如，WO 01/83525。这里使用的术语"激动剂"指一种调节剂，其当与感兴趣的分子接触时，引起分 子的某些活性或功能的大小与不存在激动剂所发现的活性或功能的大小相比有所增大。特 别感兴趣的激动剂包括但不限于，IL-18多肽，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其 他分子。这里使用的术语"拮抗剂"或"抑制剂"指一种调节剂，其当与感兴趣的分子接 触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在拮抗剂所发现的活性或功能的大小相比 有所增大。特别感兴趣的拮抗剂包括阻断或调节hIL-18的生物学或免疫学活性的那些。 hIL-18的拮抗剂和抑制剂包括但不限于，蛋白质，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何 其他分子。这里使用的术语"样品"以其广义使用。这里使用的"生物样品"包括但不限 于，来自活体或活体前的一定量物质。这样的活体包括但不限于，人，小鼠，大鼠，猴，狗，兔 和其他动物。这样的物质包括但不限于，血液，血清，尿液，滑液，细胞，器官，组织，骨髓，淋 巴结和脾。这里使用的，一般公知的，本领域技术人员使用的，术语"竞争"，指一种蛋白质 与第二种结合蛋白结合这两种结合蛋白共同的配体(例如，IL-18)的相互干扰或者阻碍的 能力。用于测定结合蛋白的竞争特征的试验是本领域公知的。这里描述优选的竞争试验。I.结合人IL-18的人抗体本发明的一个方面提供以高亲合力，低解离速率和高中和能力，结合IL-18分离的人抗体，其抗原结合部分。优选地，抗体，或者其部分是分离的抗体。优选地，本发明的人 抗体是中和人抗-IL-18抗体。A.抗IL-18抗体的制备方法通过本领域公知的多种技术可以制备本发明的抗体。制备本发明的抗-IL-18抗 体的特别优选的方法包括使用XEN0M0USE转基因小鼠，并且使用本领域公知的用于制备抗 体的杂交瘤和SLAM细胞操作技术(Abgenix，Inc.，Fremont, CA)，并且使用包括实施例3. 2 描述的IL-18肽的抗原，即，包括SEQ ID NO. 1的氨基酸序列和其片段的人IL-18。在本发明的一个实施方案中，通过用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座全 部或部分的非人动物制备人抗体。在优选的实施方案中，非人动物是XEN0M0USE转基因小 鼠，包括人免疫球蛋白基因座的大片段并且在小鼠抗体产生中缺乏的基因工程小鼠品系。 参见，例如，Green 等 Nature Genetics 7 :13_21(1994)和美国专利 5，916，771，5，939，598， 5，985，615,5, 998，209,6, 075，181,6, 091，001,6, 114，598 和 6，130，364。还参见 1991 年 7 月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31日公 开的 W 96/34096 和 W 96/33735，1998 年 4 月 23 日公开的 W098/16654，1998 年 6 月 11 日公开的WO 98/24893，1998年11月12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的 W099/45031，1999 年 10 月 21 日公开的 WO 99/53049，2000 年 2 月 24 日公开的 WO 0009560, 和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XEN0M0USE转基因小鼠产生全人抗体的成 人_样人抗体库，并且产生抗原_特异性人Mabs. XEN0M0USE转基因小鼠通过导入兆碱基大 小的，人重链基因座和χ轻链基因座的种系构型YA片段而包含大约80%人抗体库。参见 Mendez 等，Nature Genetics 15 146—156 (1997)，Green 禾口 Jakobovits J. Exp. Med. 188 483-495(1998)，其公开内容引作参考。本发明还提供了通过免疫包括人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物从非人非 小鼠动物制备抗-IL-18抗体的方法。人们可以利用上面刚描述的方法制备这样的动物。这 些专利文献中公开的方法可以根据美国专利5，994，619的描述改进。在优选实施方案中， 非人动物可以是大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。在另一个实施方案中，包括人免疫球蛋白基因座的非人动物是人免疫球蛋白“小 基因座”的动物。在小基因座研究中，通过从Ig基因座包含各个基因来模拟外源Ig基因座。 这样，一个或几个Vh基因，一个或几个Dh基因，一个或几个Jh基因，一个μ恒定区，和一个 第二恒定区(优选Y恒定区)形成用于插入动物中的构建体。这项研究具体描述于美国 专利 No. 5，545，807，5，545，806，5，625，825，5，625，126，5，633，425，5，661，016，5，770，429， 5，789，650,5, 814，318,5, 591，669,5, 612，205,5, 721，367,5, 789，215，和 5，643，763，这里 引作参考。小基因座研究的好处是快捷，能产生包括Ig基因座的部分的构建体并且导入动 物中。然而，小基因座研究的潜在的缺点是可能没有足够的免疫球蛋白多样性来支持全 B-细胞发育，使得抗体产生较少。为了制备人抗-IL-18抗体，用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白基因座的一些或 全部的非人动物，并且从动物分离抗体或产生抗体的细胞。IL-18抗原可以是分离的和/或 纯化的IL-18，并且优选是人IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是IL-18的片段，优 选成熟IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是包括至少一个IL-18的表位的片段。
对动物的免疫可以通过本领域公知的任何方法来进行。参见，例如，Harlow和 Lane, Antibodies =A Laboratory Manual，纽约冷泉港出版社，1990。对非人动物例如小 鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，�：吐斫�行免疫的方法是本领域公知的。参见，例如，Harlow和 Lane，美国专利5，994，619。在优选的实施方案中，IL-18抗原与辅助剂一起施用刺激免疫 应答。这样的辅助剂包括完全或不完全福氏佐剂，RIBI (胞壁酰二肤)或ISCOM(免疫刺激 复合体)。这样的辅助剂通过局部沉积分离它而可以保护多肽不快速散播，或者它们可以 含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他成分有趋化性的物质。优选地，如果施用 多肽，免疫程序包括施用两次或多次多肽，延续几周。实施例2. 2. A提供用磷酸盐缓冲盐水中人IL-18免疫XEN0M0USE转基因小鼠的方案。B.抗体和产生抗体的细胞系的产生用IL-18抗原免疫动物之后，可以从动物获得抗体和/或产生抗体的细胞。通过 从动物取血或杀死动物而从动物获得含有抗-IL-18抗体的血清。可以使用从动物获得的 血清，从血清获得的免疫球蛋白级分，或者从血清纯化的抗-IL-18抗体。以这种方式获得 的血清或免疫球蛋白是多克隆的，因此带有一系列异源性质。在另一个实施方案中，可以从受免疫动物制备产生抗体的无限繁殖杂交瘤。免疫 之后杀死动物，并且根结本领域公知的，将B脾细胞与无限繁殖骨髓瘤细胞融合。参见，例 如，Harlow和Lane，上文。在优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分 泌细胞系)。融合抗生素选择之后，使用IL-18，或者其部分，或表达IL-18的细胞筛选杂交 瘤。在优选实施方案中，利用酶联免疫分析(ELISA)或者放射免疫分析(RIA)进行最初的 筛�。�优选ELISA。WO 00/37504中提供了 ELISA筛选的实施例，这里引作参考。选择产生抗-IL-18抗体的杂交瘤，克�。�并且进一步筛选期望的特征，包括强健 杂交瘤生长，高抗体产生和期望的抗体特征，下面进一步讨论。培养杂交瘤并且在同源动物 体内，在没有免疫系统的动物，例如，裸鼠，中展开，或者在培养基中体外培养。筛�。�克隆和 扩展杂交瘤的方法是本领域技术人员公知的。优选地，免疫动物是表达人免疫球蛋白基因并且B脾细胞与来自和非人动物相同 物种的骨髓瘤融合的非人动物。更优选地，免疫动物是XEN0M0USE转基因小鼠，骨髓瘤细胞 系是非-分泌小鼠骨髓瘤，例如骨髓瘤细胞系是P3X63Ag8.653(参见，例如，实施例2. 2. B)。一方面，本发明提供产生人抗-IL-18抗体的杂交瘤。在优选的实施方案中，杂交 瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另一个优选的实施方案中，杂交瘤是在非人非小鼠物种中产 生的，例如大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人 非分泌骨髓瘤与表达抗-IL-18抗体的人细胞融合。在本发明的另一个方面，利用本领域称作筛选淋巴细胞抗体方法(SLAM)的 方法从单一的分离的淋巴细胞制备重组抗体，如美国专利No. 5，627，052，PCT公开WO 92/02551，和 Babcock，J. S.等(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7843_7848 所述。在该 方法中，应用抗原特异性溶血血小板测试来筛选I(A)章节中描述的任何一种免疫动物得 到的分泌感兴趣的抗体的单一细胞，例如淋巴细胞，在抗原特异性溶血血小板测试中，抗原 IL-18，或者其片段，利用接头，例如生物素，与绵羊红细胞偶联，并且用来鉴定分泌对IL-18 有特异性的抗体的单一细胞。鉴定感兴趣的分泌抗体的细胞之后，通过逆转录酶-PCR从细胞获得重链和轻链可变区cDNAs，然后在哺乳动物细胞例如COS或CHO细胞中，在合适的免 疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)的上下游表达这些可变区。用来自体内筛选的淋巴细 胞的扩增的免疫球蛋白序列转染宿主细胞，然后进一步分析并体外筛�。�例如通过使转染 细胞分离表达抗IL-18抗体的细胞。进一步体外操作扩增的免疫球蛋白序列，例如通过体 外亲和性成熟方法，例如PCT公开WO 97/29131和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。也可以利用体外方法来制备本发明的抗体，其中筛选抗体库来鉴定具有期望的结 合特异性的抗体。这样筛选重组抗体库的方法是本领域公知的并且包括例如下面文献中 描述的方法=Ladner 等，美国专利 No. 5，223，409 ；Kang 等，PCT 公开 No. W092/18619 ；Dower 等，PCT 公开 No. WO 91/17271 ；Winter 等，PCT 公开 No. WO 92/20791 ；Markland 等，PCT 公 开 No. WO 92/15679 ；Breitling 等，PCT 公开 No. WO 93/01288 ；McCafferty 等，PCT 公开 No. WO 92/01047 ;Garrard 等，PCT 公开 No. WO 92/09690 ；Fuchs 等(1991) Biol Technology 9 1370-1372 ;Hay 等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3 :81_85 ;Huse 等(1989)Science 246 1275-1281 ；McCafferty 等，Nature(1990) 348 :552_554 ；Griffiths 等，(1993)EMBO J 12 725-734 ；Hawkins 等(1992) J Mol Biol 226 :889_896 ；Clackson 等(1991)Nature 352 :624-628 ;Gram 等(1992) PNAS 89 :3576_3580 ;Garrad 等(1991) Bio/Technology 9 1373-1377 ;Hoogenboom等(1991) Nucl Acid Res 19 :4133_4137 JPBarbas 等(1991) PNAS 88 :7978-7982，美国专利申请公开20030186374，和PCT公开No. WO 97/29131，这些文献的 内容在此引作参考。重组抗体库可以来自用IL-18，或IL-18的部分免疫的受试者。或者，重组抗体库 可以来自裸受试者，即，没有用IL-18免疫的受试者，例如从没有用人IL-18免疫的人受试 者获得的人抗体库。通过用包括人IL-18的肽(例如，相应于hIL-18的部分的肽)筛选重 组抗体库来筛选本发明的抗体，从而筛选识别IL-18的那些抗体。实施这样的筛选和选择 的方法是本领域公知的，例如上一段中的参考文献中描述的的。为了筛选对hIL-18具有特 定的结合亲和性的本发明的抗体，例如以特定解离速率常数从人IL-18离解的那些，能利 用本领域公知的表面等离振子共振的方法来筛选具有期望的解离速率常数的抗体。为了筛 选对hIL-18具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特殊IC5tl的那些，可以利用本领 域公知的评价hIL-18活性的抑制作用的本领域公知的标准方法。一方面，本发明提供分离的抗体，或者结合人IL-18的其抗原结合部分。优选地， 抗体是中和抗体。优选地，抗体是人抗体。在很多实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆 抗体。本发明最优选的中和抗体在这里称作2. 5(E)，并且具有SEQ ID NO :7的氨基酸序列 的VL和SEQ ID NO 6的氨基酸序列的VH。最优选地，2. 5 (E)抗体结合人IL-18，Kd小于 5xl01QM (参见实施例2. 2. F)。优选地，本发明的抗-IL-18抗体，例如2. 5(E)抗体和相关抗体，具有减小或中和 IL-18活性的能力，例如，根据本领域公知的几种体外和体内测试所测定的(例如，参见实 施例3. 2. F)。例如，这些抗体中和KG-I细胞中人Y干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值 的范围至少大约10_8M，大约10_9M，或者大约ΙΟ,Μ。此外，这些抗体还中和全血细胞中人Y 干扰素的IL-18-诱导的产生，IC5tl值的范围至少大约10_8Μ，大约10_9Μ，或者大约10_1QM。在特别优选的实施方案中，抗-IL-18抗体2. 5 (E)结合各种形式的人IL-18，包 括IL-18原，成熟IL-18和截短的IL-18。抗体2. 5 (E)不特异性结合其他细胞因子，例如IL-2, IL-3, IL-4, IL-5，IL-6，, IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16， 11^-17，11^-21，1咿，1^(淋巴毒素)，1^0 13 2，和1^0 2旦1。但是，抗体2. 5 (E)与来自其 他物种的IL-18没有交叉反应性。例如，抗体中和来自cynomolgus猴的IL-18的活性(IC5tl for cyno IL-18 = 9. EX 1(Γ"；参见实施例 2. 2. Jl)。一方面，本发明提供2. 5(E)抗体和功能抗体部分，2. 5 (E)-相关抗体和功能抗体 部分，与2. 5(E)等同性质的其他人抗体和功能抗体部分，例如以低离解动力学和高中和能 力结合IL-18的高亲和性。在优选的实施方案中，分离的抗体，或者其抗原_结合部分，结合 人IL-18，根据表面等离振子共振所测定的，其中抗体，或者其抗原-结合部分，其中抗体， 或者其抗原_结合部分，以大约0. Is"1或更小的K。ff速率常数从人IL-18离解，或者其以大 约IxlO-6M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体， 或者其抗原_结合部分，可以以大约IxlO-2S-1或更小的K。ff速率常数从人IL-18离解，或者 其以大约IxlO-7M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定 的，抗体，或者其抗原_结合部分，可以以大约IxlO-3S-1或更小的K。ff速率常数从人IL-18 离解，或者其以大约IxlO-8M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共 振所测定的，抗体，或者其抗原_结合部分，可以以大约IxlO-4S-1或更小的K。ff速率常数从 人IL-18离解，或者其以大约IxlO-9M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根据表面等 离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原_结合部分，可以以大约IxlO-5S-1或更小的K。ff速 率常数从人IL-18离解，或者其以大约ΙχΙΟ,Μ或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。或者，根 据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约IxlO-5S-1或更小 的K。ff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1X10_"M或更小的IC5tl抑制人IL-18活性。在另一个实施方案中，本发明提供分离的人抗体，或其抗原结合部分，具有包括 SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 11 ；SEQ ID NO 13 ；SEQ ID NO 15 ；SEQ ID NO 17 ； SEQ ID NO 19 ；SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO 23 ；SEQ ID NO 25 ；SEQ ID NO 27 ；SEQ ID NO 29 ；SEQ ID NO 31 ；SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO 35 ；SEQ ID NO 37 ；SEQ ID NO 39 ；或 SEQ ID NO :41的氨基酸序列的轻链可变区(VL)，和包括SEQ ID NO 6 ；SEQ ID NO 8 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 12 ；SEQ ID NO 14 ；SEQ ID NO 16 ；SEQ BD NO 18 ；SEQID NO 20 ； SEQ ID NO 22 ；SEQ ID NO 24 ；SEQ ID NO 26 ；SEQ ID NO 28 ；SEQ ID NO 30 ；SEQ ID NO 32 ； SEQ ID NO 34 ；SEQID NO 36 ；SEQ ID NO 38 ；或 SEQID NO 40 的氨基酸序列的重链可变区 (VH)。在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgGl重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗 体包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。或 者，抗体部分可以是，例如，Fab片段或单链Fv片段。Fc部分中氨基酸残基的置换改变抗体效应子功能是本领域公知的(Winter，等， 美国专利No. 5，648，260 ；5624821)。抗体的Fc部分介导几种重要效应子功能，例如细胞因 子诱导，ADCC，吞噬作用，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体和抗原_抗体复合体的半衰期 /清除率。在一些情况下；对于治疗性抗体，这些效应子功能是所期望的，但是在另一些情 况下可能是不需要的甚至是有害的，取决于治疗目标。一些人IgG同位型，特别是IgGl和 IgG3,分别通过与Fc y Rs和补体Clq结合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体的循环半衰期的关键成分。在另一个实施方案中，抗体的恒定区例如抗体的Fc区中至 少一个氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改变。一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体部分被衍生化或 者连接另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白质)。例如，通过将本发明的抗体或抗体部 分(通过化学偶联，基因融合，非共价结合或者其他)与一个或几个其他分子部分功能连 接，能衍生本发明的标记的结合蛋白，所述其他分子部分例如另一种抗体(例如，双特异性 抗体或二联抗体)，可检测试剂，细胞毒性试剂，药物物质，和/或能介导抗体或抗体部分与 另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。本发明的抗体或抗体部分可以被衍生化的有用可检测试剂包括荧光化合物。举例 的荧光可检测试剂包括荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗丹明，5- 二甲基胺-1-萘磺酰基氯， 藻红蛋白等等。还可以用可检测酶将抗体衍生化，例如用碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡 萄糖氧化酶等等能够。当用可检测酶将抗体衍生化时，通过加入另外的试剂检测它，酶用 来产生可检测反应产物。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨 基联苯胺产生有色反应产物，其是可检测的。也可以用生物素将抗体衍生物化，并且通过间 接测定抗生物素蛋白或链酶抗生物素蛋白结合来测定。本发明的另一个实施方案提供结晶结合蛋白。优选地，本发明涉及这里公开的全 抗-IL-18抗体及其片段的结晶，含有这样的结晶的制剂和组合物。在一个实施方案中，结 晶的结合蛋白具有比结合蛋白的可溶配对物更长的体内半存留期。在另一个实施方案中， 结合蛋白在结晶之后保留了生物活性。根据本领域公知的方法和根据中公开的，可以制备本发明的结晶结合蛋白，WO 02072636在此引作参考(也参见例如2. 2. M)。本发明另一个实施方案提供糖基化结合蛋白，其中抗体或抗原-结合部分包括一 个或几个糖残基。最初的体内蛋白质的产生可以进一步加工，这是翻译后修饰。特别地，糖 (乙二醇)残基可以酶促加上，这个过程是糖基化作用。得到的带有共价连接的寡糖侧链的 蛋白质已知是糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化作用取决于感兴趣的蛋白质的氨基酸 序列，以及其中表达蛋白质的宿主细胞。不同的生物体可以产生不同的糖基化作用酶(例 如，糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同的底物(核苷酸糖类)。由于这样的因素，蛋白质 糖基化模式，糖基残基的成分可以根据其中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。本发明中 使用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，η-乙酰氨基葡萄糖和 唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包括糖基化残基，使得糖基化模式是人的。本领域技术人员公知不同的蛋白质糖基化作用可以产生不同的蛋白质特征。例 如，与哺乳动物例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相比，微生物宿主例如使用酵母内源 途径的酵母中产生的糖基化的治疗性蛋白质的功效可能被减小。这样的糖蛋白在人体中也 可以是免疫原性的并且具有给药后减小的体内半存留期。人和其他动物中的特异受体可以 识别特异糖基残基并且促进蛋白质在血液中的快速清除。其他副作用包括蛋白质折叠，可 溶性，对蛋白酶的灵敏性，运输，转运，区室化，分泌，被其他蛋白质或因子识别，抗原性，或 变应原性的改变。因此，医师可能优选具有特定糖基化作用成分和模式的治疗性蛋白质， 例如与人细胞中或关注的受试者动物的物种-特异性细胞中产生的相同或至少相似的糖 基化成分和模式。
29
通过基因修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，可以实现与宿主细胞不同的糖基化 蛋白质的表达。应用本领域公知的技术，医师可以获得具有人蛋白质糖基化作用的抗体或 其抗原_结合部分。例如，对酵母菌株进行基因修饰来表达非天然存在的糖基化酶，使得这 些酵母菌株中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)具有与动物细胞特别是人细胞产生的相同的 蛋白质糖基化作用(美国专利申请20040018590和20020137134)。此外，本领域技术人员明白，使用经基因工程处理的表达各种糖基化酶的宿主细 胞库，可以表达感兴趣的蛋白质，使得库中成员宿主细胞产生具有不同糖基化作用模式的 感兴趣的蛋白质。医师可以选择并分离具有特定糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。优选 地，具有特定的选择的新的糖基化作用模式的蛋白质具有改善的或改变的生物性质。C.重组IL-18抗体的产生通过本领域公知的各种技术可以制备本发明的抗体。例如，从宿主细胞表达，其中 编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染导宿主细胞中。各种形式的术语"转染" 意在包括通常用于将外源DNA导入原核或真核细胞中的各种技术，例如，电穿孔，磷酸钙沉 淀，DEAE-葡聚糖转染等。虽然有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是在 真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞 (特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有可能装配和分泌适当地折叠并具有免疫活性的抗 体。用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢 细胞(CH0 细胞)(包括 dhfr-CHO 细胞，描述于 Urlaub 和 Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220，与 DHFR 选择标记物一起使用，例如，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982)Mol. Biol. 159 601-621)所述，NSO 骨髓瘤细胞，COS 细胞和 SP2 细胞。当 将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使 抗体在宿主细胞中表达的时间来制备抗体，或者，更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生 长的培养基中。利用标准蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体。宿主细胞还可以用来制备功能抗 体片段，例如Fab片段或scFv分子。理解上述方法中的变化在本发明的范围内。例如，可 以预期用编码本发明的抗体的轻链和/或重链的功能片段的来转染宿主细胞。还可以利用 重组DNA技术来去除对于与感兴趣的抗原结合不是必需的编码轻链和重链之一的DNA的一 些或部分。这样截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明的抗体内。另外，可以制备双 功能抗体，其中一个重链和一个轻链是本发明的抗体，而另一个重链和轻链对于感兴趣的 抗原之外的抗原是特异性的，通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联。在本发明抗体或抗原_结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷酸钙介导的转 染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中， 抗体重链和轻链基因各自操作连接于CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，驱动高水平基因 转录。重组表达载体还带有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤筛选/扩增用载体转染的CHO 细胞的筛选。培养选择的转化子宿主细胞让它表达抗体重链和轻链，并且从培养基回收完 整抗体。利用标准分子生物技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿 主细胞，并且从培养基回收抗体。本发明还提供通过在合适的培养基中培养本发明的宿主 细胞直到合成本发明的重组抗体来合成本发明的重组抗体的方法。该方法进一步包括从培养基分离重组抗体。表1是本发明优选的抗-hIL-18抗体的VH和VL区的氨基酸序列的表。在VH区 中，氨基末端(n-末端)的位置1中天然存在的氨基酸是谷氨酸(e)或谷氨酰(q)。但是， 为了在包括vh区的蛋白质的大规模生产中产生带有同源n-末端的重组蛋白质，n-末端的 位置1优选谷氨酸(e)。表1 VH和VL区的氨基酸序列列表
权利要求
一种能结合人IL 18的分离的抗体或者其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分包含Ig重链恒定区，其包含选自SEQ ID NO2、和SEQ ID NO3的氨基酸序列；Ig轻链恒定区，其包含选自SEQ ID NO4、和SEQ ID NO5的氨基酸序列；Ig重链可变区，其包含SEQ ID NO6的氨基酸序列；和Ig轻链可变区，其包含SEQ ID NO7的氨基酸序列。
2.一种能结合人IL-18的分离的抗体或者其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部 分包含Ig重链恒定区，其包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列； Ig轻链恒定区，其包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列； Ig重链可变区，其包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；和 Ig轻链可变区，其包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
3.一种能结合人IL-18的分离的抗体或者其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部 分包含Ig重链可变区，其包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列；和 Ig轻链可变区，其包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列。
4.一种分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原结合部分包含 根据权利要求1、2或3的结合蛋白，和其中所述抗体或其抗原结合部分能中和人IL-18。
5.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述IL-18选自人 IL-18原；成熟-人IL-18 ；和截短的-人IL-18。
6.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原 结合部分减小了人IL-18结合其受体的能力。
7.根据权利要求6的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原 结合部分减小了人IL-18原；成熟-人IL-18 ；或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
8.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原 结合部分能减小选自下面的人IL-18生物活性中的一种或多种Thl调节；Th2调节；NK调 节；嗜中性白细胞调节；单核细胞_巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；嗜酸性细胞调 节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。
9.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原 结合部分具有选自下面的解离常数(Kd) IO-7M ； 10、； IO-9M ； IO-10M ； IO-12M ；和IO-13M0
10.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分具有选自下面的生成速率=IO2M-1S ―1 ；IO3M-V ； IOW1 ； IO5M-1S-1 ；和lOVs-1。
11.根据权利要求4的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分白具有选自下面的离解速率10_3s 1 ；IO-4S-1 ；IO-5S-1 ；和IO-6S-10
12.—种标记抗体或其抗原结合部分，其包含根据权利要求1、2或3的抗体或其抗原结 合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与可检测标记物偶联。
13.根据权利要求12的标记抗体或其抗原结合部分，其中所述可检测标记物选自放射 性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。
14.根据权利要求13的标记抗体或其抗原结合部分，其中所述标记物是选自3H,14C,35S，9°Y，99TC，mIn，125I，mI，177LU，166H0，和 153Sm 的放射性标记物。
15.包含根据权利要求1、2或3的抗体或其抗原结合部分的偶联抗体或其抗原结合部 分，其中所述抗体或其抗原结合部分与治疗性或细胞毒性物质偶联。
16.根据权利要求15的偶联抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗性或细胞毒性物质 选自抗_代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗_血管生成药物；抗_有丝 分裂物质；蒽环霉素A ；毒素；和编程性细胞死亡剂。
17.编码权利要求1、2或3的抗体或其抗原结合部分氨基酸序列的分离的核酸。
18.包含权利要求17的分离的核酸的载体。
19.根据权利要求18的载体，其中所述载体选自pcDNA；pTT ； ρΤΤ3 ；pEFBOS ；pBV ； PJV ；和 pBJ0
20.包含权利要求18的载体的分离的宿主细胞。
21.根据权利要求20的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
22.根据权利要求21的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
23.根据权利要求20的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
24.根据权利要求23的分离的宿主细胞，其中所述真核细胞选自动物细胞，植物细胞 和真菌细胞。
25.根据权利要求24的分离的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞，鸟 类细胞，和昆虫细胞的动物细胞。
26.根据权利要求25的分离的宿主细胞，其中所述动物细胞是CHO细胞。
27.根据权利要求25的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS。
28.根据权利要求24的分离的宿主细胞，其中所述真核细胞是啤酒糖酵母。
29.根据权利要求25的分离的宿主细胞，其中所述动物细胞是昆虫Sf9细胞。
30.一种制备结合人IL-18的抗体或其抗原结合部分的方法，该方法包含在足以产生 结合人IL-18的抗体或其抗原结合部分的条件下在培养基中培养权利要求20的宿主细胞 的步骤。
31.一种药物组合物，其含有权利要求1、2或3的抗体或其抗原结合部分，和药学可接 受载体。
32.根据权利要求31的药物组合物，其进一步含有至少一种用于治疗其中IL-18活性 是有害的疾病的另外的治疗药物。
33.根据权利要求32的药物组合物，其中所述另外的药物选自血管生成抑制剂；激酶 抑制剂；共同-刺激分子阻断剂；粘着分子阻断剂；抗-细胞因子抗体或者其功能片段；甲 氨喋呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留类抗炎药物。
34.一种包含能结合人IL-18的抗原结合结构域的分离的抗体或其抗原结合部分， 其中所述的抗原结合结构域包含具有SEQ ID NO. 6的残基31-35的⑶R-Hl ；具有SEQ ID NO. 6 的残基 50-66 的 CDR-H2 ；具有 SEQ ID NO. 6 的残基 99-110 的 CDR-H3 ；具有 SEQ ID N0. 7 的残基 24-34 的 CDR-Ll ；具有 SEQ ID NO. :7 的残基 50-56 的 CDR-L2 ；和具有 SEQ ID N0. 7 的残基 89-98 的 CDR-L3。
35.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合结构域包括 一个I
36.根据权利要求35的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述Vh包括SEQID NO 6 的氨基酸序列。
37.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合结构域包括一个 VL。
38.根据权利要求37的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述\包括SEQID NO 7的氨基酸序列。
39.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合结构域包括 一个Vh和一个\。
40.根据权利要求39的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述\包括SEQID NO 7 的氨基酸序列，和所述Vh包括SEQ ID NO :6的氨基酸序列。
41.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其进一步包括选自人IgM恒定 区；人IgGl恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定；人IgG4恒定区；人IgE恒定区和人IgA 恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。
42.根据权利要求41的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述重链免疫球蛋白恒定 区是人IgGl恒定区。
43.根据权利要求42的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述人IgGl恒定区包括选 自SEQ IDN0. :2，禾口 SEQ IDN0. 3的氨基酸序列。
44.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其进一步包括选自人IgK恒定 区，和人IgX恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。
45.根据权利要求44的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链免疫球蛋白恒定 区是人IgK恒定区，其包括氨基酸序列SEQ ID NO. :4。
46.根据权利要求44的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述轻链免疫球蛋白恒定 区是包括氨基酸序列SEQ ID NO. 5的人IgX恒定区。
47.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体选自免疫球蛋白 分子，scFv;单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；Fab片段；Fab'片段；F(ab' )2 ； Fv ； 二硫键连接的Fv。
48.根据权利要求47的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述结合蛋白是人抗体。
49.一种分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗原结合部分包 含根据权利要求34-48中任一项的抗体或其抗原结合部分，并且能中和人IL-18。
50.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述IL-18选自人 IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18。
51.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分减小了人IL-18结合其受体的能力。
52.根据权利要求51的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分减小了人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
53.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分能减小选自下面的人IL-18生物活性中的一种或多种Thl调节；Th2调节；Nk 调节；嗜中性白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；嗜酸性细胞调 节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子调节；和细胞募集调节。
54.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其 抗原结合部分具有选自下面的解离常数(Kd) :10_7M ；10、JO-、；10_10M ；IiT11M ；IO-12M ；和 1(Γ13Μ。
55.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分具有选自下面的生成速率=IO2M-1S ―1 ；IO3M-V ； IOW1 ； IO5M-1S-1 ；和lOVs-1。
56.根据权利要求49的分离的中和抗体或其抗原结合部分，其中所述中和抗体或其抗 原结合部分白具有选自下面的离解速率10_3s 1 ；IO-4S-1 ；IO-5S-1 ；和IO-6S-10
57.一种标记抗体或其抗原结合部分，其包含根据权利要求34-48中任一项的抗体或 其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与可检测标记物偶联。
58.根据权利要求57的标记抗体或其抗原结合部分，其中所述可检测标记物选自放射 性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光标记物，磁性标记物和生物素。
59.根据权利要求58的标记抗体或其抗原结合部分，其中所述标记物是选自3H,14C, 35S，9°Y，99TC，mIn，125I，mI，177LU，166H0jn 153Sm 的放射性标记物。
60.包含根据权利要求34-48中任一项的抗体或其抗原结合部分的偶联抗体或其抗原 结合部分，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质偶联。
61.根据权利要求60的偶联抗体或其抗原结合部分，其中所述治疗性或细胞毒性物质 选自抗_代谢物；烷基化试剂；抗生素；生长因子；细胞因子；抗_血管生成药物；抗_有丝 分裂物质；蒽环霉素A ；毒素；和编程性细胞死亡剂。
62.一种药物组合物，其含有权利要求34-48中任一项的抗体或其抗原结合部分，和药 学可接受载体。
63.根据权利要求62的药物组合物，其进一步含有至少一种用于治疗其中IL-18活性 是有害的疾病的另外的治疗药物。
64.根据权利要求63的药物组合物，其进一步包含至少一种用于治疗疾病的另外的 治疗药物，其中所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节 炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限性回 肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿�。�甲状腺炎，哮喘，变态反应疾�。�牛皮癣， 皮炎硬皮�。�移植物抗宿主�。�器官移植排异，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾�。� 肉状瘤�。�动脉粥样硬化，传播性血管凝固，川崎�。�格雷夫斯�。�肾病综合征，慢性疲劳综 合征，韦格纳肉芽肿�。�亨诺赫_舍恩莱因紫癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素 层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染�。�由寄生虫引起的疾�。� 后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髓炎，亨廷顿舞蹈�。�帕金森�。�早老性痴呆，中风，原发 肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞，艾迪生�。�散发性， I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，施密特综合征，成人呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血清 反应阴性关节�。�关节�。�赖特�。�牛皮癣关节�。�溃疡性结肠关节�。�肠滑膜炎，衣菌，鼠疫 和沙门氏菌相关关节�。�脊椎关节�。�动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身 免疫大疱�。�寻常性天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮，线性IgA�。�自身免疫溶血性贫血， 库姆斯阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free�。� 慢性粘膜皮肤念珠菌�。�巨细胞关节炎，原发硬化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免 疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾�。�乙肝，丙肝，普通各式各样的免疫缺陷，膨胀心肌�。�女性不孕症，卵巢衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺�。�起因不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后间质肺�。�间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾�。�与肺病相关的混 合缔结组织疾病，与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性关节炎，与肺病 相关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的斯耶格伦�。�与肺病 相关的僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺�。�与肺病相关的含铁血黄素沉着�。�药物引起 的间质肺�。�辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸润性肺�。� 传染病后间质肺�。�痛风关节炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎，2-型自身免疫肝炎， 自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关 的急性免疫疾�。�与器官移植相关的慢性免疫疾病，骨关节炎，原发硬化胆管炎，1型牛皮 癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS，肾小球肾炎，肾 microscopic vasulitis,莱姆�。�盘形红斑狼疮，特发性男性不孕症或N0S，精液自身免疫 性，多发性硬化，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性肺高血压，古德帕斯彻综合征，结节性 多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，斯蒂尔�。�全身硬化，斯耶格伦综合征， Takayasu' s病/动脉炎，自身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺�。�甲 状腺机能亢进，甲状腺肿自身免疫甲状腺机能亢进，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢进，原发 性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。�慢性肝�。�酒 精性肝硬化，酒精引起的肝损伤，choleosatatis，特应性肝�。�药物引起的肝炎，非酒精性 脂肪性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌感染，精神病，Th2型和Thl型介导的疾�。� 急性和慢性疼痛，和癌症。
65.权利要求63的药物组合物，其中所述另外的药物选自血管生成抑制剂；激酶抑制 齐U ；共同-刺激分子阻断剂；粘着分子阻断剂；抗_细胞因子抗体或者其功能片段；甲氨喋 呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留类抗炎药物。
66.根据权利要求34的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部 分结合人IL-18，但是不能与125-2Η和IL-18BP竞争结合人IL-18。
67.包括根据权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分的结晶抗体或 其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以晶体存在。
68.根据权利要求67的结晶抗体或其抗原结合部分，其中所述晶体是没有载体的药学 控制释放晶体。
69.根据权利要求67的结晶抗体或其抗原结合部分，其中所述结晶抗体或其抗原结合 部分具有比所述结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。
70.根据权利要求67的结晶抗体或其抗原结合部分，其中所述结晶抗体或其抗原结合 部分保留其生物活性。
71.一种用于释放抗体或其抗原结合部分的组合物，所述组合物含有(a)一种制剂，其中所述制剂含有根据权利要求67-70中任一项的结晶抗体或其抗原 结合部分，和一种成分；和(b)至少一种聚合物载体。
72.根据权利要求71的组合物，其中所述聚合物载体是选自下面的一种或多种的聚合 物聚丙烯酸，聚氰基丙烯酸酯，聚氨基酸，聚酸酐，聚缩肽，聚酯，聚乳酸，聚乳酸-共-羟基 乙酸或PLGA，聚b-羟基丁酸，聚γ-己内酯，聚二氧六环酮；聚乙二醇，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚有机磷腈，聚原酯，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物， 多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖， glycaminoglycans，硫酸多糖，它们的混合物和它们的共聚物。
73.根据权利要求71的组合物，其中所述成分选自白蛋白，蔗糖，海藻糖，乳糖醇，明 胶，羟丙基_环糊精，甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
74.权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于减小人 IL-18活性的药物中的用途。
75.权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于对患有其中 IL-18活性是有害的疾病的人患者减小人IL-18活性的药物中的用途。
76.权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分在制备用于对患有其中 IL-18活性是有害的疾病或病症的受治疗者进行治疗的药物中的用途。
77.根据权利要求76的用途，其中所述疾病选自类风湿性关节炎，骨关节炎，幼年型 慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节�。�全 身红斑狼疮，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状腺炎，哮喘，变 态反应疾病，牛皮癣，皮炎硬皮�。�移植物抗宿主病，器官移植排异，急性或慢性的与器官移 植相关的免疫疾病，肉状瘤�。�动脉粥样硬化，传播性血管凝固，川崎�。�格雷夫斯病，肾病 综合征，慢性疲劳综合征，韦格纳肉芽肿�。�亨诺赫-舍恩莱因紫癜，肾微结节性脉管炎，慢 性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染病，由 寄生虫引起的疾�。�后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髓炎，亨廷顿舞蹈�。�帕金森�。�早老 性痴呆，中风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞， 艾迪生�。�散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏，施密特综合征，成人呼吸抑制综合征，脱 发，脱发斑，血清反应阴性关节�。�关节病，赖特�。�牛皮癣关节�。�溃疡性结肠关节病，肠滑 膜炎，衣菌，鼠疫和沙门氏菌相关关节�。�脊椎关节�。�动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性 变态反应，自身免疫大疱�。�寻常性天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮，线性IgA�。�自身免 疫溶血性贫血，库姆斯阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/ Royal Free病，慢性粘膜皮肤念珠菌�。�巨细胞关节炎，原发硬化肝炎，起因不明自身免疫 肝炎，后天性免疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾病，乙肝，丙肝，普通各式各样的免 疫缺陷，膨胀心肌病，女性不孕症，卵巢衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺�。�起因不明的纤 维组织形成牙槽炎，炎后间质肺�。�间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾�。�与 肺病相关的混合缔结组织疾�。�与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性 关节炎，与肺病相关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的斯耶 格伦�。�与肺病相关的僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺�。�与肺病相关的含铁血黄素沉着 病，药物引起的间质肺�。�辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸 润性肺�。�传染病后间质肺�。�痛风关节炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝炎，2-型自身 免疫肝炎，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官 移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免疫疾�。�骨关节炎，原发硬化胆管炎， 1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病N0S，肾小球肾 炎，肾microscopic vasulitis,莱姆病，盘形红斑狼疮，特发性男性不孕症或N0S，精液自 身免疫性，多发性硬化，交感神经眼炎，缔结组织疾病继发性肺高血压，古德帕斯彻综合征，结节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，斯蒂尔�。�全身硬化，斯耶格伦综 合征，Takayasu' s病/动脉炎，自身免疫血小板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状 腺�。�甲状腺机能亢进，甲状腺肿自身免疫甲状腺机能亢进，萎缩性自身免疫甲状腺机能亢 进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管炎，白癜风，急性肝�。�慢性 肝�。�酒精性肝硬化，酒精引起的肝损伤，choleosatatis，特应性肝�。�药物引起的肝炎，非 酒精性脂肪性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌感染，精神�。琓h2型和Thl型介导 的疾�。�急性和慢性疼痛，和癌症。
78.根据权利要求77的用途，其中所述成人呼吸抑制综合征是成人急性呼吸抑制综合征。
79.根据权利要求77的用途，其中所述普通各式各样的免疫缺陷是普通各式各样的血 丙种球蛋白减少。
80.根据权利要求77的用途，其中所述1-型自身免疫肝炎是典型自身免疫或狼疮样肝炎。
81.根据权利要求77的用途，其中所述2-型自身免疫肝炎是抗-LKM抗体肝炎。
82.根据权利要求77的用途，其中所述甲状腺肿自身免疫甲状腺机能亢进是桥本病。
83.根据权利要求77的用途，其中所述精神病选自抑郁症或精神分裂症。
84.权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分和第二种药物在制备用 于对患有其中IL-18是有害的疾病的患者进行治疗的药物中的用途，其中包括在施用第二 种药物之前，同时，或之后对患者施用权利要求1-11和34-56中任一项的抗体或其抗原结 合部分的步骤，其中所述第二种药物选自能结合人IL-12的抗体，或其片段；甲氨喋呤；能 结合人TNF的抗体，或其片段；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；Π(506 ；和非留类抗炎药 物。
85.一种用于在体外减小人IL-18的方法，该方法包含将人IL-18与权利要求1_11和 34-56中任一项的抗体或其抗原结合部分接触的步骤，以便减小人IL-18活性。
全文摘要
本发明涉及IL-18结合蛋白，特别是结合人白介素-18(hIL-18)的抗体。具体地说，本发明涉及全人抗体的抗体。优选地，抗体具有体外和体内对于hIL-18的高亲和性和/或中和hIL-18的性质。本发明的抗体可以是全长抗体或者其抗原结合部分。还提供了本发明抗体的制备方法和使用方法。本发明的抗体或抗体部分用于对例如患有其中hIL-18活性是有害的疾病的人受治疗者检测hIL-18和用于抑制hIL-18活性。
文档编号G01N33/68GK101948539SQ20101027398
公开日2011年1月19日 申请日期2004年11月12日 优先权日2003年11月12日
发明者B·拉布科夫斯基, B·赫德伯格, J·S·康, J·W·沃斯, J·巴布库克, J·韦勒, L·格林, T·加于尔, X·-C·贾 申请人:雅培制药有限公司