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专利名称：测定尿液肌醇的试剂盒的制作方法
测定尿液肌醇的试剂盒本发明涉及ー种医药试剂，具体涉及ー种测定尿液肌醇的试剂盒。 [背景技术]人体内的肌醇主要存在于细胞内(为血液中的数十倍)，以游离状态或磷脂酰肌醇构成成分的形式广泛分布于人体内。磷脂酰肌醇通过受体活化等途径而分解，生成肌醇-3-磷酸,在细胞内发挥“second messenger”的作用。另外,在糖尿病状态(高血糖)下，尤其是神经系统的细胞内肌醇含量減少(山梨醇增加)，最終会导致Na、K-ATPase活性下降，引起神经传导阻滞。通过测定糖负荷后的尿中肌醇含量，可在无创伤的状态下检测出糖耐量的异常。1858年已有报告显示，糖尿病患者的尿中存在高浓度的肌醇排泄(糖尿病患者高出正常人10倍)，提示可作为糖耐量降低的指标之一。并且，河津等人的报告显示，在75g葡萄糖负荷试验前后，尿中肌醇排泄的増加量(AUMI)与糖负荷后的血糖值存在良好的相关性，是可以反映空腹时无法明确糖负荷后高血糖状态的良好指标之一。此外，肌醇与糖尿病性神经损伤及糖尿病性肾病的相关性也越来越受到关注。目前，肌醇的检测方法多采用高效液相法(HPLC)、气相色谱法(GC)、或质谱法(MS)等方法，除需要昂贵的仪器外，操作繁杂，测试速度慢，且需要有专门人员进行作业。本发明为了克服现有技术的不足，提供了ー种操作简单、快速、灵敏、准确定量的測定尿液肌醇的试剂盒。为了实现上述目的，本发明设计了ー种测定尿液肌醇的试剂盒，包括试剂Rl和试剂R2，其中试剂Rl，包括缓冲液；Thio-NAD+L Og/L,;稳定剂 I. Og/L ;防腐剤 0. 5g/L ；试剂R2，包括缓冲液；NADH 5_6g/L ;肌醇脱氢酶50-100KU/L ;稳定剂0. 1-0. 2g/L;防腐剤0. 5g/L。所述试剂Rl和试剂R2的PH值分别为5-12。所述试剂Rl中，缓冲液为Tris缓冲液0. lmol/L或MES缓冲液20g/L。所述试剂Rl中，稳定剂为牛血清白蛋白、甘露醇或氨基酸中的ー种。所述试剂Rl中，防腐剂为置氣化纳、硫柳萊或庆大霉素中的一种。所述试剂R2中还包括螯合剂0. 8g/L。所述试剂R2中，缓冲液为Tris缓冲液0. lmol/L或GOOD缓冲剂10g/L。所述试剂R2中，稳定剂为牛血清白蛋白、甘露醇或氨基酸中的ー种。所述试剂R2中，防腐剂为置氣化纳、硫柳萊或庆大霉素中的一种。所述的螯合剂为こニ胺四こ酸。本发明同现有技术相比，配制简单、便捷，无需特殊仪器，在临床实验室常见的全自动或半自动生化仪上即可完成操作，整个过程仅需10分钟，大幅度节省了人力与物力，同时使临床上对大量样本进行測定成为可能。将本发明用于测定尿中肌醇的酶循环反应试齐U，具有较高的稳定性，可广泛应用于临床诊断，并减少试剂的浪费。图I为本发明试剂盒中肌醇溶液与肌醇测定试剂在混合后吸光度的曲线趋势图。图2为本发明试剂盒测定糖化血清蛋白y = 0. 989x+0. 726，R2 = 0. 992时的线性 范围。图3为本发明试剂盒测定糖化血清蛋白y = I. 038x-l. 634，R2 = 0. 991时的线性范围。下面结合附图
对本发明作进ー步描述。实施例I :采用完成配制后的试剂进行检测，达到了准确度、精密度和线性的设定要求，考虑到试剂储存的稳定性和其中的肌醇脱氢酶、NADH在溶液状态下不稳定，将该产品制成双试剂产品，试剂(Rl)与试剂(R2)的溶液状态体积比例为3 :1，具体成分分配和配制方法如下试剂Rl
Tris 缓冲液0. lmol/L
Thio-NAD+I. Og/L
牛血清白蛋白(稳定剂)0. lg/L
NaN3 (防腐剂)0. 5g/L试剂R2 (冻干粉状态时)试剂R2a (溶液)GOOD 缓冲剂10g/L牛血清白蛋白I. 0g/LNaN30. 2g/L试剂R2b (冻干粉)NADH5g/L肌醇脱氢酶50KU/L试剂R2 (溶液状态时)GOOD缓冲剂lOg/L
牛血清白蛋白I. Og/L
NaN30. 2g/L
NADH5g/L
肌醇脱氢酶50KU/L将试剂(Rl)与试剂(R2)的成分进行分配后，先按照液体双试剂的方式进行配制，即可获得产品，如试剂(R2)为冻干粉，则使用前需将试剂(R2a)加入试剂(R2b)中，形成各组成成分为设定浓度的试剂(R2)溶液。试剂(R2)的冻干制备方法如下先将溶液从25°C冷却到_40°C，该冷却維持4个小时，确保瓶内的溶液温度均匀， 然后在一定的真空度下(20pa的压强下)进行缓慢升温到25°C，该过程需要3-4个小时，然后在25°C的温度和20pa压强的真空度下，进行干燥。以上过程完全由真空冻干机来进行控制，需要约37个小吋，待冻干粉的温度与冻干机干燥室的温度一致吋，表示冻干粉已达到充分干燥的状态，干燥过程结束，最后在玻璃瓶内充入氮气，盖上瓶塞，完成整个试剂R2的冻干。实验ー设备日立7170型自动生化分析仪根据尿肌醇测定试剂的反应原理，考虑试剂灵敏度与吸样比例之间的影响关系和目前全自动生化分析仪池容量和限制，采用样本试剂(Rl)试剂(R2)=12u L 180 u L 60 ii L的比例进行试验。首先采用紫外可见分光光度计在405nm波长下和37°C孵育下，将一定浓度的肌醇与配制的单试剂按照反应比例混合后，进行吸光度变化扫描，可观察到肌醇溶液与肌醇测定试剂在混合后存在明显的吸光度上升趋势，其斜率在一定时间内保持固定，结果如图I所示。考虑到双试剂混合后的酸碱度与温度的缓冲时间，因此在日立自动生化分析仪上选取了第6分钟到第10分钟的吸光度变化来检测肌醇的含量。以下是确定的反应体系參数样本种类人尿液；用量12ii L ;试剂用量试剂(Rl)180 U L，试剂(R2) 60 U L ；反应条件尿液12y L，与试剂(Rl)混合均匀后，在37°C下孵育5分钟，然后加入试剂(R2)后混合均匀并孵育I分钟，接下来采用405nm的波长进行測定，连续測定4分钟，每隔I分钟测定I次，求出吸光度变化速度(AA/min)。校准方法采用肌醇配制成100 U mo I/L的溶液作为校准品。采用上述试剂测定新鲜的病人尿肌醇的含量时，在日立7170自动生化分析仪上进行检測，以HPLC法作为对照，结果如图2所示。图2中，曲线代表測定结果的回归曲线，纵坐标为本发明的測定结果，横坐标为HPLC法的測定结果，计量单位为iimol/L。
统计y = 0. 989x+0. 726 ；测定例数40例；相关系数R = O. 9959，R2 = 0. 992 ；具体参数见下表
权利要求
1.一种测定尿液肌醇的试剂盒，包括试剂Rl和试剂R2，其中 试剂Rl，包括缓冲液；Thio-NAD+L Og/L,;稳定剂I. Og/L ;防腐剤0. 5g/L ； 试剂R2，包括缓冲液；NADH 5-6g/L ;肌醇脱氢酶50-100KU/L ;稳定剂0. 1-0. 2g/L ;防腐剂 0. 5g/L。
2.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂Rl和试剂R2的PH值分另为5-12。
3.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂Rl中，缓冲液为Tris缓冲液0. lmol/L或MES缓冲液20g/L。
4.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂Rl中，稳定剂为牛血清白蛋白、甘露醇或氨基酸中的ー种。
5.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂Rl中，防腐剂为置氣化纳、硫柳萊或庆大霉素中的一种。
6.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂R2中还包括螯合剂0. 8g/L。
7.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂R2中，缓冲液为Tris缓冲液0. lmol/L或GOOD缓冲剂10g/L。
8.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂R2中，稳定剂为牛血清白蛋白、甘露醇或氨基酸中的ー种。
9.根据权利要求I所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述试剂R2中，防腐剂为置氣化纳、硫柳萊或庆大霉素中的一种。
10.根据权利要求6所述的測定尿液肌醇的试剂盒，其特征在于所述的螯合剂为こニ胺四こ酸。
全文摘要
本发明涉及一种医药试剂，具体涉及一种测定尿液肌醇的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1，包括缓冲液；Thio-NAD+1.0g/L，；稳定剂1.0g/L；防腐剂0.5g/L。试剂R2，包括缓冲液；NADH 5-6g/L；肌醇脱氢酶50-100KU/L；稳定剂0.1-0.2g/L；防腐剂0.5g/L。本发明同现有技术相比，配制简单、便捷，无需特殊仪器，在临床实验室常见的全自动或半自动生化仪上即可完成操作，整个过程仅需10分钟，大幅度节省了人力与物力，同时使临床上对大量样本进行测定成为可能。
文档编号G01N21/31GK102645414SQ201210099629
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者朱雪青, 李子樵 申请人:上海蓝怡科技有限公司