专利名称：基本上保留免疫原性的被杀死细胞的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明公开了基本上保留免疫原性的被杀死细胞的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
来自单一抗原或生物标志物的疫苗制剂具有有限的免疫原性来提供想要的/需要的免疫力。为了实现广谱保护，需要抗原组合/集合。通过使用完整细胞有可能得到此类组合，因为完整细胞由不同免疫原性标志物和抗原构成。如果活的用作疫苗的话，癌细胞会引起癌性生长且会引起疾病。被杀死细胞的使用受到限制，原因在于它们有限的稳定性。存在持久的需要，稳定死细胞同时保留它们的免疫学和结构特性。虽然几项保存活细胞的努力有很好的记录，但是就我们所知，没有报告是关于保存死细胞时出于免疫接种目的保留它们的免疫学特性。完整细胞在用作疫苗时产生与细胞裂解物相比更好的免疫应答，这归于细胞表面上表征的或未表征的免疫原性表位的集合。Hardev S. Pandha、Dorthe Cook、Rebecca Greenhalgh 和 Angus Dalgleish 描述了被杀死细胞(2005 BJU INTERNATIONAL, 95, 1336-1343)用于鼠前列腺癌的免疫疗法的用途。经照射肿瘤细胞的免疫原性在它们使用自杀基因疗法被离体杀死时得到增强。佐剂指可刺激免疫系统且提高对疫苗的响应，自身没有任何特定抗原效应的药剂(NCI，定义)。词语“佐剂”源自拉丁词adiuvare，表示帮助或辅助。“免疫学佐剂定义为在与特定疫苗抗原组合使用时起加速、延长、或增强抗原特异性免疫应答作用的任何物质”(DNAVaccines: Methods and Protocols, D. B. Lowrie and R. G. Whalen, Humana Press,2000)o有许多广泛使用的已知佐剂，包括油、铝盐、和病毒颗粒、活的或死的完整生物体、和微生物的提取物。还推荐在癌症疫苗中使用这些佐剂以提升抗原的免疫刺激。美国专利5059518公开了保存活的杂交瘤细胞系、组织细胞和对照细胞供免疫测定法和血液学测量用的方法。该方法包括分离外周血淋巴细胞，在磷酸盐缓冲的清蛋白中重悬浮细胞团粒并用胞内低温防护剂海藻糖的等张溶液处理细胞，接着冻干。在等张海藻糖溶液中重悬浮冻干物。使用荧光抗体标记的细胞分选仪(FACS)表征对照和冻干细胞群中的抗原决定簇。美国专利5045446公开了保存活的RBC，同时保留它们的代谢活性。该专利公开了以(12. 2-21. 7%)的浓度使用胞内低温防护剂诸如半乳糖/甘露糖/木糖/果糖/葡萄糖以及胞外PVP (分子量10K-24K)。将样品于37°C使用磷酸盐缓冲盐水中的25. 5%蔗糖溶液再水合。掺入聚合物及碳水化合物半乳糖、甘露糖、木糖、果糖、葡萄糖后，完整细胞回收为52.9+7.9%。冻干溶液中的海藻糖和蔗糖显示出边缘细胞回收。在重建培养基中以3. 6%的浓度使用碳水化合物(优先次序为蔗糖、海藻糖、甘露糖、葡萄糖)。美国专利5648206公开了保存活的RBC，保留代谢活性。该专利公开了以(12. 2-21. 7%)的浓度使用胞内低温防护剂诸如半乳糖/甘露糖/木糖/果糖/葡萄糖及胞、外低温防护剂分子量10K-24K的PVP。冻干培养基含有浓度为7%-37. 5%的单糖(木糖、葡萄糖、甘露糖、核糖、果糖)。以约0. 7%的浓度使用分子量为约IK至360K的胞外低温防护剂(PVP/右旋糖苷)。没有公开海藻糖与PVP组合的数据，尽管该专利宣称当海藻糖和PVP在冻干溶液中一起使用时，它们显示出边缘细胞回收。美国专利5425951公开了保存活的RBC，保留它们的代谢活性。该专利公开了重建冻干细胞的方法，包括用含有浓度为至少1%的碳水化合物(葡萄糖/甘露糖；海藻糖/蔗糖)和分子量为IK至约360K (PVP)、以重量计的浓度为约20%的聚合物的水溶液处理细胞的步骤。美国专利申请No. 2005/008448IAl公开了保存哺乳动物和脊椎动物细胞，例如表达P2X7受体的造血干细胞和巨噬细胞。欧洲专利EP0444159B1公开了保存哺乳动物细胞、杂交瘤细胞系、组织细胞供免疫测定法和其它血液学测量用。使用含有10%海藻糖的等张液来保存哺乳动物细胞的表面上的蛋白质性质的标志物。步骤包括在磷酸盐缓冲的清蛋白中重悬浮哺乳动物细胞并将离 心后获得的所得团粒在10%海藻糖的等张溶液中于环境温度温育大约30分钟。这之后是于约-70° C缓慢冷却大约I小时。在缓慢冷冻工艺期间，首先胞外水会冻结，而且盐会析出，这会破坏死细胞的细胞膜。在活细胞的情况中(例如在细胞培养期间)，推荐缓慢冷冻(Biochimica et BiophysicaActa (BBA) - Biomembranes. Volume 1768, Issue 3, March 2007, Pages 728-736)。PCT公开W097/04801 (PCT/US96/12251)公开了使用蔗糖和海藻糖作为低温防护齐U。该发明涵盖抗J1ER2抗体。开发了基于组氨酸/琥珀酸盐缓冲液的冻干前配制剂来维持配制剂的pH。在冻干前配制剂中添加聚山梨酯以降低重建蛋白质的聚集和颗粒的形成。该专利还公开了在重建稀释剂中使用芳香醇诸如苄醇或酚醇。发现了基于海藻糖的低温防护缓冲液帮助在40°C稳定蛋白质2周，而且提高海藻糖浓度则提高稳定性为30°C I年。添加海藻糖和蔗糖还防止在上文所述贮藏条件聚集。美国专利5，759，774公开了使用干燥的或冻干的细胞检测循环抗体类型的方法。该专利公开了保存哺乳动物细胞，特别是RBC、淋巴细胞、血小板脂质体和血体(hemosome)。发明人使用碳水化合物聚合物溶液作为冻干防护剂，其中碳水化合物可以是木糖、甘露糖、葡萄糖、核糖、甘露糖或果糖，而且聚合物可以是PVP、!ES或右旋糖苷。单糖戊糖和己糖的浓度范围为7-37. 5%。他们还通过添加谷胱甘肽肌苷、腺嘌呤盐酸谷氨酰胺、MgCl2. 6H20、右旋糖、PVP和HES修改了冻干缓冲液组成，并通过添加ATP、KH2P04、Na2HP04和PVP修改了重建缓冲液组分。欧洲专利EP90906036公开了冻干哺乳动物外周血细胞、培养细胞、杂交瘤细胞系或组织细胞的方法。步骤包括在离心后在等张海藻糖溶液中温育细胞团粒，接着对细胞悬浮液于-70° C进行冷冻，之后冻干。在蒸馏水中重建冻干细胞。PCT公开W092/14359 (PCT/US92/00782)记载了冻干哺乳动物精子细胞的方法。该专利公开了使用浓度为约0. 1-2. 6M的单糖(优选葡萄糖)和分子量范围优选为IK至350k的聚合物(或聚合物混合物)。优选的聚合物是PVP，接着是右旋糖苷、HES和泊洛沙姆。使用pH在约7. 0至7. 4范围中的PBS作为冻干缓冲液。建议的重建培养基包含聚合物(MW15K)和含有葡萄糖和腺嘌呤的PBS。掺入典型的细胞代谢物诸如ATP和NAD以及单糖诸如葡萄糖之外的木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖和果糖(浓度为1M)。美国专利申请20080057040公开了低温保存干细胞。美国专利5071741公开了在细胞材料(牛主动脉内皮衍生细胞系-BFA-克隆I和来自鼠胰腺的胰岛)的低温保存中使用琼脂糖和藻酸盐(作为不渗透的)及甘油和DMSO (浓度为1M)(作为渗透的)。美国专利4004975公开了自全血分离人白细胞和在-80° C低温保存的方法。该专利建议组合胞内低温防护剂(5%DMS0)和胞外低温防护剂(4%HES)。PCT公开W092/14360 (PCTUS92/00650)记载了冻干和重建有核非哺乳动物细胞和血液材料混合物的方法。发明该方法的目的是开发针对边缘无形原虫(AnaplasmaMarginale)(弓形体属(Toxoplasma))的疫苗。该工艺流水线连续供应受到无形原虫(Analplasma spp)(中央)感染的血液样品，因为样品冻干物能贮藏较长的时间段。冻干混合物包含单糖(己糖和戊糖)及至少两种生物相容两性聚合物。单糖选自木糖、葡萄糖、核糖、甘露糖和果糖。重建缓冲液含有终浓度为0. 7%的聚合物。 活细胞膜张力得到维持，而且我们需要一些膜孔打开剂/ATP来打开孔以使胞内低温防护剂内化以替换水合水从而实现保存或低温保存(US2005/0084481A1)。在活细胞保存期间，还想要提供一些碳/ATP源(例如腺嘌呤)以保持它们的代谢活性(Advances in Biopreservation by John G. Baust)。相反地，还想要维持足够的含湿量以最低限度保持它们的代谢活性，使得它们能在稍后复苏(美国专利申请20100297231)。在活细胞保存的情况中，有可能因为针对添加低温防护剂所致微环境改变的响应而发生表面蛋白变异性。然而，死细胞可能最低限度地响应(或根本不响应)微环境条件改变，原因在于蛋白质合成机制缺陷/受损(Annual Review of Biophysics andBioengineering. Vol. 3: 341-363)。想要保持被杀死细胞的完整性和免疫原性。保持被杀死细胞的形态和完整性可用于各种目的，包括开发与免疫机制有关的疗法(Infect Immun. 1978 July; 21(1):348)和诊断(Diagnostic Microbiology and Infectious Disease Volume 62, Issue 2,October 2008, Pages 133-141)。对死细胞记录了渗透压对细胞膜的直接影响，观察到内吞囊泡形成；膜流动性改变和膜相变温度升高。这种膜相变被认为启动脂质相分离和膜融合，可直接影响脱水死细胞的存活力。还由于相变期间不同相的共存，膜通透性升高且细胞在再水合期间可变成泄漏的细胞内容物，会导致完整细胞数减少。已知用于保存活细胞的方法不能扩展至保存被杀死细胞，因为 I.死细胞放松膜张力/塑性且因此可在冷冻干燥期间塌陷。2.死细胞形成聚集体，这可部分归于受损死细胞的胞外DNA的存在。3.死细胞的内部细胞器的膜完整性受损且因此维持内部细胞构造真的有挑战性。(Morphological Features of Cell Death. News in Physiological Sciences, (2004)Vol. 19，No. 3, 124-128。)
4.死细胞具有不同的内吞囊泡形成；膜流动性改变和膜相变温度。5.死细胞最低限度地响应(或根本不响应)微环境条件改变，原因在于蛋白质合成机制缺陷/受损。本文中定义的细胞的形态涉及细胞的大小、形状和结构。
本发明涉及保存被杀死细胞的方法。该方法包括冻干，接着重建，其中细胞的形态、完整性和免疫原性甚至在延长的贮藏后得到保留。而且，公开了包含保留免疫原性的被杀死细胞的药物组合物。此类组合物可用作疫苗。该组合物任选含有一种或多种佐剂以增强被杀死细胞的免疫原性。
发明内容
令人 惊讶地发现能制备基本上保留免疫原性特性的被杀死细胞的稳定组合物，其包含被杀死细胞、至少一种胞内低温防护剂、至少一种胞外低温防护剂和赋形剂。胞内低温防护剂选自碳水化合物诸如单糖和二糖。令人惊讶地发现作为胞内低温防护剂使完整细胞回收最大化的海藻糖产生最高细胞回收。作为胞内低温防护剂使用的碳水化合物的浓度介于I至10%W/V之间。胞外低温防护剂选自两性物质诸如羟乙基淀粉(HES)、右旋糖苷和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚山梨酯。令人惊讶地发现两性聚合物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为胞外低温防护剂提高完整细胞回收。作为胞外低温防护剂使用的PVP的浓度介于0. I至5%W/V之间。使用的PVP的分子量在30至50千道尔顿的范围中。令人惊讶地发现两亲聚合物羟乙基淀粉(HES)作为胞外低温防护剂提高完整细胞回收。作为胞外低温防护剂使用的!ES的浓度介于0. I至5%W/V之间。使用的HES的分子量在30至50千道尔顿的范围中。令人惊讶地发现两亲聚合物右旋糖苷作为胞外低温防护剂提高完整细胞回收。作为胞外低温防护剂使用的右旋糖苷的浓度介于0. I至5%W/V之间。使用的右旋糖苷的分子量在30至50千道尔顿的范围中。令人惊讶地发现两亲聚合物聚山梨酯作为胞外低温防护剂提高完整细胞回收。作为胞外低温防护剂使用的聚山梨酯的浓度介于0. I至5%W/V之间。作为胞外低温防护剂使用的两亲聚合物聚山梨酯选自聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65、聚山梨酯80，优选聚山梨酯80。依照本发明，制备基本上保留免疫原性特性的被杀死细胞的稳定组合物的工艺在于下述步骤
I.用胞内低温防护剂处理被杀死细胞。2.用胞外低温防护剂被杀死细胞。3.在冻干前快速冷却成冷冻配制剂。4.冻干经处理的被杀死细胞。5.重建(被杀死细胞的)冻干物。6.评估细胞完整性的保持。7.评估保存方法的有效性。8.评价抗原性/免疫原性特性的保持。冻干溶液通过成分为磷酸钾(0. 20g/L)、氯化钾(0. 20g/L)、氯化钠(8. 00g/L)和无水磷酸氢二钠(I. 15g/L)的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS -无氯化钙和氯化镁)缓冲于pH7. 4。冻干缓冲液含有终浓度约5%w/v的非还原二糖，优选海藻糖和终浓度约l%w/v的聚合物，优选聚乙烯吡咯烷酮(分子量44K)。如下分析被杀死细胞组合物甚至在延长的贮藏后的形态保持、完整性和免疫原性保持
I.形态序型分析(大小)-流式细胞术。PKH26用于细胞膜的完整性。苏木精和曙红染色用于细胞膜和核膜完整性。2.生理化学序型分析_确认细胞死亡使用T0PR03碘化物染料。3.粒度测定法_ FACS FSC/SSC。4.细胞发生分析。5. DNA序型分析FACS DNA含量分析。6. DNA提取和琼脂糖凝胶电泳以评估DNA完整性。7.免疫表型测定_ HLADR分子。8.免疫学序型分析_⑶4+，对具有细胞毒性决定子(穿孔蛋白和粒酶)的⑶8+和NK细胞的细胞毒性评价。9.功能测定法_使用PKH26和T0PR03碘化物的FACS效应器功能测定法以鉴定/确认及计数死的靶细胞。生成IFN Y和IL-2的脾细胞的量化。使用PKH26的淋巴细胞增殖测定法。
图I :冻干细胞的细胞大小和粒度的测定。正向散射测量细胞大�。嘞蛏⑸洳�
量粒度的量。图2A和B :使用细胞膜亲液染剂PKH26染料对细胞完整性的测定。图3 :未用PKH26染料染色以测定背景荧光的冻干细胞。图4 :具有完整细胞膜和核被膜的细胞。图5 :冻干及然后重建的细胞的免疫原性。图6 :突光显微镜下的表面标志物染色。
具体实施例方式实施例I :胞外低温防护剂
用分枝杆菌w (Mw)处理107个细胞/ml的癌细胞。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组团粒在含有1% PVP w/v的冻干缓冲溶液中重悬浮。将每份小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)，接着冻干。冻干物重建后评估的处理组百分比完整细胞回收为19. 125 土3. 275。实施例2 :胞内低温防护剂
取出107个细胞/ml的癌细胞并用Mw处理。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组团粒在含有5%海藻糖w/v的冻干缓冲溶液中重悬浮。将每份小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)，接着冻干。冻干物在DPBS中重建后使用血球计评估的处理组百分比完整细胞回收为15. 27土 0.64。实施例3 :为了低温防护剂活性的表面活性剂聚合物
取出107个细胞/ml的癌细胞并用Mw处理。使用锥虫蓝染料排斥测定法来测定百分比细胞存活力。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组团粒在含有0. 05%聚山梨酯80 v/v的冻干缓冲溶液中重悬浮。将每份小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)，接着冻干。冻干物在DPBS中重建后使用血球计评估的处理组百分比完整细胞回收为约0. 9。实施例4 :胞外低温防护剂处理，接着胞内低温防护剂处理
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死 亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度1% w/v的PVP (在DPBS中)中重悬浮。将细胞悬浮液于37° C温育15 min。随后，以终浓度5% w/v (在DPBS中)添加海藻糖，接着于37° C温育15 min。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。在冻干前，将每份小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)。冻干物在DPBS中重建后处理组百分比完整细胞回收为28. 08 土3. 63。实施例5 :胞内低温防护剂处理，接着胞外低温防护剂处理
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。使用锥虫蓝染料排斥测定法来测定百分比细胞存活力。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% w/v的海藻糖(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加PVP，并将细胞悬浮液于37° C温育15 min。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。在冻干前，将所有小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)。处理组百分比完整细胞回收为55. 61 土 4.35。实施例6 :胞内低温防护剂，接着胞外低温防护剂
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% w/v的右旋糖(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加HES，并将细胞悬浮液于37° C温育15 min。将总体积分配入每个Iml的小样并对每份小样中的细胞计数。在冻干前，将所有小样在液氮中进行快速冷却(-100C以下)。冻干后，处理组百分比完整细胞回收为约54. 88，但是细胞形态发生扰乱。实施例7 :胞内低温防护剂，接着胞外低温防护剂
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。使用锥虫蓝染料排斥测定法来测定百分比细胞存活力。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% v/v的甘油(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加HES，并将细胞悬浮液于37° C温育15 min。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数，之后冻干。将所有小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)。冻干后，处理组百分比完整细胞回收为约46. 19，虽然细胞形态发生扰乱。实施例8 :胞内低温防护剂，接着胞外低温防护剂
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% w/v的蔗糖(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加HES，并将细胞悬浮液于37° C温育15 min。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数，之后冻干。将所有小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)。冻干后，处理组百分比完整细胞回收为约47. 25，但是细胞形态发生扰乱。实施例9 :胞外低温防护剂，接着胞内低温防护剂及添加剂 用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。使用锥虫蓝染料排斥测定法来测定百分比细胞存活力。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度1% v/v的PVP (在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度5% w/v添加海藻糖，接着以终浓度1%添加添加剂(烟酸0. 75mM ;谷氨酰胺0. 75mM ；MgC12 0. 49mM和组氨酸5mM)。将细胞悬浮液于37° C温育15 min。对每份小样中的细胞计数，之后冻干。将所有小样在液氮中进行快速冷却(-100 C以下)。冻干后，处理组百分比完整细胞回收为约11. O。实施例10 :胞内低温防护剂，接着胞外低温防护剂及添加剂
用Mw处理107个细胞/ml的癌细胞。采用锥虫蓝染料排斥原理来测定百分比细胞死亡。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液并将对照组细胞团粒在DPBS中重悬浮。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% w/v的海藻糖(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加PVP，接着以终浓度1%添加添加剂(烟酸0. 75mM ;谷氨酰胺0. 75mM ；MgCl2 0. 49mM和组氨酸5mM)。将细胞悬浮液于37° C温育15 min。对每份小样中的细胞计数，之后冻干。将所有小样在液氮中进行快速冷却。冻干后，处理组百分比完整细胞回收为约48.9。实施例11 :冷冻方法
用Mw处理1x107个细胞/ml。采用锥虫蓝染料排斥原理，百分比细胞死亡为60%。制备5份小样,并通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。在得到的5份细胞团粒中,将每一份在100 u I 50X海藻糖中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。将终体积用DPBS调成lml。将来自每份小样的200 ii I分配入适当标注的玻璃管形瓶，并对每份小样中的细胞计数。将所有小样进行缓慢冷冻，就是8 C I hr,4 C 2 hr,-20 C 4 hr和最终-70 C 8 hr。除一份冷冻对照外，将剩余所有小样进行冻干大约48 hr o冻干物用200 ill DPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生13%完整细胞，而冻干导致2%回收。实施例12 :冷冻方法
用Mw处理1x107个细胞/ml。采用锥虫蓝染料排斥原理，百分比细胞死亡为60%。制备5份小样,并通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。在得到的5份细胞团粒中,将每一份在100 ill IOX PVP中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。将终体积用DPBS调成lml。将来自每份小样的200 ii I分配入适当标注的玻璃管形瓶，并对每份小样中的细胞计数。将所有小样进行缓慢冷冻，就是8 C I hr,4 C 2 hr,-20 C 4 hr和最终-70 C 8 hr。除一份冷冻对照外，将剩余所有小样进行冻干大约48 hr o冻干物用200 ill DPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生32%完整细胞，而冻干导致5%回收。实施例13 :冷冻方法
用Mw处理1x107个细胞/ml。采用锥虫蓝染料排斥原理，百分比细胞死亡为60%。制备5份小样，并通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。在得到的5份细胞团粒中,将每 一份在100 ill IOX硫酸右旋糖苷中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。将终体积用DPBS调成lml。将来自每份小样的200 ii I分配入适当标注的玻璃管形瓶，并对每份小样中的细胞计数。将所有小样进行缓慢冷冻，就是8 C I hr,4 C 2 hr,-20 C 4 hr和最终-70 C 8hr。除一份冷冻对照外，将剩余所有小样进行冻干大约48 hr o冻干细胞团粒物用200 ylDPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生5%完整细胞，而冻干后没有观察到完整细胞。虽然几种胞内和胞外低温防护剂能够保持被杀死细胞的形态和完整性，但是海藻糖和PVP表现出超出其它试剂的优势。实施例14
用Mw处理Ix 107个B16F1细胞/ml。采用锥虫蓝染料排斥原理，百分比细胞死亡为25%。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液。将细胞团粒在IOOyl 50X海藻糖或100 ill IOX PVP中重悬浮并于37° C温育15 min。将终体积用DPBS调成lml。制备每份200 Ul的5份小样，并对每份小样中的细胞计数，之后冻干。将样品在液氮中进行快速冷冻。除一份冷冻对照外，将剩余所有样品进行冻干大约48 hr o冻干物用200 illDPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生39%完整细胞，而冻干导致9%完整细胞回收。这两种低温防护剂的组合表现出超出它们任一单独的优势。实施例15
用Mw处理浓度为Ix 107个细胞/ml的HEK-293。采用锥虫蓝染料排斥原理，百分比细胞死亡为80%。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。丢弃上清液。将细胞团粒在5 ml DPBS中重悬浮并将总体积分配入每个I ml的5份小样。对每份小样中的细胞计数，接着以1500 rpm离心10 min。将细胞团粒在IOOyl 50X海藻糖中重悬浮并于37° C温育30 min。随后添加IOOiU IOX PVP，并将样品再次于37° C温育30 min。将终体积用DPBS调成lml。将总体积分配入每个200 ill的小样。将所有小样在液氮中快速冷冻，并且，除一份冷冻对照外，将剩余所有小样进行冻干大约48 hr o冻干物用200 ill DPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生67%完整细胞，而冻干导致49%完整细胞回收。这两种低温防护剂的组合表现出超出它们任一单独的优势。将PVP添加至海藻糖导致与它们任一单独或将海藻糖添加至PVP相比更高的完整细胞回收(约50%)。实施例16
用Mw处理浓度为Ix 107个细胞/ml的B16F10细胞。使用锥虫蓝排斥测定法测定的百分比细胞死亡为31%。将总体积分配入每个I ml的10份小样并对每份小样中的细胞数计数，之后加工。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。将细胞团粒在IOOyl 50X海藻糖中重悬浮并于37° C温育15 min。然后添加IOOiU IOX HES，并将样品再次于37° C温育15 min。将终体积用DPBS调成lml。将200 分配入适当标注的玻璃管形瓶。将样品在液氮中快速冷冻，并且，除一份冷冻对照外，将剩余所有样品进行冻干大约48 hr。冻干物用200 ill DPBS重建，并使用血球计对完整细胞总数计数。冷冻对照产生95%完整细胞，而冻干导致70%完整细胞回收，但是显著量的细胞一起成块。海藻糖+ PVP看来是不同低温防护剂的所有其它测试组合中最好的。实施例17 :评估细胞大小和粒度
流式细胞术能提供关于来自培养基中同质或异质组织/细胞悬浮液的细胞大小和粒度的信息。细胞大小以自细胞膜产生的衍射激光来测量；而粒度以靶向细胞的颗粒时发射的反射和折射光来测量。细胞大小在散点图的正向散射(FSC)标度上测量；而粒度在散点 图的侧向散射(SSC)标度上测量。对冻干细胞的评估指示两种截然不同的群体，如图I所示。群体Pl出现于与群体P2相比更低的FSC和SSC群体，提示群体P2与群体Pl相比更大且拥有更多颗粒。实施例18 :测定细胞完整性
冻干细胞用细胞膜脂质结合分子PKH26染色。PKH26由蓝色激光激发，吸收551nm的光并发射567nm的光。图2显示Pl和P2群体都摄取PKH26染料。冻干细胞用PKH26染料染色。90. 7%的Pl群体和96. 3%的P2群体是PKH26阳性的。实施例19 :测定细胞死亡
通过能渗透入具有受损细胞膜的细胞的碘化丙啶(PI)染料来评价细胞死亡。图3显示Pl和P2都摄取PI染料，提示这两个群体都是死的。冻干细胞用PI染料染色。78. 3%的Pl群体和97. 8%的P2群体是PI阳性的。实施例20 :具有完整细胞膜和核被膜的细胞
配制剂用苏木精和曙红染色以评估细胞膜和核膜完整性。观察到具有完整核的完整细胞(图4)。实施例21
用Mw处理浓度为1x107个细胞/ml的MiaPaCa 2细胞。使用锥虫蓝排斥测定法测定的百分比细胞死亡为100%。将总体积分配入每个5 ml的2份小样并对每份小样中的细胞数计数，之后加工。通过以1500 rpm离心10 min使细胞成团粒。将细胞团粒在IOOyl50X海藻糖中重悬浮并于37° C温育15 min。随后添加lOOyl IOX PVP，并将小样再次于37° C温育15 min。将200 iU分配入适当标注的玻璃管形瓶，并在液氮中快速冷冻。将一组管形瓶冻干大约48 hr。冻干物用200 u I DPBS重建，并在第I天和第21天在Balb/C小鼠中注射细胞悬浮液。在对照组中在第I天和第21天施用非冻干的配制细胞。在第28天，处死所有小鼠并分离脾细胞。实施伽马干扰素ELISP0T来评估免疫应答。冻干细胞显示出相等数目的生成伽马干扰素的细胞，指示保留免疫原性，事实上稍微更好(图5)。实施例22
通过以1500 rpm离心10 min使被杀死的107个细胞/ml的癌细胞成团粒。丢弃上清液。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。将处理组细胞团粒在终浓度5% w/v的海藻糖(在DPBS中)中重悬�。幼庞�37° C温育15 min。随后，以终浓度1% w/v添加PVP，并将细胞悬浮液于37° C温育15 min。将总体积分配入每个I ml的小样并对每份小样中的细胞计数。在冻干前，将所有小样在液氮中进行快速冷却。细胞在DPBS中重建。在玻璃载玻片上制备涂片；风干并用丙酮固定。用在PBS中含有5% BSA、血清、和2% Triton-X 100的封闭缓冲液封闭I小时。与1:100稀释的针对细胞表面标志物的一抗一起温育I小时，用于检测。用含有Triton的PBS清洗。与FITC标记的抗小鼠IgG 二抗(I 1000) 一起温育。用含有Triton的PBS清洗。在荧光显微镜下检测表面蛋白，如图6所示。该方法可用于运输被杀死的或活的组织的样品，及稍后将它们用于诊断或法医学。
胞内和胞外低温防护剂都能够保持经Mw处理的细胞的形态。PVP和海藻糖表现出超出右旋糖苷和聚山梨酯-80 二者(其中细胞表现出成块)的优势。这两种低温防护剂的组合表现出超出它们任一单独的优势。将PVP添加至海藻糖导致与它们任一单独或将海藻糖添加至PVP相比更高的完整细胞回收(大约50%)。通过冻干的保存方法可用于保存保留免疫原性、完整结构和核酸的完整细胞疫苗候选。该方法还可用于为法医学应用和诊断目的保存细胞样品。
权利要求
1.基本上保留免疫原性特性的被杀死细胞的一种稳定组合物，其包含被杀死的细胞，至少一种胞内低温防护剂，至少一种胞外低温防护剂，任选的佐剂和赋形剂。
2.权利要求I的组合物，其中所述胞内低温防护剂是碳水化合物。
3.权利要求2的组合物，其中所述碳水化合物是海藻糖或蔗糖。
4.权利要求2的组合物，其中所述碳水化合物的范围为I至10% w/v浓度。
5.权利要求I的组合物，其中所述胞外低温防护剂是两性聚合物。
6.权利要求5的组合物，其中所述两性聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟乙基淀粉(HES)、聚山梨酯或其混合物。
7.权利要求5的组合物，其中所述两性聚合物的范围为0.I至5% w/v浓度。
8.权利要求5的组合物，其中所述两性聚合物具有范围为30至50千道尔顿的分子量。
9.权利要求I的组合物，其中所述佐剂选自油、铝盐、和病毒颗粒、活的或死的完整生物体、微生物的提取物及其组合。
10.权利要求I或9的组合物,其中所述佐剂是分枝杆菌w(Mw)。
11.制备权利要求1-8的组合物的方法，包括 a.杀死细胞， b.用胞内低温防护剂处理自步骤a获得的组合物， c.用胞外低温防护剂处理自步骤b获得的组合物， d.在冻干前将自步骤c获得的组合物快速冷冻成冷冻配制剂， e.冻干自步骤d获得的组合物。
12.权利要求11的制备组合物的方法，其中快速冷冻在_100°C以下进行。
13.权利要求11的制备组合物的方法，其中冻干在25mtor真空以下进行。
14.权利要求11的制备组合物的方法，其中冻干在25°C以下进行。
全文摘要
本发明公开了用于冻干经处理细胞的工艺，其包括使用溶液含有海藻糖以及两性聚合物聚乙烯吡咯烷酮。本发明还公开了处理癌细胞、冷冻、冻干和重建的工艺，回收经免疫调控剂处理的死的但完整的癌性细胞，其随后可用于癌症免疫疗法。
文档编号G01N33/574GK102753975SQ201180009560
公开日2012年10月24日 申请日期2011年2月17日 优先权日2010年2月19日
发明者尼拉弗·玛挪依卡玛尔·迭斯艾, 巴库拉许·玛发特拉尔·卡玛尔, 拉吉·印爪瓦当·莫帝, 萨汀德·辛格 申请人:卡帝拉药物有限公司
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