专利名称：恩诺沙星elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物性食品安全和畜牧业生产中药物残留量的检测试剂盒，特别是检测动物性食品和水产类产品中恩诺沙星残留量的试剂盒。
背景技术：
恩诺沙星是氟喹诺酮类抗生素，具有下列特性由于独特的化学结构，使其成为曾医临床药物中十分重要的抗生素。恩诺沙星对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和支原体类病原菌均具有广谱抗菌活性，低浓度下对细菌史原体也具有杀菌作用，还能杀死对抗生素具有抗药力的细菌，例如抗B-乳酸菌素、氨基糖苷等。恩诺沙星因其具有独特的作用，自80年代开始就被广泛的应用于动物和鱼虾类的疾病的预防和治疗。但最近的研究发现，凡使用过恩诺沙星的动物，在一定时期内其产品都有残留，因其具有神经毒性和肾脏毒性，所以在动物食品中残留会对人类健康造成威胁和影响，欧美国家及我国均要求对其限量使用。目前，我国对食品中恩诺沙星残留的测定方法有高效液相色谱法(HPLC)、微生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)等。采用HPLC法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但恩诺沙星分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需将它转变为具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难，而且测定仪器昂贵、操作要求和技术含量高，其最低检测线为10μg/mL。ELISA法是食品检验的常用方法，但国内用于检测药物残留的研究很少，用于检测恩诺沙星的ELISA试剂盒更是一项空白。
(三)实用新型内容本实用新型目的是提供一种小巧轻便的恩诺沙星残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，可进行一次连续多个样品中恩诺沙星含量的测定。
本实验新型的技术方案是采用96孔聚苯乙烯试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被恩诺沙星偶联抗原制成检测板，将40ml浓缩洗涤液、11ml过氧化物酶标记物、6ml恩诺沙星抗体、6ml显色液A剂、6ml显色剂B液、6ml终止液和6瓶500μl不同浓度的标准液，试剂用不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与试剂板、盖板膜一同封装在盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96个测定(包括标准分析孔)，即可进行一次连续多个样品的检测。检测时，样本中的残留物(恩诺沙星)将和微孔条上预包被的偶联恩诺沙星抗原竞争抗恩诺沙星抗体，加入酶标抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物(恩诺沙星)的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物(恩诺沙星)的含量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度最低检测限为1ppb，回收率鸡肉组织为80％±20％、鱼类为75％±15％。同诺氟沙星和环丙沙星的交叉反应率均为10％以下。相对于其他恩诺沙星残留检测，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质器、振荡机和微量加样器，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。
本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于肉类食品和水产品中恩诺沙星残留的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为12.8cm)；图2为本实用新型酶联板的俯视图；图3为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8.55cm)；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图。
参见附图酶标反应微孔条(2)预包被恩诺沙星偶联抗原(3)固定于酶联板的外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶联板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2)；白色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液，白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml显色液A剂，红色帽(6)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml显色剂B液，恩诺沙星抗体用绿色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装6ml恩诺沙星抗体，黄色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装6ml终止液，黑色帽的透明玻璃试剂瓶(9)用于封装500μl/瓶的标准液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(11)，6ml显色液A剂瓶位(12)，6ml显色剂B液瓶位(13)，6ml恩诺沙星抗体瓶位(14)，6ml终止液瓶位(15)，6种500μl/瓶各种浓度的标准液瓶位(17)。
本实用新型的实施例1.肝脏、鸡肉中恩诺沙星含量的测定1)称2.0g均质过的鸡肉样本于50ml离心管中，加入已调好PH的乙晴水溶液10ml，充分上下混合10分钟，4000rpm离心10分钟；取上层液相4ml，加入正己烷4ml，混合8min，3000rpm离心8min去掉上层有机相，以及两液面相交处约1ml的液体；取下层2.5ml，加入1ml去离子水(超纯水)，混匀，用PH试纸测定其PH值，一般都在7-8之间，若没在此范围，就用已配好的酸、碱两种溶液调到7-8即可加入乙酸乙脂4ml，充分混匀20min，4000rpm离心10min，取上层有机相到干燥瓶中，50℃旋转蒸发至干，用1mlPB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1ml混合5min，取出10000rpm离心8min；轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50ul+200ulPB缓冲液混匀即可。
2)使用试剂盒的操作步骤①将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒中取出，置室温(20～24℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀②配液将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用蒸馏水或去离子水稀释至800ml备用(按需量稀释)；③取出需要数量的已包被抗原的微孔板及框架，将不用的微孔板重新密封，保存于2～8□不要冷冻；④编号将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔；⑤加标准品/样本50μl/孔，然后加一抗工作液50μl/孔，用盖板膜封板，37℃水浴或恒温箱反应30min，取出，每孔加300μl洗涤液，洗板5次，拍干；⑥加酶标二抗每孔加入100μl，用盖板膜盖板后置37℃水浴或恒温箱反应30min。取出，每孔加300μl洗涤液，洗板5次，拍干；⑦显色每孔加入显色剂A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃水浴或恒温箱避光显色15min；⑧测定每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定每孔OD值。
3)结果判定有两种方法，定性判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含恩诺沙星量成负相关。
①用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样品1的吸光度值为0.6，样品2的吸光度值为1.0，标准液吸光度值分别是0ng/ml为1.500；0.5ng/ml为1.380；1.5ng/ml为1.200，4.5ng/ml为0.900；13.5ng/ml为0.700；40.5ng/ml为0.400。则样品1的浓度范围是13.5ng/ml-40.5ng/ml；样品2的浓度范围是1.5ng/ml-4.5ng/ml；②所获得的标准值和样品吸光度值的平均值除以第一个标准(0标准)的吸光度值再乘以100，因此0标准等于100％并以百分比的形式给出吸光度值。计算的标准值绘成为一个对应恩诺沙星浓度(ng/ml)的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度(ng/g)可以从校正曲线上读出。
4)测定前的注意事项①使用之前将所有试剂回升至室温20-24℃；②使用之后立即将所有试剂放回2-8℃；③在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELISA测定程序中的要点；④在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
权利要求1.本实用新型涉及对动物性食品和水产品中的恩诺沙星残留的检测试剂盒。包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、12瓶试剂和放试剂的下凹瓶位。其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被恩诺沙星偶联抗原制成的检测板，12瓶试剂分别为标准液、过氧化物酶标记物、恩诺沙星抗体、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述涉及对动物性食品和水产品中的恩诺沙星残留的检测试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒96孔的聚苯乙烯板，放于真空铝铂袋内；盖板膜是透明塑料硬膜，放于铝铂袋内；标准液均用黑色帽的透明玻璃瓶，过氧化物酶标记物用红色帽的白色塑料瓶，恩诺沙星抗体用绿色帽的白色塑料瓶，显色剂A液用白色帽的白色塑料瓶，显色剂B液用红色帽的黑色塑料瓶，终止液用黄色帽的白色塑料瓶，浓缩洗涤液用白色帽的半透明塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述涉及对动物性食品和水产品中的恩诺沙星残留的检测试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有12个反应孔，每个反应孔预包被恩诺沙星偶联抗原；盖板膜大小与酶标板一致；标准液6瓶均为(0ng/ml，1ng/ml，4ng/ml，16ng/ml，64ng/ml，256ng/ml)500μl/瓶，过氧化物酶标记物11ml，恩诺沙星抗体6ml，显色液A液6ml。显色液B液6ml，终止液6ml，浓缩洗涤液40ml。
4.根据权利要求1所述涉及对动物性食品和水产品中的恩诺沙星残留的检测试剂盒，其特征在于上述酶标板、标准液、过氧化物酶标记物、恩诺沙星抗体、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液直接可用于检测恩诺沙星残留量。
专利摘要本实用新型是一种涉及动物性食品安全和畜牧业生产中药物残留的检测试剂盒，特别是对动物性食品和水产品中恩诺沙星残留的检测试剂盒。由96孔聚苯乙烯酶联板、40ml浓缩洗涤液、11ml过氧化物酶标记物、6ml恩诺沙星抗体、6ml显色液A液、6ml显色液B液、6ml终止液、6瓶不同浓度的标准液和盖板膜构成。采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联恩诺沙星抗原，样本中的残留物恩诺沙星将和微孔条上预包被的偶联恩诺沙星抗原竞争抗恩诺沙星抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物恩诺沙星的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留恩诺沙星的含量。与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点。
文档编号G01N33/573GK2634479SQ03206700
公开日2004年8月18日 申请日期2003年8月4日 优先权日2003年8月4日
发明者何方洋 申请人:何方洋
专业数控铣床产品供应商
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