专利名称：检测物的检测装置、电极、基板、检查芯片及检测方法
技术领域：
本发明涉及检测物的检测装置、电极基板、工作电极、检查芯片、检测物的检测方法、以及受测物的检测方法。更具体而言，本发明涉及的是用于检测或定量受测物、并据此进行疾病的临床检查及诊断等的检测物的检测装置、电极基板、工作电极、检查芯片、检测物的检测方法及受测物的检测方法。
背景技术：
疾病的临床检查和诊断往往是如下进行的用遗传基因检测方法和免疫学检测方法等方法检测生物试样中含有的与疾病相关的基因和蛋白质等。在这种临床检查和诊断中，有人提出用光激励具有光化学活性的标记物，并用如此产生的电流检测基因和蛋白质等受测物(光电化学检测方法)(例如参照美国公开专利第2009/294305号等)。
美国公开专利第2009/294305号公开的方法是用具有光化学活性的增感色素等检测物，根据该检测物的光激励所产生的电流，检测受测物。在此美国公开专利第 2009/294305号公开的方法中，首先要用具有光化学活性的检测物标记受测物。然后，用光照标记后受测物，使标记后受测物中所含增感色素产生光激励。测定光激励所产生的电流。 根据此电流的测定结果可以灵敏地检测出受测物。然而，要检测出更微量的受测物，检测灵敏度还有待提高。
发明内容
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
本发明正是鉴于上述情况，其目的在于提供可以一种能够灵敏地检测出检测物的检测物的检测装置、电极基板、工作电极、检查芯片、以及受测物的检测方法。
在提高光电化学检测方法中受测物的检测灵敏度的方法中，已知有一种方法是通过增加光源照射出的激励光的强度，相对增强因检测物等而产生的光电流。但是，在这种方法中，非因检测物等而产生的光电流也会一起被相对增强，S/N比可能会恶化。
本发明人发现了以下事项，从而完成了本项发明将通过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的检测物，以此可以在不增加非因检测物而产生的光电流的情况下，增加因检测物而产生的光电流，。
本发明提供
(1) 一种检测装置，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该装置包括工作电极主体，能够容纳所述检测物产生的电子，并具有透光性；反电极；光源，向所述工作电极主体上的检测物照射激励光；及反射部件，用于将所述光源照射出的、并且通过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
(2) (1)所述检测装置，其中所述反射部件选自由白金、铝、金、银和铜所组成的群中的至少一种构成。
(3)⑴所述检测装置，其中所述工作电极主体由导电层和电子容纳层构成。
(4) (1)所述检测装置，其中所述光源配置在用于容纳所述工作电极主体上的检测物的电子的电子容纳面一侧，所述反射部件设置在与所述电子容纳面相反的一面。
(5) (4)所述检测装置，其中所述反射部件设置在远离所述工作电极主体的位置。
(6) (4)所述检测装置，其中所述反射部件通过具有透光性的绝缘层与所述工作电极主体成为一体。
(7) (6)所述检测装置，其中与所述工作电极主体上的所述电子容纳面相反一侧的表面有具有透光性的绝缘层。
(8) (6)所述检测装置，其中所述绝缘层是用于保持工作电极主体的形态的基板主体。
(9) (4)所述检测装置，其中所述反射部件设置在用于保持工作电极主体的形态的基板主体上。
(10) (1)所述检测装置，其中所述光源配置在用于容纳所述工作电极主体上的检测物的电子的电子容纳面的相反一侧，所述反射部件设在所述电子容纳面一侧中远离所述工作电极主体的位置。
(11) (10)所述检测装置，其中在与所述工作电极主体上的所述电子容纳面相反一侧的表面上设有具有透光性的绝缘层。
(12) 一种电极基板，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该基板包括基板主体；工作电极主体，位于所述基板主体上、能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主体上、能够将光源照射出的、透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
(13) (12)所述电极基板，其中所述基板主体上有反电极。
(14) 一种工作电极，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物的，该电极包括工作电极主体，位于所述基板主体上、能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主体上，将光源照射出的、透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
(15) 一种检查芯片，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该芯片包括电极基板，由基板主体、工作电极主体、以及反射部件构成，其中所述工作电极主体位于所述基板主体上，能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；所述反射部件位于所述基板主体上，将光源照射出的、且透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上；及反电极。
(16) 一种检测物的检测方法，用具有透光性的工作电极主体和反电极，对因光激励而产生电子的检测物进行光电化学检测，该方法包括使所述工作电极主体上存在有检测物；向所述工作电极主体上的检测物照射激励光；将透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上；及测定所述工作电极主体与反电极之间的电流。
(17) 一种受测物的检测方法，用具有透光性的工作电极主体和反电极对受测物进行光电化学检测，该方法包括使受测物与标记结合物接触，形成受测物与标记结合物的复合物，其中所述标记结合物是用标记物标记用于捕捉此受测物的结合物而形成的；使所述工作电极主体上至少存在有标记物；向所述工作电极主体上的标记物照射激励光；将透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的标记物上；及测定所述工作电极主体与反电极之间的电流。
采用本发明的检测物的检测装置、电极基板、工作电极、检查芯片、以及受测物的检测方法，可以高灵敏度地检测出检测物和受测物。
图1为本发明一实施方式涉及的检测物的检测装置的结构斜视说明图2为图1所示检测装置的结构框图3为本发明另一实施方式涉及的检测物的检测装置的结构框图4为本发明一实施方式涉及的检查芯片的斜视说明图5为图4所示检查芯片的AA—线的截面说明图6A为图4所示检查芯片中所含上基板的平面说明图6B为图4所示检查芯片中所含下基板的平面说明图7(a)为图4所示检查芯片中含工作电极的部分的简略示意图、(b)为图4所示检查芯片中含工作电极的部分的变形例的简略示意图8为本发明其他实施方式涉及的检查芯片的截面说明图9(a)为图8所示检查芯片中含工作电极的部分的简略示意图、(b)为图8所示检查芯片中含工作电极的部分的另一例的简略示意图IOA为上基板变形例的平面说明图IOB为下基板变形例的平面说明图IlA为上基板变形例的平面说明图IlB为下基板变形例的平面说明图12A为上基板变形例的平面说明图12B为下基板变形例的平面说明图12C为间隔固定件的变形例斜视说明图13为本发明一实施方式涉及的检测物的检测方法的处理步骤流程图14为本发明一实施方式涉及的检测物的检测方法中各步骤的概要说明图15为激励光照射步骤及激励光反射步骤中光源和反射部件的配置的变形例的简要说明图16为激励光照射步骤及激励光反射步骤中光源和反射部件的配置的变形例的简要说明图17为激励光照射步骤及激励光反射步骤中光源和反射部件的配置的变形例的简要说明图18为激励光照射步骤及激励光反射步骤中光源和反射部件的配置的变形例的简要说明图19为本发明其他实施方式涉及的检测物的检测方法的处理步骤流程图20为本发明其他实施方式涉及的检测物的检测方法各步骤的概要说明图21为本发明一实施方式涉及的受测物的检测方法的处理步骤流程图22为在本发明一实施方式涉及的受测物的检测方法各步骤中，从受测物捕捉步骤到分离步骤的简要说明图23为本发明其他实施方式涉及的受测物的检测方法的处理步骤流程图M为本发明另一实施方式涉及的受测物检测方法的处理步骤流程图25为本发明再一实施方式涉及的受测物检测方法的处理步骤流程图2队为制造例1获得的电极基板的工作电极的结构简要说明图^B为图所示电极基板的BB —线的截面说明图^C为图26A所示电极基板的CC 一线的截面说明图27为试验例1中对所用电极的种类(透过型和反射型)与光电流之间关系进行调查所获得的结果图28A为试验例2对所用电极的种类和激励光强度与光电流之间的关系进行调查所获得的结果图28B为试验例2对所用电极的种类和激励光强度与S/N比之间的关系进行调查所获得的结果图四为试验例3中对所用电极的种类(透过型和反射型)与光电流之间关系进行调查所获得的结果图30A为制造例4中获得的电极基板的工作电极的结构概要说明图30B为图30A所示电极基板的BB —线的截面说明图30C为图30A所示电极基板的CC 一线的截面说明图31为试验例4中对所用电极的种类(透过型和反射型)与光电流之间关系进行调查所获得的结果图。
具体实施方式
下面参考附图，就本发明的优选实施方式进行说明。
[用词的定义]
在本说明书中，“因光激励而产生电子的检测物，，是指在工作电极上进行光电化学检测的目标物，包含标记物。在此，标记物为选自以下物质组成的群中的至少其中之一金属配合物、有机荧光体、量子点、及无机荧光体。标记物的具体例子可以举出金属酞菁、钌配合物、锇配合物、铁配合物、锌配合物、9-苯基氧杂蒽(phenylxanthene)类色素、花青色素、金属花青(MetalloCyanine)色素、氧杂蒽类色素、三苯甲烷(triphenylmethane)类色素、氮蒽(acridine)类色素、恶嗪(Oxazine)类色素、香豆素类色素、部花青(Merocyanine) 类色素、若丹菁(rhodacyanine)类色素、聚甲炔(polymethine)类色素、吓啉(porphyrin) 类色素、酞菁(phtharocyanine)类色素、若丹明类色素、氧杂蒽(xanthene)类色素、叶绿素类色素、曙红(eosin)类色素、红汞(mercurochrome)类色素、靛青(indigo)类色素、氟硼荧(BODIPY)类色素、卡尔科弗卢尔(CALFluor)类色素、俄勒冈绿(Oregongreen)类色素、 对甲氨基酚(Miodol)绿、德克萨斯红、级联蓝(Cascade Blue)、核酸(DNA、RNA等)、硒化 fg (cadmiumselenide)(Cadmium telluride) > Ln203:Re> Ln202S:Re> Zn0> Caff04> MO · xA1203:Eu、Zn2Si04:Mn、LaP04:Ce、Tb、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7、Cy7. 5 及 Cy9 (全部为安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)生产)；Alexa Fluor 355, AlexaFluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、 Alexa Fluor 555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluo r 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fl uor 660、Alexa Fluor 680、AlexaFluor 700、Alexa Fluor 750 禾口 Alex a Fluor 790(全部为分子探针(Molecular Probes)公司生产)；DY-610、DY-615、DY-630、 DY-631、DY-633、DY-635、DY-636、EVOblue 10、EVOblue 30、DY-647、DY-650、DY-651、 DY-800、DYQ-660 和 DYQ-661(全部由 Dyomics 公司生产)；Atto 425,Atto 465,Att ο 488、 Atto 495、Atto 520、Atto 532、A tto 550、Atto 565、Atto 590、Atto 594、Atto 610、Atto 611X、Atto 620、Att ο 633、Atto 635、Atto 637、Atto 647、A tto 655、Atto 680、Atto 700, Atto 725 和 Atto 740 (全部由 Atto-TEC GmbH 公司生产)；VivoTagS680、VivoTag680 和VivoTagS750(全部由VisEnMedical公司生产)。Ln表示La、Gd、Lu或Y，Re表示镧类元素，M表示碱土类金属元素，χ表示0.5 1.5的数字。关于标记物的其他例子，可以参考美国专利公报第2009/294305号、美国专利公报第5893999号、特愿(日本专利申请)第 2008-154179号公报等。
在本说明书中，检测物可以是标记物直接结合到受测物而形成的复合物。检测物也可以是在固相上捕捉到受测物后，让标记物结合到与所捕捉的受测物的量相应存在的物质上而形成的复合物。在此，所谓固相是指由二氧化硅(玻璃)、金属等无机材料、聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene ter印hthalate)、聚酰亚胺(PI)树脂等塑料材料构成的基板或至少含有这些材料中的其中之一的基板；可以是管筒；纤维；薄膜；纳米结构物(如中孔硅(mesoporous silica)等二氧化硅类纳米结构物、多孔氧化铝(porous alumina)等)；也可以是玻璃珠、磁珠、金属粒子、塑料珠等粒子或至少含这些微珠中的其中之一的粒子等。
在本说明书中，所谓“诱导用修饰物”是指将检测物和标记物等诱导到工作电极附近的物质。
[检测装置的结构]
下面根据
本发明的检测物的检测装置的一例。
图1为本发明一实施方式涉及的检测物的检测装置的斜视说明图。此检测装置1 是用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物的检测装置。
检测装置1包括用于插入检查芯片20的芯片接受部件11、以及用于显示检测结果的显示器12。
图2为图1所示检测装置1的结构框图。检测装置1有显示器12、光源13、电流表(电流测定部件)14、电源(加电部件)15、A/D转换部件16和控制部件17。
光源13向检查芯片20的工作电极上的检测物照射光线，激励该检测物。此光源 13可以配置在后述检查芯片20的工作电极的电子容纳面一侧。光源13也可以配置在后述检查芯片20的工作电极的电子容纳面相反一侧。光源13只要能产生激励光的光源即可。 作为这种光源比如有荧光灯、不可见光、杀菌灯、白炽灯、低压水银灯、高压水银灯、氙气灯、 水银氙气灯、卤钨灯、金属卤化物灯、LED (白色LED、蓝色LED、绿色LED和红色LED等)、激光(二氧化碳激光、色素激光、半导体激光)、太阳光等。在光源当中，以荧光灯、白炽灯、氙气灯、卤钨灯、金属卤化物灯、LED、激光或太阳光为宜。在光源当中，以激光更为理想。也可以根据需要，通过分光器和带通滤波器进行调整，使光源只照射一定波长带的光。
电流表14用于测量因被激励的检测物所释放的电子而产生的、在检查芯片20内流动的电流。
电源15用于给检查芯片20上的电极施加一定电位。
A/D转换部件16用于对电流表14测量的光电流值进行数字化。
控制部件17由CPU、ROM、RAM等构成，用于控制显示器12、光源13、电流表14和电源15的运行。控制部件17通过A/D转换部件16进行了数字化的光电流值，根据预先制成的、用于反映光电流值与检测物的量的关系的检量线，估算检测物的量。
显示器12用于显示控制部件17估算出的检测物的量。
在检测装置1中，当检查芯片使用无反射部件的检查芯片，即使用无反射层的检查芯片时，也可以在通过检查芯片与光源13相对的位置上设置反射部件18 (参照图3)。此反射部件18由能够反射激励光的材料构成。这种材料无特别限定，如可以是白金、铝、金、 银、铜等金属、合金或金属化合物。
下面说明本发明一实施方式涉及的检查芯片的结构。图4为本发明一实施方式涉及的检查芯片20的斜视说明图。图5为图4所示检查芯片20的从AA—线的截面说明图。
检查芯片20由上基板30、设在上基板30下方的下基板40、以及夹在上基板30与下基板40之间的间隔固定件50构成。在检查芯片20中，上基板30和下基板40在一侧重叠配置。上基板30和下基板40重叠的部分中间有间隔固定件50。
上基板30如图6 (A)所示，由基板主体30a构成。此基板主体30a设有试样注入口 30b，用于向内部注入含检测物的试样等。此试样注入口 30b在基板主体30a上位于设有间隔固定件50的部分的内侧。
基板主体30a呈矩形。此基板主体30a的形态无特别限定，也可以是多角形、圆盘形等。从便于基板制作和便于使用的观点出发，最好是矩形。构成基板主体30a的材料无特别限定，比如可以是玻璃、聚对苯二甲酸乙二酯、聚酰亚胺(PI)树脂等塑料材料、金属等无机材料。在这些材料当中，从确保透光性、足够的耐热性、持久性和平滑性的观点以及降低材料所需成本的观点出发，以玻璃为宜。从确保足够的持久性的观点来看，基板主体30a 的厚度以0. 01 Imm为宜，0. 1 0. 7mm更好，最好是约0. 5mm。基板主体30a的大小无特别限定，在检测多种检测物和受测物(多项目)时，根据项目数量而定，通常为20mmX 20mm。
下基板40如图6 (B)所示，具有基板主体40a、工作电极61、反电极66、以及参比电极69。基板主体40a为矩形，与上基板30的基板主体30a的大小基本相同。此基板主体 40a的表面上有工作电极61、与此工作电极61连接的电极导线71、反电极66、与此反电极 66连接的电极导线72、参比电极69、与此参比电极69连接的电极导线73。
构成基板主体40a的材料无特别限定，比如可以是玻璃、聚对苯二甲酸乙二酯、聚酰亚胺(PI)树脂等塑料材料、金属等无机材料。在这些材料当中，从确保足够的透光性、耐热性、持久性和平滑性等观点以及从降低材料所需成本的观点出发，以玻璃为宜。
基板主体40a的材料、厚度和大小与上基板30的基板主体30a的材料、基板主体 30a的厚度和大小相同。
工作电极61基本呈四角形。工作电极61配置于基板主体40a的一侧[图6 (B) 的右侧]。电极导线71从工作电极61向基板主体40a的另一侧[图6 (B)的左侧]延伸。 反电极66在基板主体40a上配置在工作电极61外侧的位置[在图6(B)中为工作电极61 的右侧]。电极导线72从反电极66绕过工作电极61向基板主体40a的另一侧[图6 (B)的左侧]延伸。参比电极69隔着工作电极61配置于与反电极66相对的位置上。电极导线73从参比电极69向基板主体40a的另一侧[图6 (B)的左侧]延伸。工作电极61的电极导线71、反电极66的电极导线72、以及参比电极69的电极导线73在基板主体40a的另一侧相互并列配置。
工作电极61如图7(a)所示，由工作电极主体62、绝缘层65、反射层80构成。在工作电极61中，基板主体40a的表面依次有充当反射部件的反射层80、绝缘层65、以及工作电极主体62。
工作电极主体62由导电层63和位于此导电层63的表面的电子容纳层64构成。
导电层63由能使激励光透过的导电材料(以下也称“工作电极材料㈧”)构成。 作为工作电极材料(A)如有含周期表12族元素、13族元素或14族元素的原子、且具有透光性和导电性的材料等。上述材料无特别限定，可以是掺杂硼的氧化锌、掺杂铝的氧化锌、 掺杂镓的氧化锌、掺杂铟的氧化锌等氧化锌类材料；可以是氧化铟、掺杂锡的氧化铟等氧化铟类材料；可以是氧化锡、掺杂锑的氧化锡(ΑΤΟ)、掺杂氟的氧化锡(FTO)等氧化锡类材料； 也可以使掺杂钽的氧化钛、掺杂铌的氧化钛等氧化钛类材料等。导电层63的厚度以1 IOOOnm为宜，最好是10 200nm。
导电层63只要具有透光性和导电性即可，也可以是在玻璃、塑料等具有透光性但不具有导电性的物质组成的非导电性基材的表面上，加上由导电材料构成的导电层，将以此形成的复合材质作为导电层。导电层的形状可以是薄膜状和点状中的任何一种。此时， 工作电极61的厚度以1 IOOOnm为宜，最好是10 200nm。构成导电层的具有导电性的材料例如有掺杂锡的氧化铟、掺杂氟的氧化锡、掺杂锑的氧化锡、掺杂镓的氧化锌、掺杂铝的氧化锌等。其中最好是含有锡的氧化铟和含有氟的氧化锡。
导电层63可以采用适合构成该导电层63的材料种类的膜成型法制作。膜成型法有蒸镀法、溅射法、压印法、丝网印刷法、镀膜处理法、溶胶-凝胶法、旋压覆盖法(Spin Coat)、浸渍法、气相蒸镀法等。
电子容纳层64具有透光性。电子容纳层64含有可收纳电子的物质(电子受体)。 电子受体只要其能级(energy level)能够从被光激励的标记物(后述)接受电子的注入即可。在此，在“能级(energylevel)能够从被光激励的标记物(后述)接受电子的注入” 一句中，比如当电子受体为半导体时，该能级指的是导带(conductionband)。S卩，只要电子受体的能级比标记物(后述)最低未占分子轨道(LUMO)的能级还低即可。电子受体无特别限定，比如有氧化铟、掺杂锡的氧化铟等氧化铟类材料；有氧化锡、掺杂锑的氧化锡(ATO)、 掺杂氟的氧化锡(FTO)等氧化锡类材料。其中掺杂锡的氧化铟或掺杂氟的氧化锡不仅能发挥电子受体的功能，还能发挥导电基材的功能。因此，使用这些材料，可以在不使用导电性基材的情况下，仅用电子容纳层即可充当工作电极。另外，当导电层63为复合材料时，电子容纳层64位于导电材质层上。电子容纳层64的厚度通常为0. 1 lOOnm，最好为0. 1 lOnm。根据构成电子容纳层64的材料的种类，可以用与制作导电层63的方法相同的方法制作此电子容纳层64。
绝缘层65由绝缘体材料构成。绝缘体材料只要是透明的即可，无特别限定。比如可以是玻璃、二氧化硅(Si02)、氟化物树脂等的合成树脂、塑料类等。这种绝缘层65可根据绝缘体材料的种类采取相应制作方法。该方法比如有溅射法、蒸镀法、丝网印刷法、旋压覆10盖法、压印法、喷涂法等。
反射层80由可以反射激励光的材料构成。这种材料无特别限定，比如有白金、铝、 金、银、铅、锡、镍、铑等金属、合金或金属化合物等。反射层80的形状和大小也可以与工作电极主体62相同。反射层80只要能反射透过工作电极主体62的激励光即可。因此，反射层80的大小可以与工作电极主体62上的光照位置的大小相同或略大一些。反射层80可以通过溅射法、蒸镀法、丝网印刷法、镀膜处理法、压印法、旋压覆盖法等制作。从高效地反射透过工作电极主体62的激励光的观点出发，反射层80的表面最好是平滑的。
在本发明中，如图7(b)所示，工作电极61也可以由电子容纳层64、绝缘层65和反射层80构成。此时，在工作电极61中，基板主体40a的表面依次为反射层80、绝缘层65 和电子容纳层64。
上述实施方式中的工作电极61如图7(a)和(b)所示，基板主体40a的表面具有反射层，但不限于此，也可以基板主体40a兼设有反射层。此时，基板主体40a的材料可以使用金属等无机材料。
工作电极61也可以用硅烷偶联剂(silane coupling)进行表面处理。通过此表面处理，可以适当调节工作电极61的表面，使其具有亲水性或疏水性。硅烷偶联剂如有氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)等阳离子型硅烷偶联剂等。
工作电极61的工作电极主体62的电子容纳面6 上也可以固定捕捉物。捕捉物只要是能够捕捉检测物的物质即可。捕捉物比如有核酸、蛋白质、缩氨酸、糖链、抗体、具有特异性识别能力的纳米结构体等。这种捕捉物可以根据检测物的种类适当选择。电子容纳面6 上的捕捉物的量最好根据用途和目的适当设定。将捕捉物固定到电子容纳面6 上的这一作业可通过以化学方式吸附到工作电极主体62的结合基等实现。这种结合基如有硫醇基、羟基、磷酸基、羧基、羰基、醛基、磺酸基、氨基等。也可以使用光固化树脂的方法和物理吸附法固定捕捉物。
反电极66由导电材料的金属层构成。导电材料如有金、银、铜、碳、白金、钯、铬、 铝、镍等金属或至少含这些金属中的其中之一的合金、氧化铟锡、氧化铟、AT0、FT0等金属氧化物、钛、氧化钛、氮化钛等钛化合物等。金属层的厚度以1 IOOOnm为宜，最好是10 200nm。
参比电极69由导电材料的金属层构成。导电材料如有金、银、铜、碳、白金、钯、铬、 铝、镍等金属或至少含这些金属中的其中之一的合金、氧化铟锡、氧化铟、AT0、FT0等金属氧化物、钛、氧化钛、氮化钛等钛化合物等。金属层的厚度以1 IOOOnm为宜，最好是10 200nm。在本实施方式中设有参比电极69，但本发明也可以不设参比电极69。这要根据反电极66所用的电极种类和膜的厚度而定，但当测定电压降低的影响微小的弱电流(如1μ A 以下)时，反电极66也可以兼作参比电极69。而当测定较强的电流时，为控制电压降低的影响，稳定施加在工作电极61上的电压，最好设置参比电极69。
间隔固定件50的形状为矩形环状，由绝缘体-硅胶构成。此间隔固定件50包围着工作电极61、反电极66和参比电极69彼此相对的区域(参照图5和图6)。在上基板 30和下基板40之间有与间隔固定件50厚度相等的间隔。以此，各电极61、66、69之间形成了用于容纳试样和电解液的空间20a(参照图5)。间隔固定件50的厚度通常为0. 2 300 μ m。在本发明中，也可以用聚酯膜制成的两面胶带等取代硅胶，作为构成间隔固定件50的材料。
[检测装置及检查芯片的变形例]
在本发明中，反射部件在检测装置中也可以设置在远离工作电极主体的位置。具体而言，如图8所示，充当反射部件的反射层81也可以设置在与基板主体40a上有工作电极61的面相反的一面。此时，如图9(a)所示，反射层81位于绝缘层，即基板主体40a的一面上，另一面依次设置有导电层63和电子容纳层64。也可以如图9(b)所示，反射层81位于绝缘层，即基板主体40a的一面上，另一面设有电子容纳层64。在图9 (a)和图9(b)的结构中，基板主体40a可以使用玻璃、塑料类等透明的绝缘材料。
在本发明中，工作电极61、反电极66和参比电极69配置在间隔固定件50的框架内，使各电极不与其他电极接触即可。因此，工作电极61、反电极66和参比电极69也可以位于不同的基板主体上。即，检查芯片可以由上基板31(参照图10(A))以及下基板41(参照图10(B))构成，其中所述上基板31的基板主体31a上有试样注入口 31b和参比电极69， 所述下基板41的基板主体41a上有工作电极61和反电极66。检查芯片也可以由上基板 32 (参照图11 (A))以及下基板42 (参照图11 (B))构成，其中所述上基板32的基板主体3 上有试样注入口 32b、反电极66和参比电极69，所述下基板42的基板主体4 上有工作电极61。
在本发明中，反电极66和参比电极69也可以不是设在基板主体上的薄膜状电极。 即检查芯片也可以具有以下部分基板主体33a上有试样注入口 3 的上基板33 (参照图 12(A))；基板主体43a上有工作电极61的下基板43(参照图12(B))；以及固定件主体51a 上有反电极66和参比电极69的间隔固定件51。此时，只要反电极66和参比电极69中的至少一个设置在间隔固定件的固定件主体上即可。此外，在上基板和下基板中的某一个上设置固定件主体上的电极以外的电极即可。
在本发明中，绝缘层65也可以兼有基板主体的功能。此时，可以省略基板主体。
[检测物的检测方法]
在本发明中检测物的检测方法中，使用具有透光性的工作电极主体和反电极，以光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，其包括以下步骤
(1-1)让检测物存在于工作电极主体上，
(1-2)向工作电极主体上的检测物照射激励光，
(1-3)将透过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的检测物上，以及
(1-4)测定工作电极主体和反电极之间的电流。
在方法1中可以使用上述检测装置和检查芯片，但本发明不限于此。
方法1的一大特点在于，检测检测物时，将透过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的检测物上。
通常，在不反射透过了工作电极主体的激励光的情况下，如果加大激励光强度的话，在信号增强的同时，杂波也明显增加。检测灵敏度因此而显著低降。
然而，在方法1中反射透过来的激励光，与不反射透过了工作电极主体的激励光相比，可以超出想象地抑制杂波的增加，同时使信号增强。因此，采用方法1可以确保高检测灵敏度。
在方法1中，根据步骤(1-1)的操作方法，大致可分为以下方法1-1和方法1-2。方法1-1中使用了用于捕捉检测物的捕捉物(参照图13和图14)。方法1-2是将检测物诱导到工作电极主体的方法(参照图19和图20)。
先参照
方法1-1。图13为本发明一实施方式涉及的检测物的检测方法 (方法1-1)的处理步骤流程图。图14为本发明一实施方式涉及的检测物的检测方法(方法1-1)各步骤的概要说明图。在此所举的例子中，用上述检查芯片20，通过检测装置1检测检测物。
在方法1-1中，首先由用户从检查芯片20的试样注入口 30b注入含检测物的液体试样。由此，固定有捕捉物210的工作电极主体62与检测物201接触。检测物201被工作电极主体62上的捕捉物210捕捉到[对应于步骤(1-1)，参照图13中“检测物捕捉步骤 (步骤S1-1) ”、以及图1 和图14b]。通过此步骤，可以使检测物201存在于工作电极主体 62上。
在此步骤Sl-I中，可以在捕捉物210和检测物201结合的条件下进行检测物的捕捉。上述条件可根据检测物201的种类适当选择。比如，当检测物201含有核酸时，可以在有磷酸缓冲生理盐水等溶液存在的条件下，进行捕捉物210对检测物201的捕捉。
在此，捕捉物210根据检测物201的种类适当选择。比如，当检测物201含有核酸时，捕捉物210只要是与此核酸杂交的核酸探针或是此核酸的抗体即可。当检测物201含有蛋白质或缩氨酸时，捕捉物210只要是此蛋白质或缩氨酸的抗体、蛋白质的配体、缩氨酸的受体蛋白质等即可。
在此步骤S1-1，通过捕捉物210捕捉检测物201所结合的受测物，但不限于此，也可以通过捕捉物210捕捉到受测物后，再用检测物201修饰捕捉物210与受测物的复合物。
在此步骤S1-1，用户也可以根据需要清洗工作电极61。这样可以除去检测物201 以外的物质(杂质)。清洗可采取与捕捉物210和检测物201的种类相应的方法等进行。 比如，当捕捉物210和检测物201都含有核酸时，清洗液可以使用含有SSC (IX SSC的构成 0. 15M氯化钠、0. 015M柠檬酸钠、pH7. 0)和表面活性剂的溶液等。此时，这种清洗液中SSC 浓度越低、且表面活性剂浓度越高，越能高效地除去杂质。
然后，用户将步骤Sl-I之后的检查芯片20插入检测装置1的芯片接受部件11。 然后，用户启动检测装置1。此时，首先检测装置1的光源13向工作电极主体62上的检测物201照射激励光[对应于步骤(12)，参照图13中“激励光照射步骤(步骤S1-2)”及图 14c中的“激励光”]。透过工作电极主体62的激励光被工作电极61的反射层80反射向工作电极主体62上的检测物201 [对应于步骤(1-3)，参照图13中“激励光反射步骤(步骤 S1-3)”和图14c中的“反射光”]。再用电流表14测量检测物201因光激励而产生的光电流[对应步骤(1-4)，参照图13中电流测量步骤(步骤S1-4)]。
此步骤S1-2 步骤S1-4在有电解液存在的条件下进行。在本说明书中，为方便起见分别就步骤S1-2 步骤S1-4进行了说明。但是，实际上这些步骤S1-2 步骤S1-4 是同时进行的。
电解液可以使用含有以下物质的溶液由能向氧化状态的标记物提供电子的盐构成的电解质、非质子极性溶剂、质子极性溶剂或非质子极性溶剂与质子极性溶剂的混合物。根据需求，此电解液还可含有其他成分。电解质比如有碘化物、溴化物、金属配合物、 硫代硫酸盐、亚硫酸盐及其混合物等。具体而言，电解质如有碘化锂、碘化钠、碘化钾、碘化铯、碘化钙等金属碘化物；四烷基碘化铵(Tetraalkyl Ammonium Iodide)、吡啶盐碘化物 (pyridiniumiodide)、咪唑碘化物(imidazolium iodide)等四级氨化合物的碘盐；溴化锂、溴化钠、溴化钾、溴化铯、溴化钙等金属溴化物；四烷基溴化铵、吡啶盐溴化物等四级氨化合物的溴盐；氰亚铁酸盐(Ferrocyanides)、二戊铁离子(ferricinium ion)等金属配合物；硫代硫酸钠、硫代硫酸铵、硫代硫酸钾、硫代硫酸钙等硫代硫酸盐；亚硫酸钠、亚硫酸钾、亚硫酸铵、亚硫酸铁、亚硫酸氢钠、亚硫酸钙等亚硫酸盐；及其混合物等。其中最好是四丙基碘化铵。
电解液的电解质浓度最好在0. 001 15M之间。
质子极性溶剂可以用水和以水为主并混合有缓冲液成分的极性溶剂等。非质子极性溶剂如有乙腈(CH3CN)等腈类；碳酸丙烯酯(propylene carbonate)、碳酸乙烯酯等碳酸盐类、1，3 二甲基咪唑烷酮(l,3-dimethylimidazolidinone),3-甲基恶唑烷酮(3-methyloxazolinone)、二烷基咪唑盐(dialkyllimidazolium)等杂环化合物 (heterocyclic compound) ；二甲基甲酉先胺(Dimethylformamide)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)、环丁砜(sulfolane)等。非质子极性溶剂中以乙腈较为理想。质子极性溶剂和非质子极性溶剂可以单独使用或是将两种混合使用。质子极性溶剂和非质子极性溶剂的混合物最好是水和乙腈的混合物。
在步骤S1-2，激励光从电子容纳面6 —侧的光源13向工作电极主体62上的检测物201照射。可根据检测物所含标记物的种类等适当选择激励光的种类。最好在可以抑制杂波发生的范围内适当设定激励光的照射量。
在步骤S1-3，透过来的激励光被反射层80反射。反射光照到工作电极主体62上的检测物201。如此用光激励检测物201。
在步骤S1-4，用上述检测装置1的电流表14测定光电流。在步骤Sl_4，光电流的测定值还用于进行各种演算处理。首先，A/D转换部件16将光电流的测定值(光电流值) 转换成数字化格式。再向控制部件17输入数字化的光电流值。控制部件17根据预先制作的、用于反映光电流值和检测物的量之间的关系的检量线，从数字化的光电流值估算出检测物的量。控制部件17再生成检测结果界面，以便在显示器2上显示估算出的检测物的量。 然后，控制部件17生成的检测结果界面传送到显示器2上。显示器2显示检测结果界面。 处理结束。
在本实施方式中使用的检测装置1中，光源13配置在检查芯片20的电子容纳面 62a 一侧。在本实施方式使用的检查芯片20中，反射层80通过绝缘层65与工作电极主体 62形成一体。
但是，在本发明中，反射部件和光源的配置无特别限定。图15 图18显示的是在激励光照射步骤和激励光反射步骤中，光源和反射部件的配置变形例的简要说明图。
在图15所示变形例所使用的检测装置中，光源13配置在电子容纳面6 —侧。在此检测装置中，光源13设置在远离工作电极主体61的位置上。在图15所示变形例所使用的检查芯片中，反射部件18配置在与电子容纳面6 相反一面的一侧。此反射部件18设置在远离工作电极主体62的位置。在此变形例中，与工作电极主体62的电子容纳面6 相反一侧的表面也可以设置绝缘层65 (参照图16)。
在图17所示变形例所用检测装置中，光源13配置在与电子容纳面6 相反的一侧。在检测芯片中，反射部件18在电子容纳面6 上设于远离工作电极主体62的位置。在此变形例中，与工作电极主体62的电子容纳面6 相反的一侧的表面上也可以设置绝缘层 65 (参照图18)。
下面，参照附图，就方法1-2进行说明。图19为本发明另一实施方式涉及的检测物的检测方法(方法1- 的处理步骤流程图。图20为本发明一实施方式涉及的检测物的检测方法(方法1-2)各步骤的概要说明图。
在方法1-2中，首先由用户从上述检查芯片20的试样注入口 30b注入含检测物的液体试样。由此，检测物201被诱导到没有捕捉物的工作电极主体62 [对应步骤(1-1)，参照图19中“检测物诱导步骤(步骤S2-1) ”、及图20(a)和图20 (b)]。通过步骤S2-1，可以使检测物201存在于工作电极主体62上。
在此步骤S2-1，比如，用户从上述检查芯片20的试样注入口 30b注入含检测物 201和诱导液，该诱导液用于将检测物201诱导至工作电极主体62上。以此，检测物201被诱导到可与不存在捕捉物的工作电极61之间运送电子的区域。
在此，所谓“可与不存在捕捉物的工作电极61之间运送电子的区域”一般为与工作电极61的距离为0 IOnm的范围区域。在本说明书中，所谓“不存在捕捉物”指“实质上不存在捕捉物”。即“不存在捕捉物”这一概念中还包含以下情况在工作电极上仅有微量的捕捉物，其量之小对捕捉目标物毫无帮助。
将检测物201诱导到工作电极61时，可以利用检测物201、诱导液和工作电极61 之间的疏水性相互作用或亲水性相互作用，或者向工作电极61或反电极66施加电压，并利用由此引起的电泳效果。
本诱导步骤比如可以通过以下二种方法实现
1)改变诱导液的疏水性或亲水性，增大检测物201和工作电极61之间的疏水性相互作用或亲水性相互作用(诱导方法1)，
2)根据修饰检测物201的电荷，对工作电极61施加正电压或负电压，以此增强电泳效果(诱导方法2)。诱导方法1和诱导方法2可分别单独运用，也可二者组合起来应用。
在诱导方法1中，比如当检测物201含有核酸(DNA、RNA等)时，从加大检测物201 和工作电极61之间的疏水性相互作用或亲水性相互作用，以便更容易地使检测物接近工作电极61这一观点出发，诱导液最好含有离液序列高的离子。
离液序列高的离子如有碘化物离子、溴化物离子、胍离子、硫氰酸离子、三溴乙酸离子、三氯乙酸离子、高氯酸离子、二氯乙酸离子、硝酸离子、氯化物离子、乙酸离子、钡离子、钙离子、锂离子、铯离子、钾离子、镁离子等。
当诱导液含有离液序列高的离子时，诱导液中的离液序列高的离子的浓度因所用离液序列高的离子种类而不同。该浓度一般为1.0 8.0mol/L。当离液序列高的离子为胍离子时，诱导液中的离液序列高的离子的浓度一般为4. 0 7. 5mol/L。当离液序列高的离子为硫氰酸离子时，诱导液中的离液序列高的离子浓度一般为3. 0 5. 5mol/L。
此外，当检测物201含有核酸时，可以利用惯用的核酸提取和纯化方法将检测物 201诱导到工作电极61附近。
在核酸提取和纯化方法中如有利用液相的方法和利用核酸结合用载体的方法等。 利用液相的方法如有酚/氯仿抽提法(〈Biochimicaet Biophysica acta〉，《生物化学与生物物理学报》，1963 年发行，第 72 卷，pp. 619-629)、碱 SDS 法 Nucleic AcidResearch), 《核酸研究》，1979年发行，第7卷，pp. 1513-1523)、在含有盐酸胍的缓冲液中添加乙醇使核酸沉降的方法 Analytical Biochemistry〉，《分析生物化学》，162，1987，463)等。使用核酸结合用载体的方法中，比如有用玻璃粒子和碘化钠溶液将核酸吸附到玻璃粒子上并进行分离的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,《美国科学院院刊》，76-2 :615_619，1979)、以及使用二氧化二氧化硅粒子和离液序列高的离子的方法(如参照J. Clinical. Microbiology 《临床微生物学杂志》，1990年发行，第28卷，pp. 495-503，专利第2680462号公报等)等。 在用二氧化二氧化硅粒子和离液序列高的离子的方法中，首先将核酸结合了的二氧化硅粒子、含有能够游离试样中的核酸的离液序列高的离子的溶液、以及试样混合，使核酸结合到二氧化硅粒子上。然后，清洗除去杂质。再回收结合到二氧化硅粒子上的核酸。用这些方法可以简便快速地提取核酸。而且，这种方法不仅能提取DNA，还适合提取较为不稳定的RNA， 可以获得高纯度核酸是其一大优点。
因此，检测物201含有核酸时，将用于核酸提取和提纯方法的溶剂用作诱导液，可以将检测物201诱导到工作电极61附近。此时，离液序列高的离子最好使用胍离子、碘化物离子、溴化物离子、硫氰酸离子或这些离子的任意组合，工作电极最好使用结合核酸的电极(比如含锡的氧化铟等)。
当检测物201含有核酸时，根据需要，诱导液也可以含有缓冲液。缓冲液使用用于保持核酸稳定的普通缓冲液即可。从保持核酸稳定的观点来看，缓冲液的缓冲能最好接近中性、即pH5. 0 9. 0。缓冲液如有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、四硼酸钠-盐酸、磷酸二氢钾-四硼酸钠缓冲液等。缓冲液的浓度最好为1 500mmol/L。
另一方面，在诱导方法2中，根据检测物201的电荷，向工作电极施加正电压或负电压。比如，检测物201含有核酸时，该检测物201的核酸部分带负电荷。因此，通过向工作电极61施加正电压，可以将检测物201诱导到工作电极61的附近。
用户将步骤S2-1后的检测芯片20插入检测装置1的芯片接受部件11。然后，用户启动检测装置1。此时，首先，检测装置1的光源13向工作电极主体62上的检测物201 照射激励光[对应步骤(1-2)，参照图19中“激励光照射步骤(步骤S2-2) ”及图20c中的 “激励光”]。透过了工作电极主体62的激励光被工作电极61的反射层80反射向工作电极主体62上的检测物201 [对应步骤(1-3)，参照图19中“激励光反射步骤(步骤S2-3)”和图20c中的“反射光”]。再用检测装置1的电流表14测量检测物201因光激励而产生的光电流[对应步骤(1-4)，参照图19中的电流测量步骤(步骤S2-4)]。
此步骤S2-2 步骤S2-4要在有电解液存在的条件下进行。因此，当在步骤S2_l 中使用诱导液时，可根据需要将该诱导液换成电解液。如果诱导液具有向氧化状态下的标记物提供电子的性质，且可以用光电化学法检测出检测物时，在检测步骤也可以直接使用此诱导液。
步骤S2-2 步骤S2-4可以用与方法1_1的步骤S1-2 步骤S1-4同样的方法实施。
另外，方法1-2使用的工作电极上没有捕捉检测物的捕捉物。因此，工作电极61可以简便地清洗，可以再利用。可用紫外线臭氧清洗技术(UV-03清洗)等清洗工作电极61。 在UV-03清洗中，在紫外线作用下，在有机化合物的分解以及03生成和分解过程中的强大的氧化作用会分解有机化合物，并将有机化合物从电极表面去除。
当检测物含有核酸时，在适当的溶液中，通过给工作电极施加负电压，也可以从工作电极61中离解修饰检测物MOa。这是因为核酸带负电。上述溶液如可以是磷酸缓冲生理盐水(PBS)、TEB[组成IOmM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、ImMEDTA]水等。
在方法1-2中，也可以在步骤S2-1中将诱导用修饰物附加到检测物201上，使用所获得的修饰检测物。诱导用修饰物比如可以是DNA、RNA等核酸等。
[受测物的检测方法]
下面说明本发明的受测物的检测方法。
本发明的受测物的检测方法是用具有透光性的工作电极主体和反电极，用光电化学方法检测受测物，它包括以下步骤
(2-1)让受测物与标记结合物接触，形成受测物与标记结合物的复合物，其中所述标记结合物是用标记物标记用于捕捉上述受测物的结合物而形成的；
(2-2)使工作电极主体上至少存在有标记物；
(2-3)向工作电极主体上的标记物照射激励光；
(2-4)将透过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的标记物上；及
(2-5)测定工作电极主体和反电极之间的电流。
本发明一实施方式涉及的受测物的检测方法[称为“方法2”]的处理步骤如图21 所示。方法2可以使用上述检测装置、检查芯片和检测配套设施(SET)，但本发明不限于此。
方法2根据步骤(2- 的技巧种类大致可分为以下方法2-1和方法2-2。方法2_1 中使用了用于捕捉受测物的捕捉物(参照图21)。方法2-2是将受测物诱导到工作电极主体的方法(参照图23)。
首先，参照附图就方法2-1进行说明。图21是本发明一实施方式涉及的受测物的检测方法(方法2-1)的处理步骤流程图。图22是本发明一实施方式涉及的受测物的检测方法(方法2-1)中各步骤的简要说明图。
方法2-1是与方法1-1相对应的方法。方法2-1与方法1_1的不同点在于其包含以下步骤
-用捕捉受测物的固相捕捉此受测物[图21中受测物捕捉步骤(步骤S3-1)]；
-在受测物上附加标记结合物，其中此标记结合物是用标记物标记捕捉此受测物的结合物而形成的[图21中标记结合物附加步骤(步骤S3-2)]；
-提取含有受测物的固相[图21中提取步骤(步骤S3-3)]；及
-根据受测物的量，至少从固相中分离出标记物[图21中分离步骤(步骤S3-4)]。 在此，以用上述检查芯片20、通过检测装置1检测受测物为例进行说明。
在方法2-1中，首先，用户让受测物S与捕捉受测物S的固相220接触[步骤S3_l， 参照图22a]。通过此步骤，可以让固相220捕捉到受测物S[参照图22b]。
固相220由固定了捕捉物221的固相主体230构成，其中所述捕捉物221用于捕捉受测物S。捕捉物221可以是与方法1-1中所使用的捕捉物210相同的物质。用于固相 220的捕捉物221和后述捕捉步骤(步骤S34)中使用的捕捉物是不同种类的物质，或者是受测物中的识别部位互不相同的物质。
受测物S和固相220的接触可以在容器内进行。可以在受测物S与捕捉物221结17合的条件下进行受测物S和固相220的接触。上述条件可以根据受测物S和捕捉物221的种类适当选择。
然后，用户在捕捉了受测物S的固相220上附加标记结合物(检测物201)[步骤 S3-2]。以此获得含有标记结合物(检测物201)与受测物S的复合物的固相231 [参照图 22c]。
可以在受测物S与标记结合物(检测物201)结合的条件下使标记结合物(检测物201)附加到固相220。上述条件可以根据受测物S和标记结合物(检测物201)的种类适当选择。
接着，用户提取含有标记结合物(检测物201)与受测物S的复合物的固相231 [步马聚S3-3]ο
在步骤S3-3中，固相231的提取方法可以根据固相主体222的种类等适当选择。 比如，当固相主体222为磁珠时，可以用磁块吸附固相231。此时，可以用磁块轻松地提取固相231。当固相主体222为基板时，可以将基板上的溶液换成新溶液，以此除去受测物S以外的成分。此时，可以通过置换溶液轻松地提取固相231。
接下来，用户从固相231上分离出与受测物的量相应的标记结合物(检测物201) [步骤S3-4，参照图22d]。
在在步骤S3-4中，用户使用与步骤S3-2中所用标记结合物(检测物201)的种类相应的分离方法，分离出与受测物的量相应的标记结合物(检测物201)。比如，当受测物S 为核酸，且使用的标记结合物(检测物)含有核酸、该核酸具有与受测物S互补的序列时， 加热含有固相主体222上的复合物的溶液，即可轻松地从固相231分离出与受测物的量相应的标记结合物(检测物201)。当标记结合物(检测物201)与受测物S的复合物含有可切断的核酸时，用限制性内切酶切断上述可切断的核酸中的识别序列，就可获得与受测物的量相应的标记结合物(检测物201)或其中的一部分。
其后，用户从检查芯片20的试样注入口 30b注入在步骤S3-4中分离出的标记结合物(检测物201)。再将检查芯片20插入检测装置1的芯片接受部件11。用户启动检测装置1。捕捉步骤(步骤S34)、激励光照射步骤(步骤S3-6)、激励光反射步骤(步骤 S3-7)和电流测量步骤(步骤S3-8)可以以与下述步骤同样的方法进行1-1中的检测物捕捉步骤(步骤S1-1)、激励光照射步骤(步骤S1-2)、激励光反射步骤(步骤S1-3)和电流测量步骤(步骤S1-4)。在方法2-1中，提取步骤之后也可以进行标记结合物附加步骤。步骤S3-1 步骤S3-4也可以全部在检查芯片20内进行。
另一方面，方法2-2是与方法1-2相对应的方法。方法2-2与方法1_2的不同之处在于其包含以下步骤
-用捕捉受测物的固相捕捉此受测物[图23中受测物捕捉步骤(步骤S4-1)]；
-在受测物上附加标记结合物，其中，所述标记结合物是用标记物标记用于捕捉此受测物的结合物而形成的[图23中标记结合物附加步骤(步骤S4-2)]；
-提取含有受测物的固相[图23中提取步骤(步骤S4-3)]；及
-根据受测物的量，从固相中至少分离出标记物[图23中分离步骤(步骤S4-4)]。 可以用与方法2-1中的步骤S3-1 步骤S3-4同样的方法进行这些步骤S4-1 步骤S4-4。
诱导步骤(步骤S4-5)、激励光照射步骤(步骤S4-6)、激励光反射步骤(步骤S4-7)和电流测量步骤(步骤S4-8)可以用与下述步骤同样的方法进行方法1-2中的检测物诱导步骤(步骤S2-1)、激励光照射步骤(步骤S2-2)、激励光反射步骤(步骤S2-3)和电流测量步骤(步骤S2-4)。在方法2-2中，也可以在提取步骤之后进行标记结合物附加步马聚ο
本发明的受测物的检测方法利用具有透光性的工作电极主体和反电极，通过光电化学方法，检测在光电化学方面具有活性的受测物，它还包括具有以下步骤的受测物检测方法(称为“方法3”)
(3-1)让工作电极主体上存在有受测物；
(3-2)向工作电极主体上的受测物照射激励光；
(3-3)将透过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的受测物；及
(3-4)测量工作电极主体和反电极之间的电流。
根据步骤(3-1)的实施方法的不同，方法3大致可分为以下方法3-1和方法3-2。 方法3-1中使用了用于捕捉受测物的捕捉物(参照图24)。方法3-2是将受测物诱导到工作电极主体的方法(参照图25)。
此方法3-1和方法3-2可以在受测物是具有光电化学活性的物质时进行。受测物本身会在光激励下产生电流。因此，不同于方法2-1和方法2-2，方法3-1和方法3-2中也可以不在受测物上附加标记结合物。因此，只要用受测物取代方法1-1和方法1-2中的检测物，即可用同样方法实施方法3-1和方法3-2。S卩，在方法3-1的步骤S5-1 步骤S5-4 中，除用受测物取代方法1-1中的检测物外，均可采用与方法1-1的步骤Sl-I 步骤S1-4 同样的操作。在方法3-2的步骤S6-1 步骤S6-4中，除用受测物取代方法1-2中的检测物外，均可采用与方法1-2的步骤S2-1 步骤S2-4同样的操作。
[实施例]
下面通过实施例详细说明本发明，但本发明不受此实施例的限制。
(制造例1)
(1)制作电极和反射部件
运用溅射法，在二氧化硅(玻璃)制成的基板主体141a的表面制作工作电极 161 [参照图^A]，其中所述工作电极161是由涂布有锡的氧化铟材质薄膜(厚度约200nm) 构成的。薄膜兼具导电层和电子容纳层。为了方便，将工作电极161分为第一区161a和第二区161b。再通过溅射法，在与基板主体141a的工作电极161同一表面(以下称“电极面”) 上设置白金薄膜制成的反电极166和白金薄膜制成的参比电极169[参照图^A]。然后，用溅射法在与基板主体141a的电极面相反的一面上设置白金薄膜制成的反射层181 [参照图 26C]。反射层181位于与工作电极161的第二区161b相应的位置，与工作电极161的第二区161b的大小相同。在工作电极161的第一区161a，有激励光通过[参照图^B]。另一方面，在工作电极161的第二区161b中，通过了工作电极161的激励光被反射层181反射到工作电极161的第二区161b上的检测物上[参照图^C]。
(2)涂覆硅烷偶联剂
将上述(1)中获得的基板主体141a在硅烷偶联剂溶液[含有1体积％ APTES的甲苯溶液]中浸泡一小时。取出基板主体141a，在甲苯中清洗二遍。然后，将基板主体141a 在110°C加热10分钟，使APTES结合到基板主体141a的表面。再将基板主体141a浸在甲苯中，进行5分钟超声波清洗。超声波清洗进行三次。再用脱水乙醇冲洗基板主体141a，使未结合的APTES结合到基板主体141a的表面。用吹风机除去残留的乙醇。
(3)固定捕捉物质
以1 9(体积比)的比例混合含有捕捉物，即含有捕获DNA探针的水溶液[100 μ M DNA]和UV交联试剂[通用电气医疗集团英国公司制(GE Healthcare UK Limited)，商品名微阵列交联试剂D (Microarray crosslinking reagent D)]，获得10 μ M探针溶液。将获得的探针溶液中的6μ L滴到工作电极的第一、二区161a、161b的表面上。再用UV照射装置[商品名UV交联系统]向工作电极的第一、二区161a、161b照射160mJ/cm2的紫外线。以此将捕获DNA探针固定在工作电极的第一、二区161a、161b的表面上。用超纯水冲洗工作电极的第一、二区161a、161b的表面。再用吹风机去除残留在工作电极的第一、二区 161a、161b表面的超纯水。
(4)去除未固定的DNA探针
仅进行上述(3)的操作的话，有可能工作电极的第一、二区161a、161b表面上还残留有未固定的捕获DNA探针。因此，进行以下步骤来除去未固定的捕获DNA探针。
先在基板主体141a周围配置硅胶(厚度0. Imm)作为隔板。在用硅胶围起来的空间内注入6μ L杂交用溶液。杂交用溶液是超纯水和杂交缓冲剂[美国昂飞公司 (Affymetrix, Inc.)制，商品名 杂交缓冲剂(2xHybridization buffer)]按 1 1(体积比)的比例混合而成。再在硅胶上盖上玻璃罩，以免溶液蒸发。然后，将基板主体141a在 45°C中静置1小时。再用清洗用缓冲剂[美国昂飞公司制，商品名洗涤剂A(Wash buffer A)]和超纯水清洗基板主体141a。用吹风机除去残留在基板主体141a表面上的超纯水。
(制造例2)
将乙腈(AN)和碳酸乙烯酯(EC)按2 3[AN EC(体积比)]混合。在所获混合液中溶解充当电解质盐的四丙基碘化铵，直至浓度变为0. 6M。然后在所得溶液中溶解充当电解质的碘直至浓度变为0.06M。以此获得电解液。
(试验例1)
(1)捕捉检测物
在制造例1中获得的电极基板141的工作电极的第一、二区161a、161b的周围配置硅胶(厚度0. 2mm)作为隔板。然后，在此电极基板141上装上杂交盒。通过硅胶。向杂交盒和电极基板141围成的空间中注入20 μ L杂交溶液。杂交溶液是向杂交缓冲剂[美国昂飞公司制，商品名 杂交缓冲剂((2x Hybridization buffer))]中添加用标记物Alexa Fluor750标记的靶DNA (检测物)，并使浓度达到OnM或InM而得到的。用盖子盖住杂交盒注入口，以免溶液蒸发。杂交是将杂交盒在45°C中静置1小时进行。然后，用清洗用缓冲剂 [美国昂飞公司制，商品名洗涤剂A(Wash buffer A)]和超纯水清洗电极基板141。用吹风机除去残留在电极基板141表面的超纯水。
(2)测量光电流
将间隔固定件、即硅胶(厚度0. 2mm)围在实施了上述(1)后的电极基板141的工作电极的第一、二区161a、161b的周围。在硅胶围成的空间中注入12. 5μ L制造例2中获得的电解液。以此使工作电极、反电极和参比电极接触上述电解液。
用玻璃盖从电极基板141上面盖住上述空间，将其密封起来。以此防止电解液漏出或蒸发。以参比电极为标准，向工作电极的第一、二区161a、161b施加OV电压。与此同时，向工作电极的第一、二区161a、161b的一定位置(图沈中，光照位1 4)照射激励光 [波长约781nm、激励光强度约13mW的激光]。让激光按一定周期(IHz)开关(开/关)， 测定工作电极的第一区161a或工作电极的第二区161b与反电极之间的光电流。在试验例 1，调查了所用电极的种类(透过型和反射型)与光电流之间的关系，其结果见图27。在图 27中，“透过型”指工作电极的第一区161a。“反射型”指工作电极的第二区161b。
从图27所示结果可以看出，当检测物的浓度为InM时，与实验号为1和2(透过型)的光电流相比，实验号为3和4(反射型)的光电流分别显著增强。当检测物的浓度为 OnM时，实验号为3和4(反射型)的光电流分别等于实验号为1和2号(透过型)的光电流。从此结果可以知道，向工作电极上的检测物反射透过了工作电极的光，可以明显增强光电流。
(试验例2)
在试验例2，除向工作电极161的第一区161a照射强度为5. 67mW或10. 9Imff的激光以及向工作电极161的第二区161b照射激励光强度为5. 67mW的激励光(激光)外，进行了与试验例1同样的操作，测量光电流。算出S/N比。S/N比是根据以下公式(1)算出的。
[数1]
(检测物浓度InM时的光电流)-(检测物浓度OnM时的光屯流)(检测物浓度OnM时的光电流)(1)
在试验例2，调查了所用电极的种类和激励光强度与光电流之间的关系，其结果见图洲々。实验号9是向工作电极的第一区161a(透过型)照射激励光强度为5. 67mW的激励光(激光)时的光电流的测定结果。实验号10是向工作电极的第一区161a(透过型) 照射激励光强度为10. 91mW的激励光(激光)时的光电流的测定结果。实验号11是向工作电极的第二区161b(反射型)照射激励光强度为5. 67mff的激励光(激光)时的光电流的测定结果。另外，图中“杂波”是指检测物浓度OnM时的光电流(即非起因于检测物的杂波)。“信号”是指检测物浓度为InM时的光电流(即起因于检测物的信号)。
从图28A所示结果可以看出，实验号10中的“信号”的光电流约是实验号9中的 “信号”的光电流的2倍。从图28A所示结果可以得知，实验号10中的“杂波”的光电流约是实验号9中的“杂波”的光电流的2倍。从这些结果可以知道，增强激励光的强度时，会增强检测物产生的信号，但与此同时，不是由检测物产生的杂波也会增加。
另一方面，从图28A所示结果可以看出，实验号11中的“信号”的光电流大约为实验号9的“信号”的光电流的2. 6倍。从图28A所示结果可以看出，实验号11中的“杂波” 的光电流与实验号9中的“杂波”的光电流相等。从这些结果可以知道，当使用有反射部件的工作电极时，可以使检测物产生的信号增强，同时可以在很大程度上控制不是由检测物产生的杂波。
根据图28A所示结果，算出S/N比。在试验例2中，调查了所使用的电极种类和激励光强度与S/N比的关系，其结果见图^B。
从图28B所示结果可以看出，实验号为11的S/N比大于实验号为9的S/N比。但是，实验号为10的S/N比小于实验号为9的S/N比。因此，从这些结果可以知道，当使用具有反射部件的工作电极时，检测灵敏度有所提高。
(试验例3)
除通过蒸镀法制成由金薄膜(膜厚50. 9nm)构成的反射层181这一点外，以与制造例1同样的方法制成了电极和反射部件。然后，用与制造例1同样的方法进行硅烷偶联剂的涂覆、捕捉物的固定及未固定DNA探针的去除，获得电极基板141 (参照图2躺。
使用此电极基板141 ；除此之外，将标记物Alexa four750标记的靶DNA(检测物)添加到杂交缓冲剂[美国昂飞公司制，商品名 杂交缓冲剂Ox Hybridization buffer)]中，并使其浓度达到OnM或ΙΟηΜ，将如此制作的溶液作为杂交溶液。除上述两点外，采用与试验例1同样的方法进行检测物的捕捉和光电流的测量。所得结果见图四。
从图四所示结果可以看出，当检测物浓度为IOnM时，与实验号12和13 (透过型) 的光电流相比，实验号14和15(反射型)各自的光电流分别有明显增加。当检测物浓度为OnM时，实验号18和19(反射型)的光电流分别与实验号16和17(透过型)的光电流相同。由此结果可知，将电极制作成反射型，向工作电极上的检测物反射透过了工作电极的光，可以仅增大来源于色素的光电流。
(试验例4)
将铝箔粘在基板背面，以此形成由铝制成的反射层181，除这一点外，其余均采用与制造例1同样的方法制作电极和反射部件。在试验例4中，不进行制造例1中的涂覆硅烷偶联剂的操作、固定捕捉物的操作及去除未固定DNA探针的操作，取而代之，用UV/03(UV-1 型，Samco (莎姆克株式会社))清洗电极表面10分钟，以此获得电极基板141 (参照图30A)。
用硅胶(厚度0.2mm)充当间隔固定件，并围在所得的电极基板141的工作电极的第一、二区161a、161b的周围。向硅胶围成的空间中注入12. 5 μ L的溶液，该溶液是如下制成的在制造例2获得的电解液中加入标记物Alexa Flour750标记的靶DNA (检测物)，直至其浓度达到OnM或ΙΟηΜ。以此使工作电极、反电极和参比电极接触同一电解液。用玻璃盖从电极基板141的上面盖住上述空间，将其密封起来。以此防止在测量光电流的过程中电解液漏出或干燥。
然后以与试验例1同样的方法测定光电流。所得结果见图31。从图31所示结果可以看出，当检测物的浓度为InM时，与实验号20和21 (透过型)的光电流相比，实验号22 和23(反射型)的光电流分别明显增大。当检测物的浓度为OnM时，实验号沈和27 (反射型)的光电流分别与实验号M和25 (透过型)的光电流相同。由此结果可知，将电极制作成反射型，向工作电极上的检测物反射透过了工作电极的光，可以仅增大来源于色素的光电流。
权利要求
1.一种检测装置，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该装置包括 工作电极主体，能够容纳所述检测物产生的电子，并具有透光性；反电极；光源，向所述工作电极主体上的检测物照射激励光；及反射部件，用于将所述光源照射出的、并且通过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
2.根据权利要求1所述的检测装置，其特征在于所述反射部件选自由白金、铝、金、银和铜所组成的群中的至少一种构成。
3.根据权利要求1所述的检测装置，其特征在于 所述工作电极主体由导电层和电子容纳层构成。
4.根据权利要求1所述的检测装置，其特征在于所述光源配置在用于容纳所述工作电极主体上的检测物的电子的电子容纳面一侧， 所述反射部件设置在与所述电子容纳面相反的一面。
5.根据权利要求4所述的检测装置，其特征在于 所述反射部件设置在远离所述工作电极主体的位置。
6.根据权利要求4所述的检测装置，其特征在于所述反射部件通过具有透光性的绝缘层与所述工作电极主体成为一体。
7.根据权利要求6所述的检测装置，其特征在于与所述工作电极主体上的所述电子容纳面相反一侧的表面有具有透光性的绝缘层。
8.根据权利要求6所述的检测装置，其特征在于所述绝缘层是用于保持工作电极主体的形态的基板主体。
9.根据权利要求4所述的检测装置，其特征在于所述反射部件设置在用于保持工作电极主体的形态的基板主体上。
10.根据权利要求1所述的检测装置，其特征在于所述光源配置在用于容纳所述工作电极主体上的检测物的电子的电子容纳面的相反一侧，所述反射部件设在所述电子容纳面一侧中远离所述工作电极主体的位置。
11.根据权利要求10所述的检测装置，其特征在于在与所述工作电极主体上的所述电子容纳面相反一侧的表面上设有具有透光性的绝缘层。
12.一种电极基板，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该基板包括 基板主体；工作电极主体，位于所述基板主体上、能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主体上、能够将光源照射出的、透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
13.根据权利要求12所述的电极基板，其特征在于 所述基板主体上有反电极。
14.一种工作电极，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物的，该电极包括工作电极主体，位于所述基板主体上、能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；及反射部件，位于所述基板主体上，将光源照射出的、透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上。
15.一种检查芯片，用光电化学法检测因光激励而产生电子的检测物，该芯片包括 电极基板，由基板主体、工作电极主体、以及反射部件构成，其中所述工作电极主体位于所述基板主体上，能够容纳所述检测物产生的电子，且具有透光性；所述反射部件位于所述基板主体上，将光源照射出的、且透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上；及反电极。
16.一种检测物的检测方法，用具有透光性的工作电极主体和反电极，对因光激励而产生电子的检测物进行光电化学检测，该方法包括使所述工作电极主体上存在有检测物； 向所述工作电极主体上的检测物照射激励光；将透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的检测物上；及测定所述工作电极主体与反电极之间的电流。
17.一种受测物的检测方法，用具有透光性的工作电极主体和反电极对受测物进行光电化学检测，该方法包括使受测物与标记结合物接触，形成受测物与标记结合物的复合物，其中所述标记结合物是用标记物标记用于捕捉此受测物的结合物而形成的； 使所述工作电极主体上至少存在有标记物； 向所述工作电极主体上的标记物照射激励光；将透过了所述工作电极主体的激励光反射到所述工作电极主体上的标记物上；及测定所述工作电极主体与反电极之间的电流。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种能够灵敏地检测出检测物和受测物的检测物的检测装置、电极基板、工作电极、检查芯片、检测物的检测方法以及受测物的检测方法；为达到上述目的，在工作电极上设置反射部件(反射层)，该反射部件将光源照射出的、且透过了工作电极主体的激励光反射到工作电极主体上的检测物上。
文档编号G01N27/327GK102539741SQ20111033315
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月28日 优先权日2010年10月29日
发明者堀信康, 桐村浩哉 申请人:希森美康株式会社
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