专利名称：检测方法和在所述检测方法中使用的含有磁性材料的介电粒子的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测样品中检测目标物质的检测方法。本发明还涉及在所述检测 方法中使用的包封磁体的介电粒子。
背景技术：
检测方法例如双抗夹心法和竞争法是生物测量领域所公知的。在双抗夹心法中， 与抗原(其是包含在样品中的检测目标物质)特异性结合的第一抗体被固定在基质表面 上。将样品施加在基质上，以使检测目标物质与第一抗体特异性结合。然后，将与抗原特异 性结合且具有连接其上的荧光标记的第二抗体与抗原结合，由此形成由第一抗体、抗原和 第二抗体构成的所谓夹心结构。之后，检测连接在第二抗体上的荧光标记发射的荧光。其中通过衰减光(evanescent light)激发荧光标记的衰减荧光检测法被提出作 为检测由荧光标记发射的荧光的方法。在衰减荧光检测法中，使激发光束从基质的后表面 进入并在基质的前表面被完全反射。荧光标记被漏出到基质前表面的衰减光激发。之后， 检测由荧光标记发射的荧光。同样的，日本未审专利公开文本No. 10(1998)-307141和“Surface Plasmon Fluorescence Measurements of Human Chorionic Gonadotrophin :Role of Antibody Orientation in Obtaining Enhanced Sensitivity and Limit of Detection", M. L. M. Vareiro et al. ,Analytical Chemistry，Vol. 77，No. 3，pp. 2426-2431，2005 提出了 利用等离子体共振的电场增强效应来改善衰减荧光检测法的灵敏性的方法。在这个表面等 离子体增强荧光法中，在基质上提供了金属层，使激发光以大于或等于总反射角的入射角 进入基质和金属层之间的界面。由激发光在金属层产生表面等离子体，通过表面等离子体 的电场增强效应放大荧光信号，以改善S/N比。此夕卜，"High—sensitivity sensing of catechol amines using by optical waveguide mode enhanced fluorescence spectroscopy，，，K. Tsuboi et al. , Abstracts of the Spring 2007Conference of the Academy of Applied Physics, No. 3, pp.1378, 28p-SA-4中提出了利用光波导模(optical waveguide mode)的电场增强效应来增强传感 器部分的电场的方法，其与表面等离子体增强荧光法类似。在光波导模增强荧光光谱法中， 在传感器部分依次提供金属层和由电介质或类似物构成的光波导层。在光波导层产生光波 导模，通过它的电场增强效应放大荧光信号。此外，美国专利申请公开文本No. 20050053974 and "Surface-plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy", Τ. Liebermann and W. Knoll, Colloids and Surfaces A, Vol. 171，pp. 115-130，2000 提出了用于检测发射光(radiant light)的 方法(SPCE 表面等离子体耦合发射)，所述发射光是通过由荧光标记产生的荧光在金属层 诱导的表面等离子体产生的，而不是如前述的荧光法中检测由荧光标记发射并由表面等离 子体放大的荧光。
如上所述，在生物测量领域提出了多种用于检测由荧光标记所标记的检测目标物 质的方法。同样地，在与固定在基质上的第一抗体形成夹心之后检测荧光的情况下，则需要 分离夹心结合体和与检测目标物质未进行结合反应的第二抗体。因此，洗去这种未反应的 第二抗体的清洗操作对于实施测量是必需的。不仅清洗操作是麻烦的，它们还是增加测量 所需时间的一个因素。此外，在一些情况下一部分检测目标物质会在清洗操作期间随上清 液一起被丢弃掉。因此，如果在样品中检测目标物质是微量成分，检测灵敏度有可能会降 低。此外，检测目标物质和第一抗体之间的反应是第一抗体所结合的固体相表面与含有检 测目标物质的溶液(液体相)之间的反应。因此，反应效率较差，这是阻碍快速测量的另一 因素。在这方面，日本未审专利公开文本No. 2005-077338提出了实现高速测量的方法， 该方法不需要清洗操作，能够定量检测目标物质，并进一步解决了固体相和液体相之间延 迟反应的问题。特别地，在这个方法中，第一抗体由磁性粒子标记，第二抗体由荧光色素标 记，不需要将第一抗体固定在基质上即可在液体相中形成第一抗体、检测目标物质、和第二 抗体的结合体。通过磁体将结合体定位以将它们与未反应的第二抗体分离，用衰减光照射 定位的结合体以测量荧光信号，而无需清洗操作。从日本未审专利公开文本No. 2005-077338的W030]段的描述注意到从在液体 样品中的分散特性的角度，即为了预防粒子相互聚集，磁性粒子的粒径优选100nm(0. Ιμπι) 或更小。同样地，日本未审专利公开文本No. 5(1993)-264547提出了采用磁性粒子的传感 方法。一个实施例描述了粒径为IOOnm或更小的细粒子被用作磁性粒子。然而，在我们进行的实验中，使用粒径为IOOnm或更小的磁性粒子不能重复进行 快速定位(浓缩)结合体。即，在几分钟内不能实现浓缩，而这是实际应用所要求的水平。同样地，日本未审专利公开文本No. 1(1989)-272970公开了采用粒径为几十纳米 的磁性粒子的方法。在该方法中，通过在对磁体的反应上的差异，即通过浓缩速度上的差 异，将单个磁性粒子和磁性粒子与检测目标物质的结合体分离，以测量来自的结合体的信 号。采用通过磁性粒子定位的检测方法是极具吸引力的生物测量方法，因为它们能在 液体相中反应且避免了分离物质结合体和未反应的第二抗体的清洗操作。但是，这些方法 仅限于概念层面，仍未进行实际应用。通过对这些方法为何不实用的原因的研究，发明人揭示了当实际上使用磁性粒子 定位结合体时所面临的以下问题。1)取决于磁性粒子的储存条件，磁性粒子有可能在用于检测之前就磁化和聚集， 这会导致使用期间分散特性的劣化。2)如果磁性粒子包含金属材料，，当磁性粒子在光敏标记附近时有可能发生金属 淬灭，这是一种光学信号被金属吸收的现象。这会导致被检测光学信号量降低，从而导致信 号定量特性的劣化(波动)。
发明内容
鉴于现有的技术情况开发了本发明。本发明的目标是提供通过磁性粒子定位结合 体的检测方法，其解决了前述问题并适宜于实际应用。本发明的检测方法包括以下步骤制备赋予了磁性的结合物质，它是与检测目标物质特异性结合的第一结合物质， 其上连接有包封磁体的介电粒子，所述介电粒子具有包封于其中的磁性粒子并且其表面被 在液体样品中表现极性的官能团修饰；制备标记结合物质，它是与检测目标物质特异性结合的第二结合物质和与检测目 标物质竞争地与第一结合物质特异性结合的第三结合物质中的一种，其上连接有光敏标记；将作为检查目标的液体样品、所述赋予了磁性的结合物质、和所述标记结合物质 混合，以进行结合反应；在含有所述液体样品的样品池(其中混合有赋予了磁性的结合物质和标记结合 物质)内产生磁�。允垢秤枇舜判缘慕岷衔镏室贫裂烦啬诘木植壳颍辉诟秤枇舜判缘慕岷衔镏室贫了鼍植壳虻那榭鱿拢鲈诎鼍植壳� 的预定区域上照射激发光，以引发由存在于所述预定区域内的光敏标记产生的光学信号；检测所述光学信号；和基于测得的光学信号的量，确定液体样品中检测目标物质的量。修饰包封磁体的介电粒子的表面的官能团的例子包括碱性官能团例如氨基和季 铵基团，和使粒子带负电荷的酸性官能团例如羧基，磺酸基，和磷酸基。此处，如果是按照双抗夹心法进行检测，优选赋予了磁性的结合物质、检测目标物 质、和标记结合物质的结合体(夹心结合体)的最大长度大于或等于200nm，其中所述标记 结合物质是其上连接有光敏标记的第二结合物质。如果是按照竞争方法进行检测，优选赋 予了磁性的结合物质和标记结合物质的结合体(竞争性结合体)的最大长度大于或等于 200nm，其中所述标记结合物质是其上连接有光敏标记的第三结合物质。此处，最大长度是 指结合体的长直径，是基于相互连接形成结合体的多个组成部分的总长度。优选包封磁体的介电粒子的粒径为100nm-1 μ m,更优选150nm-l μ m。优选树脂、SiO2粒子等作为电介质。单个磁性粒子或多个磁性粒子可被包封在每个介电粒子内。可使用任何磁性材料 只要它能够被磁体等产生的磁场吸引至局部区域。优选铁系磁性材料或钼系磁性材料作为 磁性粒子的材料。如果采用铁系磁性材料或钼系磁性材料作为磁性粒子，希望采用红外线 作为激发光。光敏标记可以是在受激发光照射时发射荧光作为光学信号的那些。可选地，光敏 标记可以是在受激发光照射时产生散射光的那些。进一步可选地，光敏标记可以是在受激 发光照射时产生局部等离子体作为光学信号的那些。光敏标记的具体实例包括荧光色素分 子，具有被包封在电介质材料内的荧光色素分子的细荧光粒子，和细金属粒子。当被激发光 照射时，细金属粒子产生散射光并在其表面产生局部等离子体。在这种情况下，散射光可作 为光学信号检测，或由局部等离子体引发的发射光可作为光学信号检测。一部分壁具有与液体样品接触的样品接触表面的样品池可用作样品池，所述一部 分壁由透明电介质板构成。在这种情况下，所述样品接触表面的附近作为所述的局部区域，在全反射的条件下从由电介质板构成的壁的外部，将光照射在电介质板的样品接触表面 上，使得在所述样品接触表面产生衰减光，而所述衰减光可作为激发光。在电介质板的样品接触表面上形成金属膜的样品池可用作样品池。此外，在金属 膜上还提供有光波导层的样品池可作为样品池。可直接检测或间接检测光学信号。如果采用装配有其上形成金属膜的电介质板的样品池，检测由于受光学信号激发 在金属膜上的表面等离子体所发射的发射光是用于间接检测受激发光照射由光敏标记产 生的光学信号的优选方法。如果采用装配有其上形成光波导层的金属膜的样品池，检测由 于受光学信号激发光波导层的光波导模所发射的发射光是用于间接检测受激发光照射由 光敏标记产生的光学信号的优选方法。如果光敏标记是产生荧光的那些，荧光激发金属层的表面等离子体，或光波导层 的光波导模。在另一方面，如果光敏标记是细金属粒子，通过激发光在细金属粒子表面产生 的局部等离子体可作为激发金属层的表面等离子体或光波导层的光波导模的光学信号。本发明的包封磁体的介电粒子包括包封其中的磁性粒子；和在液体样品内显示出极性的、用于表面修饰的官能团。优选所述官能团是羧基。此外，优选磁性粒子是由铁系磁性材料或钼系磁性材料 形成的。本发明的检测方法采用具有被包封在电介质内的磁性粒子的包封磁体的介电粒 子，其表面被在液体样品中表现极性的官能团修饰。因此，即使介电粒子内的磁性粒子被磁 化且介电粒子在储存期间聚集，其表面的官能团的极性会使它们在液体样品中相互排斥， 以改善其分散特性。此外，因为磁性粒子被包封在电介质内，磁性粒子和光敏标记在一定程 度上被分离。因此，在由金属材料形成磁性粒子的情况下可以抑制金属淬灭，以抑制信号强 度的降低和信号量的波动。此外，与修饰磁性粒子表面的情况相比，有机物质更易于作为介 电粒子的表面修饰。因此，可以很容易地提供官能团作为表面修饰以及将介电粒子连接至 第一结合物质，而不用考虑磁性粒子的材料。如果按照双抗夹心法进行检测，夹心结合体的最大长度可以是200nm或更大。如 果按照竞争方法进行检测，竞争性结合体的最大长度可以是200nm或更大。在这些情况中， 聚集特性得到了改善，并且测量所需要的时间可缩短至实用水平(几分钟)。此外，包封磁体的介电粒子的粒径可以是1OOnm或更大。在这种情况下，结合体的 大小可以很容易地变成200nm或更大，由此聚集特性得到了改善，测量所需要的时间可缩 短至实用水平(几分钟)。如“背景技术”部分所描述的，在本发明人所进行的实验中，存在以下问题，布朗 运动所带来的扰动导致了慢的浓缩速度，这造成在聚集量足以进行测量之前经过了太长时 间。另一方面，如日本未审专利公开文本No. 2005-077338所描述的，磁性粒子的粒径优选 是IOOnm或更�。绻Ｗ恿＞冻齀OOnm会出现分散特性劣化的问题。S卩，极难实现磁性 粒子的分散和聚集(获得的磁力克服布朗运动)。在这方面，本发明采用在其表面具有在 液体样品内表现极性的官能团的包封磁体的介电粒子。由此，保证了在液体样品内的分散 特性，同时通过将结合体的最大长度设定在200nm或更大且包封磁体的介电粒子的粒径为1OOnm-1μ m，聚集特性得到了改善。即，通过实现分散特性和聚集特性，本发明改善了实际 应用的适应性。
图1是说明包封磁体的介电粒子的结构的示意图。图2是解释磁浓缩指数(magnetic concentration index)的测量方法的图。图3是说明磁浓缩指数对粒径的依赖特性的图。图4A是说明在磁浓缩之前包封磁体的介电粒子的分散状态的暗视野显微镜图。图4B是说明在磁浓缩期间包封磁体的介电粒子的分散状态的暗视野显微镜图。图4C是说明在磁浓缩之后包封磁体的介电粒子的再分散状态的暗视野显微镜 图。图5A是说明在磁浓缩之前磁性粒子的分散状态的暗视野显微镜图(对照实施 例)。图5B是说明在磁浓缩期间磁性粒子的分散状态的暗视野显微镜图(对照实施 例)。图5C是说明在磁浓缩之后磁性粒子的再分散状态的暗视野显微镜图(对照实施 例)。图6是说明用于执行本发明第一实施方式所述的检测方法的检测装置的结构示 意图。图7A是说明本发明第一实施方式所述的检测方法的步骤图(施加磁场之前)。图7B是说明本发明第一实施方式所述的检测方法的步骤图(施加磁场之后)。图8是说明用于执行本发明第二实施方式所述的检测方法的检测装置的结构示 意图。图9是说明用于执行本发明第三实施方式所述的检测方法的检测装置的结构示 意图。
具体实施例方式下文，将参照附图描述本发明的实施方式。请注意为了方便描述，附图中所示组成 部件的尺寸不同于实际尺寸。[包封磁体的介电粒子]首先，描述在本发明检测方法中所用的包封磁体的介电粒子P。如图IA和图IB所 示的，包封磁体的介电粒子P具有一个或多个包封在其中的磁性粒子M，以及用于表面修饰 的在液体样品内表现极性的官能团。磁性粒子M的形状没有特定限制，可能的形状的实例包括球形和棒形。但是，优选 其粒径为IOOnm或更�。绻诎獯盘宓慕榈缌Ｗ覲中包封了多个磁性粒子M，优选其粒 径为15nm-40nm。磁性粒子M的材料没有特定限制，磁性粒子M的材料的实例包括四氧化 三铁；三氧化二铁；多种铁氧体(ferrite)；金属例如铁，锰，镍，钴，铬，和钼；和前述金属的 合金。铁系磁性材料例如氧化铁和钼系磁性材料例如含有钼的合金是特别优选的。电介质材料的实例包括树脂材料和Si02。树脂材料的实例包括聚苯乙烯；聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；和乳胶，其中桥连材料(形成聚合物链之间的桥键的试剂，例如二乙 烯基苯和1，4_ 丁二烯)一起聚合。在图1所示的实施例中，官能团是羧基，其是带有负电荷的酸性官能团。但是，可 采用任何官能团，只要它们在液体样品中表现极性。其他官能团的实例包括碱性官能团例 如氨基和季铵基团，和酸性官能团例如磺酸基和磷酸基。包封磁体的介电粒子P的形状没有特定限制，可能的形状的实例包括球形和棒 形。此外，优选包封磁体的介电粒子的粒径为IOOnm-I μ m,更优选150nm-l μ m。此处请注 意，粒径是指粒子的最大尺寸。通过进行以下实验得出包封磁体的介电粒子P的优选粒径。如图2所示的，在实 验中，包封磁体的介电粒子P被分散在溶液5中。然后，将磁体7放置在样品容器6的底面 之下，以实施磁分离步骤(聚集)。在磁分离步骤之前和之后通过移液管8抽吸样品溶液5 的上清液。用波长为500nm的光测量所抽吸上清液的光吸收程度(透明程度)。在放置磁体后一分钟测量光吸收程度A，放置磁体之前测量样品溶液的光吸收程 度B，作为磁分离步骤之后和之前的光吸收程度。由测量值通过公式100 · (B-A)/B (% )计 算磁浓缩指数。聚集能力(磁浓缩指数)对包封磁体的介电粒子P的粒径依赖特性如图3 所示。在图3中，纵轴表示磁浓缩指数，并表明随着数值增加聚集能力越高(即磁浓缩步骤 之后的透明程度更高)。如图3所示的，如果粒径是IOOnm或更�。诖欧掷氩街枰环种雍蠹负醪环⑸� 磁体的介电粒子P的聚集(定位)。在另一方面，随着粒径超过IOOnm浓缩指数逐渐增加。 磁分离步骤一分钟之后，粒径为150nm浓缩指数是约50%，粒径200nm为80%，粒径300nm 基本为100%。即，很明显粒径大于IOOnm会很快发生聚集。基于以上实验结果，可以认为200nm或更大的粒径是在实际可用水平(此处一分 钟)进行定位所必需的。请注意，通过将粒径调整为200nm-l μ m可以实现足以用于实际应 用的浓缩速度。但是，如果粒径过大，会存在降低分散特性的问题。从分散特性的角度，优 选更小粒径。因此，粒径为200nm是最佳的。然而，前述实验仅测量包封磁体的介电粒子P的聚集能力。事实上，聚集的实施是 在形成通过抗原抗体反应形成的夹心结合体或竞争性结合体的状态下进行的。因此，认为 每个夹心结合体或每个竞争性结合体作为整体的粒径(最大长度)是200nm或更大。艮口， 即使包封磁体的介电粒子的粒径小于200nm，只要根据检测方法与标记结合物质的结合体 的粒径为200nm或更大，就可实现足以用于实际应用的浓缩速度。如果TF抗体是检测目标物质，构成夹心结合体的抗体的大小是大约15nm和几纳 米(不超过lOnm)。如果包封磁体的介电粒子的粒径是lOOnm，通过采用大约IOOnm的荧光 微球作为标记结合物质中的标记，结合体可实现200nm或更大的最大长度。如果包封磁体 的介电粒子的粒径是大约160nm，结合体可实现200nm或更大的最大长度，即使采用荧光色 素(大小不超过Inm)例如cy-3和cy-5作为标记结合物质中的标记。下面描述包封磁体的介电粒子的分散特性。图4A至4C是本发明所用的粒径为150nm的包封磁体的介电粒子的各种状态的暗 视野显微镜图，当它们最初分散至溶液中(图4A)，由于施加磁场的磁聚集期间(图4B)，和 停止施加磁场之后(图4C)。
出于对照目的，图5A至5C是与包封磁体的介电粒子的相同粒径的磁性粒子的 各种状态的暗视野显微镜图，当它们最初分散至溶液中(图5A)，由于施加磁场的磁聚 集期间(图5B)，和停止施加磁场之后(图5C)。请注意，通过文献中公开的优选已知 方法修饰包封磁体的介电粒子和磁性粒子的表面。即，通过以下公开的方法用羧基修 饰包封磁体的介电粒子的表面日本未审专利公开文本No. 2007-045982的W003]段； "Preparation and Characterization of Monodisperse magnetic Poly(styrene butyl acrylate methacrylic acid)Microspheres in the Presence of a Polar Solvent", G. Xie et al. , Journal of Applied Polymer Science, Vol. 87, pp.1733-1738,2003 ；禾口 "Synthesizing Particles"of "Manufacture of Polystyrene Standard Particles and Their Applications，，，M. Higata et al. , Aerosol Research, Vol. 22, No. 4, pp. 282-288, 2007的3. 1章，其中“具有羧基的磁性聚合物粒子是通过共聚合不带电单体例如苯乙烯 和具有羧基的单体例如丙烯酸合成的”。通过以下所公开的方法用羧基修饰磁性粒子表 面"Controlling Dispersion Properties，，of “Functionalization of Inorganic Nanoparticles with Organic Molecules，，，A. Narita and Y. Chujo, Papers Regarding Polymer Molecules, Vol. 65，pp.321—333，2008 的 3. 1 章；和"Synthesis of iron oxide nanoparticles under oxidizing environment and their stabilization in aqueous and non-aqueous media，，，D. Maity and D. C. Agrawal, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, Vol. 308，pp.46-55,2007。在图4A至4C和图5A至5C中，亮的(白色)部分是显示粒子的地方。在图5A中，可观察到在最初分散期间磁性粒子之间发生局部聚集，而在最初分散 期间包封磁体的介电粒子均勻分散，仅有很少的聚集。在图4B和图5B中，可观察到当施加磁场时，包封磁体的介电粒子和磁性粒子都聚 集并沿磁场线定位。请注意相对于磁性粒子，包封磁体的介电粒子以更线性方式沿磁场线 定位。在图5C中，观察到磁性粒子是相互聚集的状态。相反地，图4C整体是亮的且难以 区分每个粒子，但可观察到包封磁体的介电粒子没有相互聚集并开始再分散。磁性粒子的分散特性低于包封磁体的介电粒子的分散特性，甚至在通过最佳表面 修饰方法用官能团修饰各自表面的情况下。相信这是由于提供给磁性粒子表面作为表面修 饰的官能团的绝对数量远低于包封磁体的介电粒子的，这造成了磁化引起的吸引力变得强 于官能团极性引起的粒子之间的排斥力。如上所述，与磁性粒子相比，包封磁体的介电粒子具有高得多的分散特性。并认为 即使由于储存条件，在包封磁体的介电粒子内的磁性粒子被磁化并且介电粒子聚集，包封 磁体的介电粒子可在液体样品中分散而不聚集。下文所述的本发明检测方法中采用包封磁体的介电粒子。因此，易于进行表面修 饰，并可获得高分散特性。此外，在检测光学信号期间当光敏标记被激发时，如果光敏标记 在金属材料附近由于能量转移会发生金属淬灭。然而，在包封磁体的介电粒子中，磁性粒子 被包封在电介质内。因此，磁性粒子和光敏标记可从一定程度上分离，并抑制金属淬灭。[检测方法的第一实施方式]本发明第一实施方式所述的检测方法是检测生物样品(尿液，血液，粘液)中是否存在抗原和/或其存在量(浓度)的生物传感方法，其中抗原是检测目标物质，生物样品是 检查的目标。图6是说明用于执行本发明第一实施方式所述的检测方法的检测装置的结构 示意图。图7A和7B是解释本发明第一实施方式所述的检测方法的步骤的图解。第一实施方式的检测方法所用的样品池10具有透明电介质板11作为它的底面， 这是具有样品接触表面的样品池10的接触液体样品S的壁。金属膜12在样品接触表面一 侧的电介质板11上通过气相沉积等形成。请注意，形成金属膜12的区域构成传感器部件 14。优选确定金属层12的厚度使得表面等离子体被强烈激发，同时考虑金属层12a的材料 和激光束LO的波长。例如，如果采用中心波长为780nm的激光束作为激发光束，采用Au膜 作为金属层12，金属层12的优选厚度是50nm士20nm。在这种情况下，更优选金属层12的 厚度是47nm士 10nm。请注意，优选金属层12a是具有Au，Ag，Cu，Al，Pt，Ni，Ti，和它们的合 金中的至少一种作为主要成分的金属。图6所示的检测装置1装配有用于将激发光仅照射在样品池10内的预定区域上 的激发光照射光学系统20 ；设置在样品池10上方的用于检测荧光的光检测器30 ；和用于 施加磁场使样品池10内形成的夹心结合体移动(聚集)至金属膜12附近的局部区域的磁 场施加装置35。激发光照射光学系统20发射激光束LO使得它以满足全反射条件的入射角通过电 介质板11的底面进入电介质板11和金属层12之间的界面，以在金属膜12上产生衰减光 作为激发光。衰减光漏入的区域E是在来自界面的激光束LO的约单波长内。该区域E对 应预定区域。激发光照射光学系统20装配有由半导体激光器(LD)构成的光源21，用于输 出激光束LO ；和棱镜22，其表面之一与电介质板11接触。棱镜22引导激光束LO进入电介 质板11使得激光束LO在电介质板11和金属层12之间的界面上被完全反射。请注意，棱 镜22和电介质板11可整体形成，或通过折射率匹配油(refractive index matching oil) 接触。定位光源21使得激光束LO以大于或等于全反射角的特定角度(可引发表面等离子 体共振)通过棱镜22进入电介质板和金属膜之间的界面。激光束LO可以包含所述特定角 度的扇束发射。而且，如有必要可在光源21和棱镜22之间提供光引导元件。请注意，为了 优选诱发表面等离子体，激光束LO以ρ偏振光进入界面。可以作为光检测器30的光检测器的实例包括(XD’ s, PD' s (光电二极管)，光电 倍增管，和c-MOS’ S。磁场施加装置35可以是电磁体，或永磁体。如果采用电磁体，当要将磁性粒子移 动至局部区域时，将电流流经线圈以产生磁场。如果采用永磁体，当要将磁性粒子移动至局 部区域时，如图6所示，磁体可放置在传感器部件14之下。当停止施加磁场时，磁体被转移 至不再在传感器部件14附近产生磁场的位置。永磁体的实例包括铝镍钴磁体，铁氧体磁 体，MK钢，KS钢，钐钴磁体，和钕磁体。然而，用作永磁体的磁体类型没有特别限制。下面描述根据第一实施方式的检测方法的生物传感方法的步骤。图7A和图7B是 说明施加磁场之前和之后的样品池的示意图。在第一实施方式的检测方法中，首先，制备赋予了磁性的结合物质Bm，它是与检测 目标物质A特异性结合的第一结合物质Bi，其上连接有包封磁体的介电粒子P，该粒子具 有包封在其中的磁性粒子M以及用在液体样品内呈极性的官能团修饰的表面。接下来，制 备标记结合物质B0，其是与检测目标物质A特异性结合的第二结合物质B2，其上连接有光敏标记0。此处，第一结合物质Bl和第二结合物质是与检测目标物质A即抗原的不同部位 (表位)结合的第一抗体和第二抗体。使用作为表面修饰的羧基的胺偶联方法可用于将抗 体固定在包封磁体的介电粒子P上。采用荧光色素分子作为光敏标记0。请注意，本发明的光敏标记0不限于荧光色素 分子并且可以是任何类型的光敏标记，只要它受激发光照射后产生光学信号。这种光敏标 记的实例包括受激发光照射后产生荧光的那些，例如细荧光粒子，其中荧光色素分子被包 封在透明材料内，和量子点；和产生散射光或局部等离子体的那些，例如细金属粒子。接下来，如图7A所示的，将作为检查目标的液体样品S、赋予了磁性的结合物质Bm 和标记结合物质BO混合以引发结合反应。请注意，将赋予了磁性的结合物质Bm和标记结 合物质BO混合到液体样品S中的时间选择没有特别限制。这两者可以同时或先后混合到 液体样品S中。如果液体样品S中存在抗原A，赋予了磁性的结合物质Bm(第一抗体Bi)、 抗原A、和标记结合物质BO (第二抗体Bi)会形成的夹心结合体。之后，在装有液体样品S的样品池10内产生磁�。禾逖稴中混合了赋予了磁 性的结合物质Bm和标记结合物质B0。如图7B所示的，赋予了磁性的结合物质Bm朝金属 膜12表面移动，金属膜12是在样品池10内的局部区域。在赋予了磁性的结合物质Bm移 动至金属膜12的表面的状态下，进行光学信号的检测。当赋予了磁性的结合物质Bm向局部区域移动时，结果与赋予了磁性的结合物质 Bm形成夹心结合体的抗原A和标记结合物质BO也向包含局部区域的预定区域移动。同时， 未反应的标记结合物质BO漂浮在液体样品内而不向预定区域移动。即，在混合的标记结合 物质中，仅与抗原A反应的标记结合物质BO被定位在预定区域内。因此，通过在包含局部区域的预定区域上照射激发光，并引发预定区域内存在的 光敏标记0产生光学信号，可获得来自与抗原进行结合反应的标记的信号。激发光照射光学系统20使激光束LO在全反射条件下进入电介质板11和金属膜 12之间的界面。当激光束LO在界面被完全反射时，衰减光漏出至金属膜12的表面，也产生 表面等离子体。表面等离子体放大衰减光，放大的衰减光激发作为光敏标记0的荧光色素 分子，以产生荧光Lf。即，在第一实施方式中，衰减光是激发作为光敏标记的荧光色素分子 的激发光，而衰减光所漏入的包含金属膜12表面的区域E是预定区域。光检测器30检测荧光Lf。通过表面等离子体共振的电场增强效应也放大了荧光 Lf的强度。因此获得了具有良好的S/N比的信号。检测目标物质的量是由检测到的荧光Lf的量得出。检测目标物质的量(浓度) 可以基于表示荧光检测量和浓度之间关系的标准曲线得出。此处请注意，检测目标物质的 量的得出包括测定是否存在检测目标物质。第一实施方式的检测方法是在液体相中进行结合反应。因此，相对于包括结合固 体相的结合反应，反应速度更快。此外，因为粒子分散特性更优，进一步改善了反应速度。通 过采用包封磁体的介电粒子有效地使夹心结合体移动至传感器部件，易于使与作为检测目 标物质的抗原反应的标记结合物质和未反应的标记结合物质分离。通过采用粒径为IOOnm 或更大的包封磁体的介电粒子形成200nm或更大的夹心结合体，施加磁场期间的浓缩速度 (结合体被定位在局部区域的速度)是适宜于实际应用的水平。而且，当检测光学信号期间 光敏标记被激发时，如果光敏标记在金属材料附近由于能量转移会发生金属淬灭。但是，在包封磁体的介电粒子中，磁性粒子被包封在电介质内。因此，磁性粒子和光敏标记在一定程 度上被分离，会抑制金属淬灭。由此，改善了光学信号的S/N比，并抑制了信号量的波动。请注意在第一实施方式中，通过在电介质板11上提供金属膜12以利用表面等离 子体共振的电场增强效应来改善S/N比。然而，本发明的检测方法可应用于不采用金属膜 12的衰减荧光检测法，和通过采用包封磁体的介电粒子获得前述有利效应。[检测方法的第二实施方式]下面参照图8描述本发明第二实施方式的检测方法和用于执行检测方法的检测 装置2。在以下描述中，与第一实施方式相同的结构元件将以相同的附图标记表示，并省略 了对其的具体描述。检测装置2与第一实施方式装置1的区别在于光检测器30的放置和 由此检测光学信号的方法。在第二实施方式中，光检测器30位于样品池10的传感器部件14的下方，用以检 测来自被荧光(由荧光标记通过激发产生)再次激发的在金属表面的表面等离子体的发射 光Lp，其向与形成金属膜的一侧相对的电介质板11 一侧的方向发射。第二实施方式的检测方法的传感步骤与第一实施方式的相同。第二实施方式与第 一实施方式的区别在于检测发射光Lp作为光学信号被检测而不是直接检测荧光，所述发 射光是由于荧光再次激发在金属膜12表面上的表面等离子体产生的，所述荧光是来自光 敏标记0的光学信号。在第二实施方式中，将液体样品S、赋予了磁性的结合物质Bm、和标记结合物质BO 在样品池10内混合以通过结合反应形成夹心结合体。之后，将磁体35设置于电介质板11 之下以使夹心结合体朝传感器部件14移动。与第一实施方式中的相同，当夹心结合体移动 至传感器部件14时，由激发光照射光学系统20发射激光束L0。由激发光照射光学系统20朝电介质板11和金属膜12之间的界面发射激光束L0， 使得满足全反射的条件。当激光束LO在界面完全反射时，衰减光漏入金属膜12的样品S 上，并产生表面等离子体。表面等离子体放大衰减光，且放大的衰减光激发作为光敏标记0 的荧光色素分子以产生荧光Lf。通过表面等离子体放大荧光Lf，且在金属膜12表面重新 产生表面等离子体。由此，由表面等离子体引发的发射光Lp以特定角度照射在电介质板11 的下侧。通过光检测器30检测发射光Lp以检测与荧光标记结合物质BF结合的检测目标 物质A是否存在和/或其存在量。当荧光Lf与金属层12上的特定波数的表面等离子体偶联时会产生发射光Lp。荧 光Lf的波长决定了与表面等离子体发生偶联的波数。因此，发射光Lp的照射角度由波数 决定。通常，激光束LO的波长和荧光Lf的波长是不同的。因此，由荧光Lf激发的表面等 离子体的波数不同于受激光束LO激发的表面等离子体的波数，因此，发射光Lp的照射角度 不同于激光束LO的入射角。同样在第二实施方式中，采用由包封磁体的介电粒子P和第一结合物质Bl构成的 赋予了磁性的结合物质Bm进行检测，通过施加磁场装置例如磁体使包封磁体的介电粒子P 向传感器部件移动，同时产生荧光。检测由放大荧光产生的发射光。因此，可获得与第一实 施方式相同的有利效果。而且，第二实施方式从传感器背面检测由传感器表面产生的荧光所产生的光。因 此，荧光Lf穿过吸收光的介质的距离可缩短至几十纳米。因此，例如血液的光吸收变得可被忽略，可以不实施通过离心从血液中去除色素成分例如红血球，或使血液通过血液细胞 过滤器以获得血清或血浆的预备步骤而进行测量。[检测方法的第三实施方式]下面参照图9描述本发明第三实施方式的检测方法和用于执行检测方法的检测 装置3。第三实施方式的检测装置3的结构与第一实施方式的装置1相同。但是，第三实施 方式所使用的样品池10’不同于第一和第二实施方式的样品池10，其中传感器部件14还配 置有设置在金属膜12表面上的光波导层13。第三实施方式的检测方法的传感步骤与第一和第二实施方式的相同。第三实施方 式与第一和第二实施方式的区别在于传感器部件14的电场增强原理。在第三实施方式中，由激发光照射光学系统20发射激光束LO使得它在全反射条 件下进入电介质板和金属膜之间的界面。当激光束LO在全反射条件下进入界面时，在传感 器部件14上产生衰减光作为激发光，这与第一和第二实施方式中的方式相同。衰减光激发 光波导层13的光波导模，以放大漏在光波导层13表面上的衰减光。第三实施方式与第一 实施方式的区别在于通过光波导模的激发来放大衰减光。光波导层13的厚度没有特别限制，考虑激光束LO的波长和入射角和光波导层 13的折射率，可以确定厚度使得引发光波导模。例如，如果采用中心波长为780nm的激光 束作为激光束LO且采用单层的二氧化硅膜作为光波导层13，优选光波导层13的厚度为 500nm-600nmo光波导层13可以是包括至少一个由光波导材料构成的内部光波导层的层合 结构，优选该层合结构是交替的层合结构，其中从金属膜一侧按此顺序交替提供内部光波 导层和内部金属层。请注意由荧光色素分子发射的荧光也可通过光波导模的电场增强效应增强。通过 光检测器30检测荧光来检测与标记结合物质BF结合的检测目标物质是否存在和/或其存在量。同样在第二实施方式中，采用由包封磁体的介电粒子P和第一结合物质Bl构成的 赋予了磁性的结合物质Bm进行检测，通过施加磁场装置例如磁体使包封磁体的介电粒子P 向传感器部件移动，同时检测荧光。因此，可获得与第一实施方式相同的有利效果。请注意，装配有光波导层13的样品池10’的结构使得从传感器部件14下面按照 第二实施方式的检测方法检测发射光。在这种情况下，荧光(其是由作为光敏标记的荧光 色素分子发射的光学信号)再次激发光波导层的光波导模，且通过检测伴随光波导模激发 的发射光间接检测光学信号。如以上每个实施方式所述的，本发明的检测方法检测由在预定区域内的受激发的 光敏标记产生的光学信号。可直接检测或间接检测由光敏标记产生的光学信号(以上实施 方式中的荧光)。在以上每个实施方式中，描述了采用非竞争双抗夹心法检测的传感方法。但是，本 发明的检测方法不仅可应用于双抗夹心法，还可应用于采用竞争方法检测的传感方法。如 果按竞争方法进行检测，可采用第三结合物质作为标记结合物质，所述第三结合物质与和 检测目标物质A竞争的第一结合物质(第一抗体)特异性结合。此外，以上所述的每个实施方式采用荧光色素分子作为光敏标记。细金属粒子是 光敏标记的另一优选实例。可用来作为标记的细金属粒子可以是至少的细粒子，其粒径使得受光照射时产生局部等离子体。细金属粒子的形状没有特别限制，可 能形状的实例包括球形和棒形。细金属粒子散射衰减光以产生可作为光学信号被检测的散 射光。可选地，如果采用具有选自金(Au)，银(Ag)，铜(Cu)，铝(Al)，钼(Pt)，镍(Ni)，钛 (Ti)，和它们的合金的至少一种金属作为主要成分的材料作为细金属粒子的材料(或粒子 表面的金属膜的材料)，当受激发光照射时，在细金属粒子表面产生局部等离子体。结构可 以调整，其中局部等离子体作为激发金属膜的表面等离子体或激发光波导层的光波导模的 光学信号，并检测伴随这种激发的发射光。请注意在这种情况下，优选细金属粒子的粒径小 于激发光的波长，以有效激发局部等离子体。 如以上实施方式中描述的产生衰减光的光学系统通常用作仅将光照射到预定区 域的激发光照射光学系统。但是，如果采用当受双光子吸收激发而发射荧光的聚合物作为 光敏标记，需要照射具有极高能量水平的光以引发双光子吸收激发。在这种情况下，可采用 如下激发光照射光学系统其中通过具有高NA的物镜将激光束集中在固定夹心结合体定 位的预定区域，使得激光束充当仅在预定区域内引发双光子吸收激发的激发光。
权利要求
检测方法，其包括以下步骤制备赋予了磁性的结合物质，它是与检测目标物质特异性结合的第一结合物质，其上连接有包封磁体的介电粒子，所述介电粒子具有包封于其中的磁性粒子并且其表面被在液体样品中表现极性的官能团修饰；制备标记结合物质，它是与所述检测目标物质特异性结合的第二结合物质和与所述检测目标物质竞争地与所述第一结合物质特异性结合的第三结合物质中的一种，其上连接有光敏标记；将作为检查目标的液体样品、所述赋予了磁性的结合物质、和所述标记结合物质混合，以进行结合反应；在含有所述液体样品的其中混合有所述赋予了磁性的结合物质和所述标记结合物质的样品池内产生磁�。允顾龈秤枇舜判缘慕岷衔镏室贫裂烦啬诘木植壳颍辉谒龈秤枇舜判缘慕岷衔镏室贫了鼍植壳虻那榭鱿拢鲈诎鼍植壳虻脑ざㄇ蛏险丈浼し⒐猓砸⒂纱嬖谟谒鲈ざㄇ蚰诘墓饷舯昙遣墓庋藕牛患觳馑龉庋藕牛缓突诓獾玫墓庋藕诺牧浚范ㄋ鲆禾逖分兴黾觳饽勘晡镏实牧俊�
2.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述赋予了磁性的结合物质、所述检测目标物 质、和所述标记结合物质的结合体的最大长度大于或等于200nm，所述标记结合物质是其上 连接有光敏标记的第二结合物质。
3.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述赋予了磁性的结合物质和所述标记结合 物质的结合体的最大长度大于或等于200nm，所述标记结合物质是其上连接有光敏标记的 第三结合物质。
4.如权利要求1所述的检测方法，其中，所述包封磁体的介电粒子的粒径为 IOOnm-I μ m。
5.如权利要求1所述的检测方法，其中，采用铁系磁性材料和钼系磁性材料中的一种 作为所述磁性粒子；且采用红外线作为所述激发光。
6.如权利要求1-5任一所述的检测方法，其中采用一部分壁具有与液体样品接触的样品接触表面的样品池作为所述样品池，所述一 部分壁由透明电介质板构成；以所述样品接触表面的附近作为所述的局部区域；在全反射的条件下从由电介质板构成的壁的外部，将光照射在所述电介质板的样品接 触表面上，使得在所述样品接触表面产生衰减光；和采用所述衰减光作为激发光。
7.如权利要求6所述的检测方法，其中，采用在电介质板的样品接触表面上形成有金 属膜的样品池作为所述样品池。
8.如权利要求7所述的检测方法，其中，采用装配有提供在所述金属膜上的光波导层 的样品池作为所述样品池。
9.如权利要求1所述的检测方法，其中，直接检测由光敏标记受激发光照射产生的光 学信号。
10.如权利要求7所述的检测方法，其中，通过检测由于光学信号在金属膜上激发表面等离子体而发射的发射光，间接检测由光敏标记受激发光照射产生的光学信号。
11.如权利要求8所述的检测方法，其中，通过检测由于光学信号在光波导层上激发光 波导模而发射的发射光，间接检测由光敏标记受激发光照射产生的光学信号。
12.权利要求1所述检测方法中所用的包封磁体的介电粒子，其包括 包封在其中的磁性粒子；和用于表面修饰的在液体样品中表现极性的官能团。
13.如权利要求12所述的包封磁体的介电粒子，其中，所述官能团是羧基。
14.如权利要求12所述的包封磁体的介电粒子，其中，其粒径为100nm-1μ m。
15.如权利要求12-14任一所述的包封磁体的介电粒子，其中，采用铁系磁性材料和钼 系磁性材料中的一种作为所述磁性粒子。
全文摘要
本发明涉及检测方法和在该方法中使用的含有磁性材料的介电粒子。为了改善采用通过磁性粒子定位结合物的检测方法的实际应用，将磁性结合物质Bm和标记结合物质B0与液体样品混合以发生结合反应，磁性结合物质Bm是与目标物质A特异性结合的第一结合物质B1，其上连接有包封磁体的介电粒子P(其中包封着磁性粒子M且其表面被在液体样品中表现极性的官能团修饰)，标记结合物质B0是与目标物质A特异性结合的第二结合物质B2，其上连接有光敏标记O。在样品池10内产生磁�。勾判越岷衔镏蔅m移动至局部区域。激发光仅照射在包括局部区域的预定区域，当磁性结合物质Bm移动至局部区域，其中光敏标记O产生光学信号。检测该光学信号。
文档编号G01N33/543GK101988922SQ20101024347
公开日2011年3月23日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者大塚尚 申请人:富士胶片株式会社
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
