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专利名称：一种用于羊泰勒虫病检测的间接elisa方法
技术领域：
本发明涉及畜牧兽医领域，尤其涉及的是一种用于羊泰勒虫病检测的间接ELISA方法。
背景技术：
羊泰勒虫病(ovine Theileriosis)是由媒介蝶传播的由泰勒科泰勒属的原虫寄 生于绵羊和山羊巨曬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的疾病的总称，属于一种蝶传性血液原虫病。在我国，已报道的羊泰勒虫病的病原有尤氏泰勒虫、吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫。本病危害严重，可引起羔羊和外地引进羊大量死亡，使慢性发病的山羊和绵羊发育变缓，产肉量和产毛量显著下降，从而给养羊业造成重大经济损失。在临床上，泰勒虫病的诊断可根据临床症状如高热、贫血、体表淋巴结肿大和异嗜等，及流行病学资料如发病季节，本地区蜱的活动情况，动物在近期是否被蜱叮咬，发病地点，家畜是本地动物还是外地引入动物等做出初步的诊断。确诊泰勒虫病应查到病原，由于泰勒虫在进入畜体后主要以裂殖体和红细胞内虫体形式存在，病原检查只有查到一种阶段的虫体即可确诊，常用的方法有PCR、RT-PCR、RLB、LAMP等。由于虫体进入畜体之后，宿主即产生抗体，因此检测抗体的血清学诊断方法也用于泰勒虫病的诊断[1_9]近年来,在牛的泰勒虫病研究中，国外以牛的环形泰勒虫的TaSP为目的蛋白建立了间接ELISA技术并相继进入田间试验2_6。在我国，简子健等以纯化的牛环形泰勒虫GST-Tamsl融合蛋白作为检测抗原，通过优化ELISA反应条件，建立检测牛环形泰勒虫血清特异性抗体的间接ELISA方法[1]。这是国内首次利用重组蛋白建立的牛环形泰勒虫病血清学诊断方法，为大规模地进行牛环形泰勒虫病的流行病学调查和血清学诊断提供有效的技术手段。在我国，2002年高玉龙以羊的泰勒虫虫体粗抗原建立了间接ELISA方法，但该法与绵羊巴贝斯虫有交叉反应，易造成假阳性结果和非特异反应[8]。2006年，Miranda以泰勒虫热休克蛋白Hsp70类似物建立了羊泰勒虫的间接ELISA方法m。2010年，刘志杰等以尤氏泰勒虫TuiP重组蛋白为基�。⒘思浣覧LISA方法，该法仅用于由尤氏泰勒虫引起的羊泰勒虫病的检测，而对吕氏泰勒虫引起的羊泰勒虫病检测不到抗体[9]。参考文献I.简子�。硭卣辏萍矣辏锲浼蚓加瘢缰星铮牢�.牛环形泰勒虫GST-Tamsl融合蛋白间接ELISA检测方法的建立.新疆农业科学2011，48 (3) =578-583.2.Mohamed AM，Abdel-Rady A,Ahmed LS,El-Hosary A. Evaluat ion of indirectTaSP enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of tropical theileriosisin cattle(Bos indicus)and water buffaloes(Bubalus bubalis)in Egypt. VetParasitol. 2011Nov 12.3. Mohammad Al-Saeed AT，Omer LT, Abdo J，Habibi G，Sal ih DA, Seitzer.Epidemiological studies on tropical theileriosis (Theileria annulata infectionof cattle)in Kurdistan Region，Iraq. Parasitol Res. 2010Jan ；106(2) :403-7. Epub2009 Nov 13.4. Seitzer U，Beyer D，Kullmann B，Bakheit MA，Ahmed JS. Evaluation ofTheileria annulata recombinant immunodominant proteins for the development ofELISA. Transbound Emerg Dis. 2008Aug ;55 (5-6) :244-8.5. Seitzer U，Bakheit MA, Salih DE, Ali A，Haller D，Yin H，Schnittger L,Ahmed J. From molecule to diagnostic tool Theileria annulata surface proteinTaSP. Parasitol Res. 2007 Sep ；101 Suppl 2 S217-23.6. Miranda J，Bakheit MA,Liu I, Yin H，Mu Y，Guo S，Beyer D，01 iva A，AhmedJS,Seitzer U.Validation of the indirect TaSP enzyme-linked immunosorbent assayfor diagnosis of Theileria annulata infection in cattle. Parasitol Res. 2006 May ；98(6) :561-7. Epub 2006 Jan 20.7. Miranda J，Bakheit MA,Liu I, Yin H，Mu Y，Guo S，Beyer D，01 iva A，AhmedJS, Seitzer U. Development of a recombinant indirect ELISA for the diagnosis ofTheileria sp. (China)infection in small ruminants. Parasitol Res. 2006 May ；98 (6)561-7. Epub 2006 Jan 20.8. Gao YL, Yin H，Luo JX, Ouyang WQ, Bao HM, Guan GQ, Zhang QC, Lu WS, MaML. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis ofTheileria sp. infection in sheep.Parasitol Res. 2002 May ；88 (13 Suppl I) S8-10.9. Identification of Theileria uilenbergi immunodominant protein fordevelopment of an indirect ELISA for diagnosis of ovine theileriosis. Liu Z，Wang Z, Yin H，Luo J，Zhang B，Kullmann B，Abdo J，Salih D，Ahmed J, Seitzer U. Int JParasitol. 2010Apr ；40(5) :591-8. Epub 2009Nov 10.

发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种用于羊泰勒虫病检测的间接ELISA方法。本发明的技术方案如下一种利用IlSP检测羊泰勒虫病的间接ELISA方法，其包括如下步骤①包被以包被缓冲液将表达产物HSP蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50 u L，4°C过夜；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；②封闭每孔加入50 ii L封闭液，37°C封闭40分钟；以洗涤缓冲液PBST洗漆，拍干;③与一抗结合待检血清样品及任选的阳性和阴性对照用血清稀释液(含5%脱脂奶粉，I %大肠杆菌萃取物的封闭液)I 100稀释，每孔加入50yL，37°C结合I小时；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干；④与二抗结合兔抗绵羊IgG/HRP或兔抗山羊IgG/HRP用PBST I 1500稀释，每孔加入50 u L，37°C结合I小时；以洗涤缓冲液PBST洗漆，拍干； ⑤显色每孔加入50 ii L H202/0PD，37°C避光15分钟；
⑥终止每孔加入I. 25mol/L H2SO4,测定 OD492 ；⑦结果判定样品的效价表示为(0D样品-OD阴性)+ (0D阳性-OD阴性)，若效价小于0. 20，为阴性；效价在0. 20 0. 30之间为可疑；效价大于0. 30为阳性。
所述的间接ELISA方法，所述TlSP蛋白由SEQ ID NO. I所示核苷酸序列编码，扩增所述核苷酸序列的特异性引物上游引物(SBxp-F) 5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3 ；下游引物(SBxp-R):5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3。所述的间接ELISA方法用于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物的用途。所述间接ELISA方法中TlSP蛋白的制备方法，(I)采用高效利用稀有密码子的BL21宿主菌，并在诱导表达时在培养基中加入I %的葡萄糖，大大提高了 HSP融合蛋白的表达水平，表达量达到宿主细菌总蛋白的28. 6% ；(2)在目的蛋白的N-端融合表达6组氨酸标签便于纯化得到高纯度的HSP融合蛋白，这种高纯度和高活性的HSP蛋白为随后的方法建立奠定了基础。本发明利用免疫学筛选方法，从吕氏泰勒虫cDNA表达文库获得HSP基因(TaSP类似物)，经验证，该基因存在于吕氏泰勒虫的子孢子、裂殖体和裂殖子三阶段。并证实该基因也存在于羊的尤氏泰勒虫以及牛的环形泰勒虫基因组中。经动物免疫、WesternBlotting和ELISA实验证实，HSP重组蛋白均具有较好的免疫原性和反应原性。用HSP重组蛋白建立的间接ELISA方法，完全适用于我国羊泰勒虫病的血清学检测和流行病学调查。本发明选取中国羊泰勒虫病的流行虫种-吕氏泰勒虫的HSP基因，通过克隆表达，以纯化的HSP蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出吕氏泰勒虫HSP抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低，高通量。本发明人针对我国畜牧业领域中羊泰勒虫病的发病状况确定了判定标准，从而能够有效检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的绵羊和山羊。此外，采用本发明所述方法还可用于由牛环形泰勒虫引起的牛泰勒虫病的抗体检测。


图I为吕氏泰勒虫TlSP的PCR特异产物；M :核酸marker2000 ;泳道I :以吕氏泰勒虫裂殖子表达文库为模板的特异产物；泳道I :以吕氏泰勒虫裂殖子基因组为模板的特异产物；泳道3 :以吕氏泰勒虫裂殖体基因组为模板的特异产物；泳道4 :以吕氏泰勒虫子孢子基因组为模板的特异产物；泳道4 :空白对照。图2为TlSP诱导表达产物的SDS-PAGE ;泳道I :蛋白marker ;泳道2 lh表达物；泳道3 2h表达物；泳道4 3h表达物；泳道5 4h表达物；泳道6 5h表达物；泳道7 :6h表达物；泳道8 :空载体菌液。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例I nsp基因的克隆I、PCR扩增以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板，上游引物(SBxp-F) 5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3,下游引物(SBxp-R) 5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3,进行PCR 扩增。反应体系为 lOOiiL，即10X 缓冲液 lOiiL，dNTP(2.5mmol/L)8 u L, MgCl2(25mmol/L)6ii L,上游引物 I U L,下游引物 I u L,模板(cDNA) 2 u L,灭菌水71. 5u L, Taq 酶(TaKaRa, DR001B, IOU/ U L)0. 5u L0离心混匀后置PCR自动扩增仪中，94°C预变性4min，进行如下循环94°C lmin,
50°C lmin，72°C 2min，30个循环后，72°C延伸8min。PCR产物上样5 8 y L，在琼脂糖凝胶中进行电泳(80 100V)，扩增产物片段大小若与预期的目的片段大小一致(图I)，即可用
于后续试验。2、目的DNA片段的纯化回收先将PCR产物在0. 8%琼脂糖凝胶中进行电泳(80V)40min左右。在长波紫外光下观察电泳情况，当目的DNA片段与杂带完全分开后，用清洁手术刀(经火焰消毒)切下含有目的片段的凝胶块(小于300 yL)置于1.5mL离心管中。后续步骤按Roche公司Agarose Gel DNA Extraction Kit说明书进行。具体步骤为①用吸头将凝胶块轻轻捣碎，每IOOmg琼脂糖凝胶中加入300 U L溶胶液。②加入10 ii L玻璃奶,颠倒混勻，于56 60°C水浴IOmin,并间隔2 3min混勻一次。③12000r/min离心30s，吸弃上清，用500 u L核酸结合液，在混匀器上重悬DNA。
④12000r/min离心30s，吸弃上清；用500 y L洗涤液洗涤沉淀丸，涡旋混匀，12000r/min离心30s,吸弃上清；重复一次。⑤尽量吸尽液体，37°C干燥40min或自然干燥I 2h。⑥加20 50 ii L TE缓冲液，混匀，56 60°C水浴lOmin，每2 3min涡旋一次，12000r/min离心lmin,回收上清备用。3、目的 DNA 片段与 pGEM-T Easy 载体(Promega，A3600)的连接由于所使用的Taq酶在聚合过程的最后给产物末端加上一个腺嘌呤(A)，而pGEM-T Easy载体的两个末端各有一个突出的胸腺嘧啶(T)，因此既可防止质粒的自身环化，又可形成粘端连接，使得连接效率大为提高。连接体系为IOii L，即2 XBuffer 5 u L,T4DNA Ligase I u L, pGEM-T Easy 载体(Promega，A3600) (IOU/ ii L) I y L，目的 DNA 3u L,4°C连接过夜或16°C温育4h以上。4、感受态细胞的转化①每管感受态细胞(Takara)中加入5 y L或10 y L连接反应物，用枪头轻轻混匀，冰浴45min。②将离心管小心的转移至42°C水浴中热激90s。③迅速置于冰浴中冷却3min，然后每管加入预热至37°C的LB培养基800 u L，370C 220r/min震荡培养Ih使细胞复苏。④4°C 4000r/min离心2min,弃部分上清，留200 u L左右重悬沉淀。
⑤在细胞悬液中加入16 ii L X-gal (50mg/mL)和 4 y L IPTG (200mg/mL)，用枪头轻轻混匀，涂布于预至37 °C的LB琼脂平板(含氨苄青霉素60 u g/mL)上，37 °C过夜培养。5、挑斑在超净工作台里用灭菌牙签从平板上挑取单个白色菌落，接种于含3mL LB培养基(含60 ii g/mL氨苄青霉素)的链瓶中，同时挑一个蓝斑作阴性对照，37°C 220r/min摇振培养 12 16min。6、质粒的提取与鉴定利用Takara质粒提取试剂 盒,操作步骤如下①用无菌牙签从LB平板挑取白色单菌落，接种于3mL LB培养液(氨苄青霉素
100u g/mL)中，37°C振摇(230r/min) 12 16h。②无菌移取I. 5mL菌液置离心管中，12000r/min离心3min，弃上清，倒置控干残留液体。③每管加入120 ii L 预冷的溶液 I (50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris *C1 (pH8. 0)；IOmmoI/L EDTA(pH8. 0))，用涡旋器振荡悬浮。④加入240ii L新配制的溶液11(0. 2mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH稀释)；1% SDS (用10% SDS稀释))，温和倒置离心管3 4次混匀，然后冰浴放置5min。⑤加入180 ii L预冷的溶液III(5mol/L乙酸钾60mL ;冰乙酸11. 5mL ;无离子水28. 5mL),颠倒混和几次,冰浴放置5min。⑥12000r/min离心8min，将上清转移至另一离心管中，加入500ii L Tris饱和酚振荡抽提。⑦12000r/min离心lmin,转移上层水相至一新管中，用Tris饱和酹氯仿异戍醇(25 24 I)振荡抽提。⑧12000r/min离心lmin，上层水相加入2倍体积的无水乙醇，置_20°C沉淀0. 5h以上，12000r/min,离心 IOmin0⑨沉淀用冰冷的70%乙醇洗涤，离心除去残余乙醇，置室温自然干燥。⑩用30 ii L含RNA酶(20 u g/mL)的TE (pH 8. 0)溶解，室温放置0. 5h，电泳观察。阳性克隆的鉴定①电泳鉴定将所提取的质粒进行电泳，与阴性质粒(蓝斑)进行比较，选出阳性质粒。②酶切鉴定用EcoR I和Hind III进行双酶切。反应体系为20 ii L体系，即重组质粒 15 iiL，10XBuffer 2u L,EcoR I luL,Hind IIIl y L，无菌水 I y L，置 37°C温箱中，2h后取出，将酶切产物、分子量Marker进行电泳比较。③PCR鉴定以酶切和电泳为阳性的质粒10倍稀释后取Iii L为模板，加入2 ii L10 X PCR 缓冲液，2 i! L dNTP(2. 5mmol/L)混合物，0.5iiL TaqDNA 聚合酶(5U/ u L), 0. 2 u L上游引物(201)、0. 2 ii L 下游引物(203) ,1. 2u L MgCl2 (25mmol/L)，补水至 20 u L，进行 PCR鉴定，用 IOObp DNA ladder Marker 作为参照。④重组质粒的测序确证将PCR扩增鉴定、酶切鉴定均为阳性的克�。古嘌┰觯痛罅ι锕こ坦静庑�(核苷酸序列如SEQ ID N0:1)。鉴定正确的重组质粒命名为 pGEM-TISP。所得编码HSP片段的核苷酸序列如下
GAATTCGATCGACAACGGAATCCTATCGATTTTGATCCCAATGATGATCAACAGCCTTTGGACCCTAATCAACTCATAGATCAAGAAGAACCTTCTGAACAACCTACTCAACAAGAACCAATAGAACCACAACAACCTACAGAACTAGAAACTACAGAACCCGAAGAGTTGGAACCAGAAACTGTTACAGTAGAAGTTCCAGAACCCGTTACATCAGAAGAACCTAAAGAATCGGATCAAACTGAAGAACAAAAACACGAAGAACCTGAAGCATTTCCAGCTCCTGAACCAGTTGATGAACCCGCAGTTCATGCTACTGAATCTACTCCTACTAAGGCAAGTTCCAGTGGTGATGGAGCAGCTGTTTGTCATGGAAAACATCATGATGATGACTCTGACGGGAAGCTT实施例2重组表达载体的构建目的片段与pET30a-HSP载体的酶切回收①已测序的pGEM-TISP质�：蚿ET30a质粒分别用EcoR I和Hind III酶切。酶切体系(50 u L)分别如下，目的基因管为IOXbuffer D 5 u L, BSA IuL, Hind III2. 5u L, EcoR I 2. 5 u L, H2O 24 y L，pGEM-TISP 质粒 15 y L。载体管为 IOXbuffer D5 u L, BSA I u L, EcoR I 2. 5 u L, Hind III 2. 5 u L, H2O 24 y L，pET30a 载体 15 y L。②酶切混合物离心混匀后，置37°C水浴消化3h。③取3uL酶切混合物电泳观察，酶切完全后，65°C水浴保温15min灭活内切酶，分别用0. 8%琼脂糖凝胶电泳重组质�：驮靥迕盖胁铮邢滤璧哪康奶醮肁garose Gel DNA Extraction Kit回收纯化目的片段和载体片段(方法同前)。电泳观察回收情况。目的片段与表达载体的连接10 X ligase buffer 2 U L,目的片段12yL，pET30a载体 4iiL，T4DNA ligase 2yL，混匀后置 16°C连接 5h。转化取连接产物10 ii L无菌操作加入200 u L BL21感受态细胞(感受态细胞的制备同前)中进行转化(除涂板时不加IPTG、X-gal外，其它操作步骤均同前)。重组表达质粒的提取与鉴定Takara质粒提取试剂盒,进行鉴定。①重组质粒的电泳鉴定提取的质粒每个上样5uL进行电泳，同时加空白载体对照，选出泳动速度较阴性慢的质粒进行进一步鉴定。②重组质粒酶切鉴定将电泳选出的质粒取8iiL，加Buffer H 2 U L, BSA0. 5u L, H2O L, Hind III I. 5u L, EcoR I I. 5u L, 37°C 水浴消化 2h，电泳观察结果。对鉴定为阳性的质粒进行扩增鉴定。③重组质粒PCR鉴定重组质粒DNA I 10稀释后，用引物上游引物(SBxp-F) 5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3,下游引物(SBxp-R) 5-CCAAGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3,进行扩增，扩增程序为，94°C预变性3min ;进行如下循环94°C lmin, 50 °C lmin,72°C lmin 20s ；30 个循环后 72°C延伸 8min。经上述鉴定均为阳性的重组表达质粒命名为pET30a_TlSP。实施例3重组表达质粒的诱导表达将经过序列分析的重组菌30ii L接种至3mL含1%葡萄糖的2XYT培养液(含50 ii g/mL羧苄青霉素)中，37 °C振摇过夜。取过夜培养物200 y L接种于20mL含I %葡萄糖的2 X YT培养液(含50 ii g/mL羧苄青霉素)中，剧烈振摇至OD6tltl为0. 6 I. 0时，加入IPTG至终浓度0. 5mmol/L，37°C诱导表达，在第4小时收集菌液，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting分析，检测表达产物。同时用未诱导的菌液作为阴性对照。
实施例4表达产物的检测SDS-PAGE 电泳①洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2. 0%琼脂糖封边。配制12%的分离胶20mL，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖ImL双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置控干液体，加入6mL 5%的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。②小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液(Tris-甘氨酸缓冲液25mmol/L Tris ;250mmol/L甘氨酸(pH 8.0) ；0. 1% SDS)，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。③收集的菌液12000r/min离心3min,用IOOy L pH 7. 4的PBS悬浮,加入等体积的 2X SDS 上样 buffer (IOOmmoI/L Tris. cl(pH8. 0) ;200mmol/L 巯基乙醇；4% SDS ；0. 2%溴酚蓝；20%甘油)，混匀，水浴煮沸5min，用微量进样器上样20 y L，打开电源，用80V电压 电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。④染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用凝胶5倍体积的考马斯亮兰染色液(45mL甲醇45mL水IOmL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮兰)浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上室温染色3h。⑤脱色用30%乙醇和10%冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3 4次。待兰色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。⑥结果观察，见图2，电泳显示重组表达质粒产生了约25kDa的蛋白带，与预期的融合蛋白分子量大小相符，经薄层扫描分析，目的蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的28. 6%。Western 印迹分析①溶液的配制，洗液溶液150mmol/LNaCl, 50mmol/L Tris-HCL pH 7.5。转移缓冲液39mmol/L甘氨酸,48mmol/L Tris碱,0. 037% SDS, 20% 甲醇。氨基黑染色液(IOOmL)0.5g氨基黑IOB溶于40mL水、50mL甲醇、IOmL冰乙酸中。封闭液IOmL PBST+0. 3g BSA。底物溶液(30mL) 30mL PBST中溶解15mg的DAB ( 二氨基联苯胺)，9mg CoCl2 6H20加入
10u I 30% H2O2混勻后立即使用。②转印剪8块滤纸与I块硝酸纤维素膜(NC膜)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，160mA转移2. 5h。③封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后漂洗脱色，直至背景兰色脱尽。其余NC膜用PBST冲洗，加入IOmL封闭液，室温轻轻振摇I 2h。④与抗体结合封闭结束后，用PBST冲冼NC膜4 5次，加入PBST I 500倍稀释的羊的吕氏泰勒虫阳性血清10mL，37°C结合I. 5h，用PBST冲洗4 5次，每次在摇床缓慢摇动。加入I : 2000倍稀释的兔抗绵羊或山羊IgG(二抗)，室温下轻摇孵育lh，取出用PBST冲洗3 4次，每次IOmin0⑤底物显色将NC膜转移到IOmL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。
⑥结果表达产物经SDS-PAGE电泳的蛋白带转移至硝酸纤维素膜上进行免疫学反应，结果诱导菌出现一条特异性反应带，未诱导菌未见任何反应带。证明表达产物能与吕氏泰勒虫阳性血清发生反应，且具有很高的特异性。实施例5 nsp蛋白的大量制备每4mL上述上清中加入ImL 50% NTA His. Bind slurry,室温摇培lh,装入空层析柱中，用 4mL 洗液(8mol/L 尿 素，0. lmol/L NaH2PO4,0. 01mol/L Tris-HCL, pH6. 3)洗两次，洗脱非特异性结合在柱子上的蛋白质。接下来用ImL不同pH值的洗脱液(8mol/L尿素，0. lmol/L NaH2PO4,0. 01mol/L Tris, pH5. 9 和 pH4. 5)各洗 4 次，洗脱吸附在柱子上的 TlSP蛋白，电泳观察，收集只含有HSP蛋白的洗脱液。实施例6 TlSP间接ELISA建立用方阵试验测定纯化后抗原的最佳工作浓度(IOU g/mL)。然后进行如下操作①包被以包被缓冲液(包被缓冲液0. 05mol/L Na2C03/NaHC03, pH9. 6)将表达产物HSP蛋白稀释至工作浓度10 u g/mL,加入96孔酶标板，每孔50 u L，4°C过夜。以洗涤缓冲液PBST洗涤2次，拍干。②封闭每孔加入50 ii L封闭液(含5%蔗糖，10%马血清的PBST)，37°C封闭40min。洗漆3次,拍干。③与一抗结合待检血清样品及阳性和阴性对照用血清稀释液(含5%脱脂奶粉，I %大肠杆菌萃取物的封闭液)I 100 (体积比，下同)稀释，每孔加入50 iiL，每一个样加2孔，37°C结合lh。洗涤5次，拍干。④与二抗结合兔抗绵羊或山羊IgG/HRP用PBST I 1500稀释，每孔加入50 y L，37°C结合lh。洗涤5次，拍干。⑤显色每孔加入50ii L H202/0PD，37°C避光 15min。⑥终止每孔加入I. 25mol/L H2SO4，测定 0D492。⑦结果判定待检血清及阳性和阴性对照各有两个结果，均需要计算平均值。样品的效价则为(0D样品-OD阴性)+ (0D阳性-OD阴性)，若效价小于0. 20，为阴性；效价在0. 20 0. 30之间为可疑；效价大于0. 30为阳性。如果可疑样品第二次检测仍为可疑，需对同一动物另采样品检测。实施例7 IlSP间接ELISA方法用于检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染动物的实验结果。用此方法检测了 3000多份血清，包括实验感染动物血清，健康动物血清和注苗动物血清。结果100%感染动物血清为阳性，而86%野外样品为阳性，健康动物血清为阴性。该结果优于沿用多年的泰勒虫虫体粗提物建立的间接ELISA，这说明本发明的检测方法具有很高的敏感性和特异性。以上试验结果说明，该HSP间接ELISA能够检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物，我们已经成功的建立了检测吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物的HSP间接ELISA方法。实施例8TlSP间接ELISA试剂盒①包被以包被缓冲液(0. 05mol/L Na2C03/NaHC03, pH9. 6)将表达产物HSP蛋白稀释至工作浓度(10 u g/mL)，加入96孔酶标板，每孔50 u L，4°C过夜。以洗涤缓冲液PBST洗涤2次，拍干。②封闭每孔加入50 ii L封闭液(含5%蔗糖，10%马血清的PBST)，37°C封闭40min。洗涤3次，拍干。真空抽干后，4°C保存。③与一抗结合参照实例6。
④与二抗结合参照实例6。⑤显色参照实例6。⑥终止参照实例6。⑦结果判定参照实例6。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种利用TlSP检测羊泰勒虫病的间接ELISA方法，其特征在于，其包括如下步骤 ①包被以包被缓冲液将表达产物TlSP蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔50 μ L，4°C过夜；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干； ②封闭每孔加入50μ L封闭液，37°C封闭40分钟；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干； ③与一抗结合待检血清样品及任选的阳性和阴性对照用血清稀释液(含5%脱脂奶粉，I %大肠杆菌萃取物的封闭液)I 100稀释，每孔加入50 μ L，37°C结合I小时；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干； ④与二抗结合兔抗绵羊IgG/HRP或兔抗山羊IgG/HRP用PBSTI 1500稀释，每孔加入50yL，37°C结合I小时；以洗涤缓冲液PBST洗涤，拍干； ⑤显色每孔加入50μ L H202/0PD, 37°C避光15分钟； ⑥终止每孔加入I.25mol/L H2SO4,测定OD492 ； ⑦结果判定样品的效价表示为 (0D样品-OD阴性)+ (0D阳性-OD阴性)， 若效价小于O. 20，为阴性；效价在O. 20 O. 30之间为可疑；效价大于O. 30为阳性。
2.权利要求I所述的间接ELISA方法，其特征在于，所述TlSP蛋白由SEQIDN0.I所示核苷酸序列编码。
3.PCR扩增权利要求2所述核苷酸序列的特异性引物上游引物(SBxp-F) 5-GGAATTCGATCGACAACGGAATCCTA-3 ； 下游引物(SBxp-R) :5-CCGCTTCCCGTCAGAGTCATCATC-3。
4.权利要求I所述的间接ELISA方法用于吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染的动物的用途。
5.权利要求I所述间接ELISA方法中TlSP蛋白的制备方法，其特征在于 (I)采用高效利用稀有密码子的BL21宿主菌，并在诱导表达时在培养基中加入I %的葡萄糖，大大提高了 TlSP融合蛋白的表达水平，表达量达到宿主细菌总蛋白的28. 6% ; (2)在目的蛋白的N-端融合表达6组氨酸标签便于纯化得到高纯度的TlSP融合蛋白，这种高纯度和高活性的TlSP蛋白为随后的方法建立奠定了基础。
全文摘要
本发明公开了一种利用TlSP检测羊泰勒虫病的间接ELISA方法，包括如下步骤①包被；②封闭；③与一抗结合；④与二抗结合；⑤显色；⑥终止；⑦结果判定样品的效价表示为(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)，若效价小于0.20，为阴性；效价在0.20～0.30之间为可疑；效价大于0.30为阳性；本发明选取中国羊泰勒虫病的流行虫种-吕氏泰勒虫的TlSP基因，通过克隆表达，以纯化的TlSP蛋白作为诊断抗原，采用间接ELISA模式，研制出吕氏泰勒虫TlSP抗体检测试剂盒。该法操作简单，耗时短，成本低，高通量。
文档编号G01N33/569GK102662058SQ201210121339
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者任巧云, 何海宁, 关贵全, 刘军龙, 刘志杰, 刘爱红, 李有全, 杨吉飞, 殷宏, 牛庆丽, 罗建勋, 陈泽, 马米玲, 鲁炳义 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所