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专利名称：锂诊断/测定试剂盒及锂浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种锂诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锂浓度的方法，属于医学/工业/环境检验测定技术领域。
背景技术：
20世纪40年代，Cade首次用锂盐治疗躁狂症成功，总有效率约70%，锂盐对躁狂和抑郁的复发有预防作用，也用于治疗分裂情感性精神病。另外，锂盐可使双相障碍维持治疗阶段的自杀行为减少86%,而当停用锂盐后，自杀危险性会增加7.5倍。当血锂浓度达到或超过1.5mmol/L，会出现不同程度的中毒症状，血锂浓度3.0mmo1 / L以上可危及生命。
近几年，临床实验室多数方法学都有了新的发展，但锂的测定方法基本维持火焰原子发射法、火焰原子吸收法及离子选择电极法。原子吸收的方法是将稀释的标本吸入乙炔火焰中，利用空心阴极元素灯光源发出被测元素的特征辐射光，为火焰原子化器产生的样品蒸汽中的待测元素基态原子所吸收。锂在波长670.8 nm处的被吸光的特征辐射光的大小与标本中的锂浓度成正比。但目前国内的临床实验室没有统一的实验方法和实验操作规程，也很难在精神病医院的实验室中查找到其使用情况。
自然界中无游离锂，因此实际指锂离子或锂盐，而碳酸锂是最重要的锂化物。碳酸锂被用于陶瓷釉料的生产、特种玻璃、铝的熔炼和钢铁铸造粉末。氢氧化锂和氯化锂应用在润滑剂、空调和干燥系统中。丁基锂、锂金属、特种无机物和特种有机物，被用于制药、合成橡胶等领域。锂是一种稀有金属，锂电池就以它为主要原料，航空航天工业也离不开锂。金属锂与锂合金在核能发电、轻质高比强合金、轻金属焊接等诸多领域都有着广阔的开发利用前景。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定锂浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的锂诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行锂浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明锂浓度测定方法原理如下
肌醇-l-磷酸+水肌醇-1-磷酸酶艇^+/1^+肌醇+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸
+丙酮酸+ 二氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶异柠檬酸脱氢酶
D-异柠檬酸+辅酶这种方法应用能被锂抑制活性的肌醇-l-磷酸酶(inositol-l-phosphase;EC3丄3.25)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1丄1.41; EC 1.1.1.42)酶促反应连续监测法/速率比色法。肌醇-l-磷酸酶(需要镁离子激活其活性，锂离子能抑制镁离子的激活作用)酶解肌醇-l-磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、异拧檬酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，可以测算锂的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明锂诊断/测定试剂盒较
为理想
缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
还原型辅酶0.25 mmol/L
氯化镁0.6 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶10000 U/L
丙酮酸羧化酶10000 U/L
异柠檬酸脱氢酶10000U/L
肌醇-l-磷酸8 mmol/L
腺苷二磷酸8 mmol/L
草酰乙酸8 mmol/L
酮戊二酸20 mmol/L
氯化镁可以用其它镁盐取代；如硫酸镁等。
本发明的锂诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶。
还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、肌醇-l-磷酸酶。还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异拧檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定锂浓度的方法，其还原型辅酶
可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的锂诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲a
稳定剂
还原型辅酶
氯化镁
肌醇-l-磷酸酶丙酮酸羧化酶
肌醇_1_磷酸
腺苷二磷酸
草酰乙酸
酮戊二酸
100 mmol/L500 mmol/L0.25 mmol/L0.6 mmol/L10000U/L10000U/L10000 U/L8 mmol/L8 mmol/L8 mmol/L20 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测对照及锂样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约
l分钟左右，检测时间5分钟左右。分别加入对照及样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置
于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，从而测算出锂的浓度大小。
实施例二
本实施例的锂诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂还原型辅酶氯化镁肌醇-l-磷酸
腺苷二磷酸草酰乙酸
洞戊二酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液稳定剂
肌醇-l-磷酸酶丙酮酸羧化酶
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L0.6 mmol/L8 mmol/L8 mmol/L8 mmol/L20 mmol/L
綱mmol/L500 mmol/L10000U/L10000U/L10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测对照及锂样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间5分钟左右。
分别加入对照及样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，从而测算出锂的浓度大小。实施例三
本实施例的锂诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
氯化镁
肌醇-l-磷酸
腺苷二磷酸
草酰乙酸
酮戊二酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液稳定剂
丙酮酸羧化酶
试剂
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L0.6 mmol/L8 mmol/L8 mmol/L8 mmol/L20 mmol/L
100 mmol/L500 mmol/L10000U/L10000U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
画mmol/L
ii稳定剂 500 mmol/L
肌醇-l-磷酸酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定锂浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测对照及锂样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。分别加入对照及样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，从而测算出锂的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0016;吸光度时间反应曲线应呈直线下降；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达0.54mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±7%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《3 °/。；试剂的灵敏度可达0.0888± 0.044 AA/mmol/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
1权利要求
1. 一种利用能被锂抑制活性的酶比色法及酶联法技术的锂浓度测定方法，其方法原理如下肌醇-1-磷酸+水 <u>肌醇-1-磷酸酶/Mg</u><u>2+</u><u>/Li</u><u>+</u> 肌醇+磷酸根磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸 +丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+酮戊二酸+还原型辅酶 <u>异柠檬酸脱氢酶</u> D-异柠檬酸+辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，测算出锂的浓度大小测定结果。
2. —种锂诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20——500 mmol/L稳定剂1——-4000 mmol/L还原型辅酶0.1———0.35 mmol/L氯化镁0.1——50 mmol/L肌醇-l-磷酸酶1000-——80000 U/L丙酮酸羧化酶1000———80000 U/L异柠檬酸脱氢酶1000-——80000 U/L肌醇-l-磷酸1—50 mmol/L腺苷二磷酸l一50 mmol/L草酰乙酸l一50 mmol/L酮戊二酸l一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用其特征在于试剂盒可以是千粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。氯化镁可以用其它镁盐取代。
3. 根据权利要求2所述锂诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述锂诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成。还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异拧檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述锂诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、肌醇-l-磷酸酶组成。还原型辅酶、氯化镁、肌醇-l-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶、肌醇-l-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述锂诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用能被锂抑制活性的酶比色法及酶联法技术的锂诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定锂浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/工业/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、氯化镁、肌醇-1-磷酸、腺苷二磷酸、草酰乙酸、酮戊二酸、肌醇-1-磷酸酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸脱氢酶及稳定剂；通过分别将对照及锂样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，比较对照及锂样品吸光度下降的程度/速度的差别，从而测算出锂的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464318SQ20071019211
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司