专利名称：生产色谱介质的方法
技术领域：
本发明涉及生产具有改进的压力-流动性质的色谱介质的方法和方式。更确切地，本发明涉及双峰粒径分布和层功能化用作改变色谱介质的压力-流动性质的方式。
背景技术：
具有所需结合能力和效率的色谱介质的粒径和硬度在一些情况下确实不在它们的压力规格内在标准柱中能够使用足够高的流动速率。甚至对于非常坚硬的珠�？赡芤彩钦庋�。众所周知填充珠粒之上的压降随粒径的增大而减少。但是，为了减少背压用较大尺寸的珠粒改变介质会导致较低的分辨率和较低的动态结合能力。因此，在这个领域中仍然需要替代性填充珠粒来减少背压而不必牺牲色谱性能。发明概述
本发明提供降低填充床中的流动阻力的简单方法。这可通过以下获得将比如10-20%的大得多的带壳颗粒加入小颗粒中，其具有与小珠粒相同类型的功能化(配位体)，以便降低填充床中的流动阻力。这种混合策略的重大优势是可使效率和吸附动力学保持在接近于小颗粒的水平。通过使用壳功能化的大颗粒获得了改进的压力流动特性而没有任何洗脱效率的损失。带壳大珠粒可为多孔珠粒或设计成具有无孔核和表面多孔固定相。如果目标仅是降低填充床中的背压，当然可以使用未功能化的大珠粒。使用充分功能化的大珠粒会负面地影响分辨率。但是会使平衡时的结合能力损失最小化。通过转而使用壳功能化的大珠粒，保全了效率，但是和充分功能化的大珠粒相比降低了平衡结合能力，但是在很多情况下动态结合能力在常用的停留时间内相同。利用混合珠粒、填充珠粒的概念可以优化有关背压和吸附动力学的柱填充且使用壳功能化的大珠�？墒垢呦赐研�(分辨率)保持在与小珠粒相同的水平。这是重要的，因为高分辨率对于某一尺寸的柱在精加工(polishing)应用中将增大可能的样品载荷。因此，第一方面，本发明涉及用于生产具有改进的压力-流动性质的色谱介质的方法，该方法包含使包含外功能化壳/盖和内核的大珠粒/颗粒与较小珠粒/颗粒混合，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5civ/小颗粒的D5civ] >1. 2，优选>3，且其中柱中的大珠�：托≈榱５奶寤萚大珠粒的总体积/珠粒的总体积]的范围在0，05-0, 9。D50v是累积体积分布的中值粒径。所述配位体的性质不限于本发明的宽阔方面。因此，在本分离基质的一个实施方案中，所述配位体选自阴离子交换配位体；阳离子交换配位体；疏水相互作用色谱(HIC)配位体；反相色谱(RPC)配位体；固定金属亲合力色谱(IMAC)配位体；亲硫配位体；亲合力配位体；核酸基配位体；通过π相互作用、氢键和/或范德华力作用的配位体；和多峰配位体(有时表示为混合模式色谱配位体)。所述配位体可与载体直接耦合或通过增长剂耦合。所述增长剂是传统的且因此可包含线性、支化、环状饱和的、不饱和的和芳族基团(例如具有最多1-20，比如1-10个碳的基团。这些基团可包含纯烃基、羟基、烷氧基和芳氧基和硫代类似物和或氨基。烃基中的碳链可在一个或多个位置处被氮、醚氧和硫醚硫间隔。也可以有羰基，比如在酰胺和酮基及对于水解具有相当的稳定性的其它基团中。珠粒的表面增长剂功能化的外部可为/用作含有相互作用配位体的外壳。所述功能化的壳的孔隙率和孔尺寸两者可高/大于和低/小于核中的孔隙率和孔尺寸或相同。所述珠粒(基础基质)基于有机和/或无机材料。所述基础基质在生物分子应用的情况下优选亲水且为聚合物的形式，所述聚合物在水中不溶解且或多或少可膨胀。已被衍生化而变得亲水的疏水聚合物归入此定义。合适的聚合物是多羟基聚合物，例如基于多糖，比如琼脂糖、葡聚糖、纤维素、淀粉、支链淀粉等，和完全合成的聚合物，比如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚(羟基烷基乙烯基醚)、聚(羟基烷基丙烯酸酯)和聚甲基丙烯酸酯(例如聚缩水甘油基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯醇和基于苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物，且包括其中两种或更多种单体相当于上述聚合物的共聚 物。聚合物(其可溶于水)可被衍生化而变得不溶解，例如通过吸附或共价结合而交联和与不溶体耦合。亲水基可通过单体(呈现可被转化成OH的基团)的聚合或通过成品聚合物的亲水化而引入到疏水聚合物上(例如到单乙烯基和二乙烯基苯的共聚物上)，所述亲水化例如通过吸附合适的化合物，比如亲水聚合物。用于基础基质的合适的无机材料是二氧化硅、氧化锆、石墨、氧化钽等。在小和大的带壳珠粒中可使用不同基础基质材料。或多或少疏水的基础基质可用于其中将并非生物分子的其它分子分离的色谱应用中。也可以使用大和小的壳活化的珠粒两者以便优化分辨率。30 μ m带壳珠�？缮杓瞥删哂蟹浅＝咏�10 μ m珠粒的分辨率。如果人们使这些珠粒与90 μ m带壳珠粒混合，其将可以填充具有关于分辨率和压力/流动性质的非凡色谱性质的精加工柱。根据本发明，提供了增大填充大带壳珠粒的柱的样品动态容量的方法，该方法通过用小的多孔珠粒均匀代替一些大珠粒或用与带壳大珠粒相同的配位体功能化的壳。本发明的一个有利的方面是提供制备根据本发明的大容量、高效和低压力流动分离填充色谱柱的方法，在所述方法中使带壳大珠粒与多孔小珠粒混合，所述小珠粒被均匀分布于整体珠粒的配位体取代。本发明涉及包含较大珠粒/颗粒的色谱介质，所述较大珠粒/颗粒包含功能化的外壳和常常未功能化的多孔或无孔内核。所述珠粒的核或内部也可被功能化。在这种情况下，所述核配位体不与目标分子例如壳中的阴离子交换配位体和核中的阳离子交换配位体相互作用。在第二方面，本发明涉及包含与较小颗粒混合的包含内核和外壳的较大珠粒/颗粒的色谱介质，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5civ/小颗粒的D5(iv]>1. 2，且其中柱中的大珠�：托≈榱５奶寤萚大珠粒的总体积/珠粒的总体积]的范围在
O.05_0· 9 ο附图
简述
图I是显示压降对填充了 Sephaose HP、Sepharose 6 Fast Flow的填充珠粒(柱Tricorn 5/50)和填充了这些介质的(50/50 v/v)混合物的珠粒的影响的色谱图。图2 是显不了溶菌酶在 SP Sepharose HP 和 SP Sepharose Fast Flow 上分离的色谱图。两种介质都填充在Tricorn 5/50柱中。在20分钟内流动速率为I. O mL/min且梯度为0-100% B。缓冲剂A :20 mM乙酸钠(pH 6. I)。缓冲剂B :缓冲剂A + O. 20 M NaCl0图3是根据本发明的带壳珠粒,称作〃壳S Sepharose Fast Flow"的示意图。图4是显示核糖核酸酶A、细胞色素C和溶菌酶在填充了 SP Sepharose HP的Tricorn 5/50上分离的色谱图。在20分钟内流动速率为I. O mL/min且梯度为0-100% B。缓冲剂A 20 mM乙酸钠(pH 5. 8)。缓冲剂B :缓冲剂A + O. 25 M NaCl。图5是显示核糖核酸酶A、细胞色素C和溶菌酶在填充了 SP Sepharose HP和壳SSepharose Fast Flow的50/50混合物的Tricorn 5/50上分离的色谱图。在20分钟内流动速率为I. O mL/min且梯度为0-100% B。缓冲剂A :20 mM乙酸钠(pH 5.8)。缓冲剂B :缓冲剂 A + O. 25 M NaCl。发明详述
结合附图将更确切地描述本发明。本文介绍的本实施例仅是为了说明性的目的，且不应该构成限制如所附权利要求限定的本发明。实验部分
基于Sepharose 6 Fast Flow制备壳介质-壳S 6FF 综述
基质的体积指的是沉降床体积且按克给出的基质的重量指的是抽吸干重。用于反应搅拌使用的是电动搅拌器因为使用磁力棒搅拌器容易破坏珠粒。使用传统方法分析官能度并测定烯丙基化程度或珠粒上的配位体(_S03_基团)含量的程度。Sepharose 6 Fast Flow用烯丙基缩水甘油基醚烯丙基活化
在玻璃过滤器上用蒸懼水洗漆Sepharose 6 Fast Flow。将50 mL排干的Sepharose 6Fast Flow 转移到反应容器并加入 25 mL 蒸馏水、14. 5 g NaOH, 6. 5 g Na2SOjPl g NaBH40在50°C下搅拌O. 5小时之后加入70 mL烯丙基缩水甘油基醚(AGE)。在50°C下将反应浆料搅拌18小时，随后在玻璃过滤漏斗上用蒸馏水、乙醇和最后用蒸馏水洗涤。然后通过滴定测定烯丙基含量258 μ mol/mL。壳活化(3 μ m壳通过部分溴化)
使50 g烯丙基化的排干凝胶、烯丙基化的Sepharose 6 Fast Flow(相当于总共12，9mmol烯丙基)和3 g乙酸钠在500 mL的蒸馏水中强力搅拌。使O. 2当量的溴(135μ )在密闭良好的玻璃容器中溶于110 mL蒸馏水。在强烈搅拌期间将溴溶液加入烯丙基凝胶浆料。在5分钟的搅拌之后，用蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤所述凝胶。S-盖耦合
将50 g部分溴化的凝胶(参见上文)转入烧瓶并与溶于40 mL蒸馏水的20 g亚硫酸钠混合。搅拌时，加入50% NaOH至pH 12. 5，随后在50°C下搅拌18小时并在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤。然后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤所述凝胶。核烯丙基除去
用顶置式搅拌使50 mL S-壳凝胶(参见上文)与蒸馏水(50 mL)和0. 5 g乙酸钠在烧杯中混合。加入溴直到浆料具有剩余的深橙/黄色。搅拌3分钟之后，加入甲酸钠直到浆料完全褪色。然后在玻璃过滤器上用蒸馏水洗涤所述凝胶，然后在50°C下在IM NaOH中搅拌16-18小时，随后用蒸馏水洗涤。然后通过滴定测定H+容量49 μ mol/ mL。混合介质(SPSepharose HP 和壳 S Sepharose 6 Fast Flow)的色谱评价 材料和方法(综述)
为了测试混合大珠�：托≈榱５难沽�/流动效果，使Sepharose HP (平均粒径34 μ m)与Sepharose Fast Flow (平均粒径90 μ m)混合并填充在柱(Tricorn 5/50)中。分别和填充Sepharose HP和Sepharose Fast Flow的柱对比压力/流动特性(图I)。分离蛋白质的测试方法的原理是将蛋白质注入含有分离媒介/介质的Tricorn5/50柱，用A-缓冲剂平衡。然后通过柱泵送大约5柱容积的A-缓冲剂；然后 是从A-缓冲剂到B-缓冲剂(A-缓冲剂+ NaCl)的20-mL线性梯度。然后在280 nm处监测色谱曲线。图 2-4 中展不 SP Sepharose HP、SP Sepharose Fast Flow 以及 SP Sepharose HP 和壳 SSepharose Fast Flow的混合物的色谱结果。实验
压力流动特性在色谱系统AKTAexplorer 100中用软件UNICORN测试。将待研究的介质填充在NextAKTA 7/10 mm柱中。作为流动相使用的是Milli-Q水且通过柱施加增大的线性流动速率(在60分钟内从O到10 ml/min)。为了评价色谱性质,使用了许多不同蛋白质。将评价的介质填充在Tricorn 5/50柱中且施用的蛋白质用梯度洗脱(参见上文)洗脱。使用了两种不同缓冲系统
1.缓冲剂A:100 mM乙酸酯缓冲剂(pH 5. 8)
缓冲剂B :100 mM乙酸酯缓冲剂(pH 5. 8)+0. 25 M NaCl
2.缓冲剂A:100 mM乙酸酯缓冲剂(pH 6. I)
缓冲剂B :100 mM乙酸酯缓冲剂(pH 6. 1)+0. 20 M NaCl。使用的样品是核糖核酸酶A(l. 5 mg/ mL)、细胞色素C(0. 4 mg/ mL)和溶菌酶(O. 4mg/ mL)。所述蛋白质溶于A-缓冲剂并施用200μ 。利用下面介绍的设备和设置监测色谱系统的性能
设备(GE Healthcare Biosciences AB)
LC 系统ΑΚΤΑ Explorer 10 XT 软件UNIC0RN
注入环200 μ柱Tricorn5/50 仪器参数
流动速率1. O mL/min 检测器池10 mm 波长280 nm。结果和讨论
本发明提出通过加入具有较大粒径的带壳珠粒用于调节基于"小"珠粒的色谱介质的压力-流动性质的方法。众所周知当粒径增大时柱中填充的珠粒上的压降将会更低。具有平均粒径34 μ m(Sepharose HP)和90 mm(Sepharose Fast Flow)的琼脂糖颗粒的背压分别呈现于图I。此图说明背压如何随着流动速率而增大(详见实验部分)且清楚地表明大珠粒导致低得多的背压。对于Sepharose HP得知的背压的急剧增大归因于小珠粒以及高流动速率下珠粒的压缩。图I也清楚地表明当Sepharose Fast Flow珠粒与Sepharose HP珠粒混合时背压降低了。期望这些结果。但是同样众所周知，较大珠粒也导致效率较低(较宽峰)的柱。这种现象在图2中说明，SP Sepharose HP (平均粒径34 μ m)和SP SepharoseFast Flow (平均粒径 90 μ m) ο这意味着不可能如小珠粒所获得的那样以保持的效率混合这类珠粒。我们建议使具有与小珠粒相同功能化(相同配位体)的带壳大珠粒混合，但是所述配位体连接于可构成固定表面增长剂的薄外壳或外部(图3)。这种珠粒设计导致在洗脱步骤中的较快的传质动力学且因此和被配位体均勻取代的同样尺寸的珠粒(关于SP Sepharose Fast Flow)相比将导致较窄的峰。如果我们比较图4和图5，其清楚地表明这类带壳珠�？捎氡慌湮惶寰热〈男≈榱；旌希皇狗蹇肀洳睢Ｔ谕�4中描绘了在填充了 SP Sepharose HP的柱上
分离的三种蛋白质的色谱图和在图5中显不了来自填充SP Sepharose HP和壳S SepharoseFast Flow的混合物的柱的结果。
权利要求
1.用于生产具有改进的压力-流动性质的色谱介质的方法，其包含使包含内核和外功能化壳/盖的大珠粒/颗粒与较小珠粒/颗粒混合，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5civ/小颗粒的D5civ] >1. 2，且其中柱中的大珠�：托≈榱５奶寤萚大珠粒的总体积/珠粒的总体积]的范围在O. 05-0. 9。
2.根据权利要求I的方法，其中所述核多孔。
3.根据权利要求I的方法，其中所述核无孔。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5civ/小颗粒的D5civ] >3。
5.根据权利要求1-4的方法，其中较大颗粒和小颗粒的壳用相同类型的配位体功能化。
6.根据权利要求5的方法，其中所述配位体为离子交换配位体、HIC、螯合、蛋白质A、亲合力或RPC配位体。
7.根据上述一项或多项权利要求的方法，其中多孔核用不与样品中的目标分子相互作用的配位体功能化。
8.根据上述一项或多项权利要求的方法，其中所述大珠粒的壳厚度(ST):ST〈[小颗粒的 D50V/2]。
9.色谱介质，其包含与较小颗粒混合的包含内核和外壳的较大珠粒/颗粒，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5civ/小颗粒的D5(iv]>1. 2，且其中柱中的大珠�：托≈榱５奶寤萚大珠粒的总体积/珠粒的总体积]的范围在O. 05-0. 9。
10.根据权利要求9的色谱介质，其中所述核多孔。
11.根据权利要求9的色谱介质，其中所述核无孔。
12.根据权利要求9-11的色谱介质，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D5tiv/小颗粒的 D5tiv] >3。
13.根据权利要求10的色谱介质，其中多孔核用不与样品中的目标分子相互作用的配位体功能化。
全文摘要
本发明涉及生产具有改进的压力-流动性质的色谱介质的方法和方式。更确切地，本发明涉及双峰粒径分布和层功能化用作改变色谱介质的压力-流动性质的方式。本发明涉及用于生产具有改进的压力-流动性质的色谱介质的方法，该方法包含使包含内核和外功能化壳/盖的大珠粒/颗粒与较小珠粒/颗粒混合，其中大珠�：托≈榱５牧＞侗嚷蔥大颗粒的D50V/小颗粒的D50V]>1.2，且其中柱中的大珠�：托≈榱５奶寤萚大珠粒的总体积/珠粒总体积]的范围在0.05-0.9。
文档编号G01N30/36GK102844111SQ201180020915
公开日2012年12月26日 申请日期2011年4月20日 优先权日2010年4月26日
发明者J·伯格斯特伦, B-L·约翰逊 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司
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