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专利名称：一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种草酰こ酸的測定方法，属于有机酸代谢物生物化学检测领域。
背景技术：
草酰こ酸是三羧酸循环中间体之一，也是生物代谢中的ー个重要物质。在体内是以羧酸根离子的形式存在。草酰こ酸在生物体的碳、氮代谢起着重要的作用。草酰こ酸可以发生α转氨基作用，形成天冬氨酸，并进一歩合成多种氨基酸，从而參与氮代谢；草酰こ酸与こ酰辅酶A缩合，形成柠檬酸，这是三羧酸循环中的关键反应之一，也是启动循环的一步，是碳代谢的主要中间物质；另外，草酰こ酸还參与糖异生作用；參与三羧酸循环的碳回补作用等等。总之，草酰こ酸在生物体的碳氮代谢和能量代谢过程中起着不可缺少的作用。測定草酰こ酸的含量对于理解细胞内的碳氮代谢过程具有重要的意义。
目前，草酰こ酸的測定主要有两类方法一类是高效液相色谱法(见分析化学，2005，33 :527-530)，该方法測定精度高，检测限低，但是液相色谱仪比较昂贵，多数实验室没有该设备；另ー类就是基于酶偶联比色測定的方法其中ー种方法是将草酰こ酸在苹果酸脱氢酶的作用下形成苹果酸，这ー过程需要NADH作为辅酶，形成MD，而NADH在340nm具有特异的吸收峰，通过测定NADH的量,可以计算草酰こ酸的含量(见Arch BiochemistryBiophysics 1976,175:39-53)。另ー种方法就是将草酰こ酸在草酰こ酸脱羧酶作用下，形成丙酮酸，然后利用丙酮酸的酶联測定方法測定丙酮酸的含量(见ClinicalBiochemistry 2006, 39 :74-77),从而推算草酰こ酸的含量。即用丙酮酸氧化酶将丙酮酸氧化形成过氧化氢，再利用过氧化物酶将过氧化氢转化为氧气和水，在这ー过程中加入ー特异的电子受体，被氧化后形成粉红色物质，570nm比色法或用荧光(Ex/Em = 535/587)检测方法可以测定草酰こ酸的含量。利用酶法偶联就需要购买较昂贵的生化酶和相应的底物，而且測定步骤较多。目前，缺乏快速准确地测定组织、器官中草酰こ酸的含量的方法。

发明内容
本发明的目的是提供ー种宽范围、成本低、便于普及的測定生物组织和器官中草酰こ酸含量的方法。本发明是通过如下步骤实现的草酰こ酸与固紫B(Fast Violet B)直接反应形成一种稳定的红色的微溶于水的物质。反应一定时间后，加入有机溶剂，充分溶解红色的物质。然后利用分光光度计直接測定以上混合物在520nm的吸光值，根据草酰こ酸标准样品制作的标准曲线即可得到未知样品草酰こ酸的浓度。用于溶解草酰こ酸和固紫B反应生成的红色物质的有机溶剂可以是こ醇、丙酮或甲醇中的ー种。
固紫B用去离子水直接溶解，现配现用。浓度范围为2-50mg/mL，样品草酰こ酸含量高时使用低浓度固紫B，样品草酰こ酸含量低时使用高浓度固紫B;制作标准曲线和样品测定须使用同样浓度的固紫B。
本发明利用草酰こ酸的直接显色方法替代常规生化方法中需要其他酶进行偶联再比色的方法来测定草酰こ酸的含量。测量的步骤更加简便，测定更加迅速，在25分钟就可以完成測定，所需的设备也比较简单，所需的药品种类少，測定成本低。


图I本发明提供的方法利用草酰こ酸标准样品測定的低浓度范围标准曲线图2本发明提供的方法利用草酰こ酸标准样品測定的高浓度范围标准曲线
具体实施例方式以下结合具体实例进ー步说明本发明。实施例一低浓度草酰こ酸标准曲线的制作称取O. 132克草酰こ酸，用50mL去离子水溶解，定容至IOOOmL,得到ImM的草酰こ酸母液。按照表I配制标准曲线制作所需的各种浓度的草酰こ酸样品。表I低浓度草酰こ酸标准曲线制作(IOO-IOOOuM)
权利要求
1.一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法，其特征在于草酰乙酸与固紫B反应形成稳定的红色沉淀，加入有机溶剂，充分溶解沉淀物，测定溶液在520纳米的吸光值，根据草酰乙酸标准样品制作的标准曲线即可得到样品草酰乙酸的浓度。
2.如权利要求I所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的有机溶剂指乙醇、丙酮或甲醇中的一种。
3.如权利要求I所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述标准曲线包含低浓度范围和高浓度范围两种，分别为O-ImM和10-100mM。
4.如权利要求I所述的测定草酰乙酸含量的方法，其特征在于所述的固紫B的浓度范围为 2_50mg/mL。
全文摘要
一种用比色法测定生物组织内草酰乙酸含量的方法，利用草酰乙酸与固紫B结合形成红色沉淀物质，加入有机溶剂溶解沉淀后，520nm比色法测定吸光值，根据标准曲线计算样品中草酰乙酸的含量。本发明用草酰乙酸的直接显色反应替换常规方法中的酶联显色，使测定过程更加简便，实用，检测成本也更加低廉。
文档编号G01N21/82GK102680415SQ20111006272
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者丁在松, 周宝元, 黄素华 申请人:中国农业科学院作物科学研究所