专利名称:多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法
技术领域:
本发明涉及一种多位点磷酸化修饰肽段的序贯分离(Sequential Separation)和质谱鉴定方法。该方法利用磁性纳米铁氧体(Magnetic Nanoparticles of Ferrites,mNOF)材料NiZnFe2O4中表面八面体晶格单元金属离子与不同磷酸化修饰肽段亲和能力的差异,以及本身固有的磁性,将复杂生物样品中磷酸化多肽序贯分离为单磷酸化修饰肽段和多位点磷酸化修饰肽段两部分,从而减少或消除离子之间的相互信号抑制,并实现i/ vivo (体内)或in-source (离子源内)单磷酸化修饰多肽的质谱确定。
背景技术:
细胞中大量蛋白质都不仅会发生翻译后磷酸化修饰,而且磷酸化修饰的程度还会随不同生理条件发生不同变化,单磷酸修饰与多位点磷酸化修饰同时并存,参与多种信号 传导通路中生理信号的分级调控。虽然已有的分析方法能有效富集低丰度磷酸化蛋白,但是单磷酸肽段与多磷酸化肽段共存,不仅彼此抑制信号,而且由于磷酸化修饰比多肽骨架更易断裂,因此多位点磷酸化修饰肽段常常产生一系列in-source单磷酸修饰肽段,因此使得i/7 单磷酸化肽段的鉴定难以进行。现有的技术包括IMAC (固定化金属螯合亲和色谱)、金属氧化物、离子交换和免疫亲和法等虽然都能富集磷酸化修饰肽段,但是对单磷酸化修饰和多位点磷酸化修饰却不能区分,只能同时富集。本发明利用磁性铁氧体材料表面八面体晶格单元中的金属离子与单磷酸化肽段和多磷酸化肽段的选择性亲和能力差别,将混合样品分别与不同铁氧体材料结合,实现不同程度磷酸化修饰多肽的序贯分离。具有相似半径的过渡金属离子的掺杂,改变八面体晶格单元的磁场强度和面积,因而改变八面体晶格结合位点金属离子与磷酸基团的结合能力。本发明不仅可以实现低丰度磷酸化修饰肽段的富集,也可使不同程度修饰的肽段序贯分离,因此使得一些因离子共存而被抑制的磷酸化肽段得以被检测,而且也能区分in vivo (体内)或in source (离子源内)单磷酸化修饰肽段,因此拓展了磷酸化蛋白质组学研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多位点磷酸化修饰分析方法。该方法简单,能够对含不同修饰程度的磷酸化肽段进行序贯分离,适合于质谱分析。实现本发明的技术方案一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法,该方法基于磁性纳米铁氧体(mNOF)材料对多位点磷酸化多肽的选择性吸附,及纳米铁氧体材料固有的磁性,在外磁场作用下实现不同程度磷酸化修饰多肽的序贯分离。不同过渡金属掺杂的尖晶石和反尖晶石铁氧体材料对多位点磷酸化多肽的选择性吸附。NiZnFe2O4材料对多位点磷酸化肽段具有高选择性吸附,而Fe3O4, NiFe2O4及ZnFe2O4对单磷酸化修饰肽段具有选择性吸附。具体方法步骤包括化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料,多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集,非特异性吸附清洗,多位点不同程度磷酸化修饰肽段洗脱以及上样分析;
一、化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料,
1)、称取三氯化铁、二氯化铁、硫酸锌和硝酸镍分别置于烧杯中,分别用2M盐酸各配制成IM金属离子溶液;
2)将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液在室温下混合,滴加氨水至pHIf 12,在室温搅拌半小时以上,或者将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液以及5毫升硫酸锌溶液或硝酸镍溶液在室温下混合,滴加氨水至pH If 12,在室温下继续搅拌半小时以上,产生黑色Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料(在外磁场下这些黑色颗粒会移动);
3)取步骤2)得到的Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料,先后用纯水和乙醇清洗3次,并保存于乙醇溶液中,放置于冰箱保存;
二、多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集
1)将保存在乙醇溶液中的Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料取出,放置于离心管,先用含50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸(TFA)溶液清洗3次,再用O. lwt%H氟乙酸水溶液清洗3次;
2)将蛋白酶解液用三氟乙酸调至pHΓ2,加入乙腈和三氟乙酸使其最终含有50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸;
3)将NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料加入步骤2)所得的溶液中,漩涡混合I小时;转移上清液至离心管中,加入Fe3O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时;
4)用磁铁分离步骤3)NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料,Fe3O4磁性纳米铁氧体材料,弃去上清液;
三、非特异性吸附的清洗
1)、将已富集磷酸化多肽的NiZnFe2O4和Fe3O4磁性纳米铁氧体材料,分别用含有50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸的洗涤液清洗3次;
2)、用含O.lwt%三氟乙酸的水溶液再清洗3次;
四、样品洗脱及上样
1)、配制IM磷酸铵溶液,将经过第三步清洗的NiZnFe2O4和Fe3O4磁性纳米铁氧体材料分别悬浮在IM磷酸铵溶液中,漩涡混合3分钟;
2)、分别转移上清液至两个离心管中;
3)、重复步骤I)操作,分别合并两次上清液;
4)、用C18ZipTip除盐,并用含50wt%乙腈、O.lwt%三氟乙酸和IM的2、5 二羟基苯甲酸溶液洗脱样品;
5)、将样品点在样品靶上,进行质谱分析,分别进行MS全扫描和MS/MS分析,并使用MASCOT搜索引擎将MS/MS图谱与NCBInr数据库进行比对,实现磷酸化肽段的鉴定。本发明的方法应用于对蛋白质样品分析,对细胞或组织样品分析。按照蛋白酶质量比=50:1的比例,用胰蛋白酶将已知浓度的标准蛋白酪蛋白或细胞组织蛋白提取物在37°C进行12小时酶解;用于对蛋白质样品分析,分析步骤如下
I)、取蛋白质的酶解液样品,将样品调至pH 1^2,在50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸条件下与NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时,将上清液转移至干净离心管,而将NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料与IM磷酸铵溶液漩涡混合洗脱3分钟,重复两次,合并两次洗脱液;将上清液与Fe3O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时,将上清液移去,而将Fe3O4磁性纳米铁氧体材料与IM磷酸铵溶液漩涡混合洗脱3分钟,重复两次,合并两次洗脱液;
2)、NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料富集多位点磷酸化修饰肽段的磷酸铵洗脱液,Fe3O4磁性纳米铁氧体材料富集单磷酸化修饰 肽段的磷酸铵洗脱液,分别用C18ZipTip除盐,使用移液器将样品分别点于样品靶,等待其自然风干后,放入质谱仪;
3)以激光束轰击样品分子(激光为紫外激光,波长为355nm),多位点磷酸化修饰肽段产生一系列丢失SODa峰,证实了多磷酸基团的存在;而单磷酸化修饰肽段则不能产生或最多产生一个丢失80Da峰;
其中,蛋白质样品为α酪蛋白。对细胞或组织样品分析,分析步骤如下
1)、先用细胞或组织裂解液提取细胞或组织蛋白,用Bradford法进行蛋白质含量的测
定;
2)、按照蛋白酶质量比=50:1的比例,用胰蛋白酶将已知浓度的标准蛋白酪蛋白或细胞组织蛋白提取物在37°C进行12小时酶解;
3)、用O.lwt%三氟乙酸调节步骤2)所得酶解液酸度至pH Γ2,加入乙腈使酶解液中乙腈的终浓度为50wt%,三氟乙酸含量为O. lwt% ;
4)、将IOmg磁性纳米NiZnFe2O4加入步骤3)所得酶解液中,漩涡混合I小时;
5)、用磁铁分离步骤4)所得混合物,弃去上清液,并用50wt%乙腈和O.lwt%三氟乙酸溶液洗涤磁性纳米NiZnFe2O4 3次,将上清液转移至干净离心管;
6)、步骤5)所得磁性纳米NiZnFe2O4中加入IM磷酸铵溶液,漩涡混合洗脱3分钟,保留洗脱液,重复步骤6)两次,合并洗脱液,弃去磁性纳米NiZnFe2O4;
7)、将步骤6)所得洗脱液用三氟乙酸调至pHΓ2,并用ZipTipa8除盐;
8)、称取2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作基质,并用50wt%乙腈和O.lwt%三氟乙酸溶液配制IM的2,5-二羟基苯甲酸溶液;
9)、将步骤7)使用的ZipTipa8用步骤8)所得2,5-二羟基苯甲酸洗脱,使洗脱液点在MALDI样品靶上,自然晾干;
10)、将IOmg磁性纳米Fe3O4加入步骤5)所得上清液,漩涡混合I小时,重复步骤6)、
7)、8)和9)操作,除磁性纳米Fe3O4替代磁性纳米NiZnFe2O4外;
11)、使用质谱仪,分析步骤9)和10)所得样品,分别进行MS全扫描和MS/MS分析,并使用MASCOT搜索引擎将MS/MS图谱与NCBInr数据库进行比对,实现磷酸化肽段的鉴定;
其中,所述的细胞或组织样品为斑马鱼卵细胞。由于按照此法制得的样品单磷酸化修饰和多磷酸化修饰肽段分离,因此减小或消除离子之间的信号抑制,采得的信号稳定。 本发明的效果和优点
I.本发明利用磁性纳米铁氧体材料选择性富集多位点不同程度磷酸化修饰肽段,反应条件温和,无需有毒有害试剂。2.整个操作过程简单易控制,耗能少,产率高,成本低,符合实际生产需要。
3.与现有磷酸化肽段富集技术相比,本发明综合了富集和分离,对多位点磷酸化修饰肽段和单磷酸化修饰肽段能够序贯分离,分离效果好,减少或消除不同程度磷酸化修饰多肽之间的信号抑制,能达到确定i/ vivo或in source单磷酸化修饰肽段的准确鉴定。4.基于新型原理的磷酸化肽段序贯分离技术制作简单、操作容易,背景干扰小,分析速度快。本发明中%含量,均指质量百分含量,除另有说明以外。
图I、是NiZnFe2O4磁性纳米颗粒扫描显微镜形貌照片 图2、是NiZnFe2O4磁性纳米颗粒均匀分散于样品中照片
图3、是均匀分散于样品中的NiZnFe2O4磁性纳米颗粒在外加磁场作用下与样品背景分离的照片
图4是酪蛋白多位点磷酸化修饰肽段的质谱图 图5是酪蛋白单磷酸化修饰肽段的质谱图 图6是斑马鱼卵细胞多位点磷酸化修饰肽段的质谱图 图7是斑马鱼卵细胞单磷酸化修饰肽段的质谱图。
具体实施例方式以下结合实施例进一步对本发明进行说明。实施例I
多位点磷酸化修饰肽段序贯分离及样品质谱分析
1)、称取5 10毫克NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料于离心管中;
2)、将NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料用含有50wt%乙腈和O.lwt%TFA溶液洗涤3次,用磁铁分离纳米颗粒,弃去上清液;
3)、取步骤2)得到的NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体颗粒再用O.lwt%TFA水溶液洗涤3次,用磁铁分离纳米颗粒(NiZnFe2O4磁珠),弃去上清液;
4)、分析样品前,将蛋白在O.IM碳酸氢铵溶液中37° C水浴条件下用胰蛋白酶进行酶解,酶解时间为12小时;
5)、将步骤4)所得酶解液用三氟乙酸(TFA)调节pH广2,加入乙腈和TFA,使其含50wt%乙臆和 O. lwt%TFA ;
6)、将步骤3)所得NiZnFe2O4磁珠加入步骤5)所得溶液中漩涡混合I小时,用磁铁分离NiZnFe2O4磁珠,将上清液转移至干净离心管;
7)、将Fe3O4磁珠加入步骤6)所得上清液,漩涡混合I小时,弃去上清液;
8)、用IM磷酸铵溶液分别洗脱步骤6)和7)所得NiZnFe2O4磁珠,和Fe3O4磁珠漩涡混合3分钟,重复两次,分别合并两次洗脱液;
9)、将步骤8)所得洗脱液分别用C18ZipTip除盐,并用含有50wt%乙腈和O.lwt%TFA以及IM的2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸DHB)的溶液洗脱,得样品液;
10)、将步骤9)所得样品点于MALDI(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱),样品靶,放入质谱仪进行结构鉴定。
实施例2
本发明的方法用于鉴定斑马鱼卵磷酸化蛋白
I)、将斑马鱼卵细胞用O.675%盐水清洗,加入玻璃组织匀浆器,并与细胞裂解液(裂解液由Tris-HCl和NaCl组成缓冲溶液,并含去污剂O. 1% SDS和O. 5mM酶抑制剂苯甲基磺酰氯PMSF )混合。2)、用Bradford法测定鱼卵蛋白含量;
3)、将蛋白双硫键用二硫苏糖醇还原,并用碘代乙酰胺衍生,然后采用蛋白酶=50:1的质量比例,在37° C水浴条件下进行胰蛋白酶解;
4)、制备或购买磁性纳米铁氧体材料NiZnFe204磁珠和Fe3O4磁珠;5)、将步骤4)所得的NiZnFe2O4磁珠和Fe3O4磁珠用含50wt%乙腈和O.lwt%TFA的洗涤液清洗3次,再用O. lwt%TFA水溶液清洗3次;
6)、将步骤3)所得斑马鱼卵的胰蛋白酶裂解液调节pH=1 2后;加入乙腈和TFA使其终浓度含50wt%乙腈和O. lwt%TFA;
7)、将步骤5)所得NiZnFe2O4磁珠加入步骤6)所得混合物中,漩涡混合I小时,用磁铁分离NiZnFe2O4磁珠,而将上清液转移至离心管;
8)、将步骤5)所得Fe3O4磁珠加入步骤7)所得上清液中,漩涡混合I小时,用磁铁分离Fe3O4磁珠,弃去上清液;
9)、用含50wt%乙腈和O.lwt%TFA的洗涤液清洗步骤7)和8)所得NiZnFe2O4磁珠和Fe3O4磁珠3次,再用含O. lwt%TFA的水溶液清洗3次;
10)、将IM磷酸铵溶液分别加入步骤9)所得NiZnFe2O44磁珠和Fe3O4磁珠,漩涡混合洗脱3分钟,重复两次,分别合并NiZnFe2O44磁珠和Fe3O4磁珠洗脱液;
II)、将步骤10)所得洗脱液用TFA调至pHΓ2,并用C18ZipTip除盐;
12)、用含有50wt%乙腈和O.lwt%TFA以及IM的2,5- 二羟基苯甲酸的溶液洗脱步骤11)所使用的C18ZipTip,并将样品点在MALDI样品靶;13)、质谱分析实验,将样品靶放入质谱仪(SYNAPTG2 HDMS,WATERS, USA),将紫外激光的频率调节为200HZ。各种不同类型的磷酸化多肽都得到了很好的除盐效果,实验证明单磷酸化修饰和多位点磷酸化修饰肽段得到较好分离,标准蛋白的磷酸化修饰位点覆盖率为100%,质谱图信噪比高,背景干扰少。
权利要求
1.一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法,其特征在于,该方法基于NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料对多位点磷酸化多肽的选择性吸附,及纳米铁氧体材料固有的磁性,在外磁场作用下实现不同程度磷酸化修饰多肽的序贯分离,方法步骤包括化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料,多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集,非特异性吸附清洗,多位点不同程度磷酸化修饰肽段洗脱以及上样分析; 一、化学共沉淀制备不同磁性纳米铁氧体材料, 1)、称取三氯化铁、二氯化铁、硫酸锌和硝酸镍分别置于烧杯中,分别用2M盐酸各配制成IM金属离子溶液; 2)将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液在室温下混合,滴加氨水至pHIf 12,在室温搅拌半小时以上,或者将10毫升三氯化铁溶液与5毫升二氯化铁溶液以及5毫升硫酸锌溶液或硝酸镍溶液在室温下混合,滴加氨水至pH If 12,在室温下继续搅拌半小时以上,产生黑色Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料; 3)取步骤2)得到的Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料,先后用纯水和乙醇清洗3次,并保存于乙醇溶液中,放置于冰箱保存; 二、多位点不同程度磷酸化修饰肽段富集 1)将保存在乙醇溶液中的Fe3O4或NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料取出,放置于离心管,先用50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸溶液清洗3次,再用O. lwt%三氟乙酸水溶液清洗3次; 2)将蛋白酶解液用三氟乙酸调至pHΓ2,加入乙腈和三氟乙酸使其最终含有50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸; 3)将NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料加入步骤2)所得的溶液中,漩涡混合I小时;转移上清液至离心管中,加入Fe3O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时; 4)用磁铁分离步骤3)NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料,Fe3O4磁性纳米铁氧体材料,弃去上清液; 三、非特异性吸附的清洗 1)、将已富集磷酸化多肽的NiZnFe2O4和Fe3O4磁性纳米铁氧体材料,分别用含有50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸的洗涤液清洗3次; 2)、用含O.lwt%三氟乙酸的水溶液再清洗3次; 四、样品洗脱及上样 1)、配制IM磷酸铵溶液,将经过第三步清洗的NiZnFe2O4和Fe3O4磁性纳米铁氧体材料分别悬浮在IM磷酸铵溶液中,漩涡混合3分钟; 2)、分别转移上清液至两个离心管中; 3)、重复步骤I)操作,分别合并两次上清液; 4)、用C18ZipTip除盐,并用含50wt%乙腈、O.lwt%三氟乙酸和IM的2、5 二羟基苯甲酸溶液洗脱样品; 5)、将样品点在样品靶上,进行质谱分析,分别进行MS全扫描和MS/MS分析,并使用MASCOT搜索引擎将MS/MS图谱与NCBInr数据库进行比对,实现磷酸化肽段的鉴定。
2.如权利要求I所述的一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法的应用,其特征在于,用于对蛋白质样品分析,分析步骤如下 I)、取蛋白质的酶解液样品,将样品调至pH 1^2,在50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸条件下与NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时,将上清液转移至干净离心管,而将NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料与IM磷酸铵溶液漩涡混合洗脱3分钟,重复两次,合并两次洗脱液;将上清液与Fe3O4磁性纳米铁氧体材料漩涡混合I小时,将上清液移去,而将Fe3O4磁性纳米铁氧体材料与IM磷酸铵溶液漩涡混合洗脱3分钟,重复两次,合并两次洗脱液; 2)、NiZnFe2O4磁性纳米铁氧体材料富集多位点磷酸化修饰肽段的磷酸铵洗脱液,Fe3O4磁性纳米铁氧体材料富集单磷酸化修饰肽段的磷酸铵洗脱液,分别用C18ZipTip除盐,使用移液器将样品点于样品靶,等待其自然风干后,放入质谱仪; 3)以激光束轰击样品分子,激光波长为355nm,多位点磷酸化修饰肽段产生一系列丢失SODa峰,证实了多磷酸基团的存在;而单磷酸化修饰肽段则不能产生或最多产生一个丢失80Da峰; 其中,蛋白质样品为α酪蛋白。
3.如权利要求I所述的一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法的应用,其特征在于,用于细胞或组织样品分析,分析步骤如下 1)、先用细胞或组织裂解液提取细胞或组织蛋白,用Bradford法进行蛋白质含量的测定; 2)、按照蛋白酶质量比=50:1的比例,用胰蛋白酶将已知浓度的标准蛋白酪蛋白或细胞组织蛋白提取物在37°C进行12小时酶解; 3)、用O.lwt%三氟乙酸调节步骤2)所得酶解液酸度至pH Γ2,加入乙腈使酶解液中乙腈的终浓度为50wt%,三氟乙酸含量为O. lwt% ; 4)、将IOmg磁性纳米NiZnFe2O4加入步骤3)所得酶解液中,漩涡混合I小时; 5)、用磁铁分离步骤4)所得混合物,弃去上清液,并用50wt%乙腈和O.lwt%三氟乙酸溶液洗涤磁性纳米NiZnFe2O4 3次,将上清液转移至干净离心管; 6)、步骤5)所得磁性纳米NiZnFe2O4中加入IM磷酸铵溶液,漩涡混合洗脱3分钟,保留洗脱液,重复步骤6)两次,合并洗脱液,弃去磁性纳米NiZnFe2O4; 7)、将步骤6)所得洗脱液用三氟乙酸调至pHΓ2,并用ZipTipa8除盐; 8)、称取2,5-二轻基苯甲酸作基质,并用50wt%乙腈和O. lwt%三氟乙酸溶液配制IM的2,5-二羟基苯甲酸溶液; 9)、将步骤7)使用的ZipTipa8用步骤8)所得2,5-二羟基苯甲酸洗脱,使洗脱液点在MALDI样品靶上,自然晾干; 10)、将IOmg磁性纳米Fe3O4加入步骤5)所得上清液,漩涡混合I小时,重复步骤6)、7)、8)和9)操作,除磁性纳米Fe3O4替代磁性纳米NiZnFe2O4外; 11)、使用质谱仪,分析步骤9)和10)所得样品,分别进行MS全扫描和MS/MS分析,并使用MASCOT搜索引擎将MS/MS图谱与NCBInr数据库进行比对,实现磷酸化肽段的鉴定; 其中,所述的细胞或组织样品为斑马鱼卵细胞。
全文摘要
一种多位点磷酸化修饰肽段序贯分离质谱鉴定方法。它以尖晶石和反尖晶石型磁性纳米铁氧体材料为分离基质,利用这些材料中处于八面体结合位点的金属离子与不同磷酸化修饰多肽配位能力的差异,及其固有的磁性,在外磁场作用下实现与复杂样品背景的快速分离。本发明所涉及的磁性纳米铁氧体材料能将复杂多肽混合物分离为非磷酸化肽段、单磷酸化肽段以及多位点磷酸化修饰肽段,减少或消除了不同样品分子之间的信号抑制,能够有效区分体内或离子源内单磷酸化修饰肽段,信噪比高,干扰小。本方法简单,不需要复杂的仪器即可有效富集低丰度磷酸化多肽,实现多位点磷酸化修饰的序贯分离和质谱鉴定,样品分析操作简单,无需复杂的样品前处理。
文档编号G01N27/62GK102818836SQ20121027652
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者钟鸿英, 肖潇, 胡雪娇, 郑石, 黄璐璐 申请人:华中师范大学