专利名称：一种a、c型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及脑膜炎奈瑟菌的检测，具体是ー种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术：
脑膜炎奈瑟菌是ー种革兰氏阴性双球菌，通过呼吸道传染引起的流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)是ー种对人类危害严重的传染性疾�。送饣箍梢鹁�、肺炎、关节炎、結膜炎、心肌炎、泌尿系统等多种炎症，是ー种常见和多发疾病。脑膜炎奈瑟球菌可分为A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W135共13个血清群，对人类致病的多属A、B、C群，其他类群在带菌者中经常发现，但很少致病。我国的流脑流行菌群仍以A群为主，但近年来也发人群中的绝大多数人对脑膜炎奈瑟球菌易感，该菌可寄生于正常人的鼻咽腔内，处于这种寄 生状态的细菌并不导致任何病理变化，亦不引起任何疾病症状；但这种带菌状态可以持续I周到数月之久，这种处于潜伏感染状态的带菌者在人群中的比例可高达50% 85%。人群中的带菌者是造成流行性脑脊髄膜炎流行的最重要的传染源，由于脑膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群较为密集的场所，容易造成细菌的高效率的传播，特别是在儿童、中小学生为最易感人群，极易在短时间内造成儿童发病流行，所以，控制人群中的带菌者传染源成为控制流脑流行的重要环节之一。目前国内市场上脑膜炎奈瑟菌的各种免疫诊断试剂盒质量參差不齐，既无统ー的质量标准，又在无序生产与应用，给脑膜炎奈瑟菌的预防和诊治造成严重障碍。目前虽有国外试剂商提供同类商品化诊断试剂盒用于检测，但是此种试剂盒价格十分昂贵，限制了临床的广泛使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和缺陷，本发明的目的是提供ー种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒及其制备方法，即可用于脑膜炎奈瑟菌全菌的定性和定量的检测。为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下ー种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，由A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、酶标ニ抗、洗漆液、底物液、终止液构成,具体组份为(I)、标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液；(2)、洗涤液含有0. 05%Tween20的磷酸盐缓冲液；(3)、酶标ニ抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；(4)、底物液TMB-H000尿素溶液；(5)，终止液2mol/LH2S04 溶液；所述A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板通过如下步骤制得(I)、在96孔酶标板的每孔内加入0. IMNaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，于37°C温箱中放置80-90分钟,然后用去离子水洗漆96孔酶标板3-5次,甩干,备用；(2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按I :1000 1100的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105ul ;然后于37°C温箱中烘干10-18小时；(3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200uL用PBS稀释的10%小牛血清的填满，然后于35-38°C下封闭1-2小吋，即得抗原包被酶标反应板；其中，所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为3X 109cfu/mL。制备上述A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，包括制备A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板和配置其标本稀释液、酶标ニ抗、洗涤液、底物液、终止液；其中
所述A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板通过如下步骤制得(I)、在96孔酶标板的每孔内加入0. IMNaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，于37°C温箱中放置80-90分钟,然后用去离子水洗漆96孔酶标板3-5次,甩干,备用；(2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按I :1000 1100的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105ul ;然后于37°C温箱中烘干10-18小时；(3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200uL用PBS稀释的10%小牛血清的填满，然后于35-38°C下封闭1-2小吋，即得抗原包被酶标反应板；其中，所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为3X 109cfu/mL。作为ー种优选方案，所述的标本稀释液中2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液是由 NaC18. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、硫柳汞 0. lg，加双蒸水至lOOOmL，调至 pH7.4 制得；所述的洗涤液是由NaC18. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、Tween-200. 5ml、硫柳萊0. lg、加双蒸水至1000ml,调至pH7. 4制得；所述的底物液是经200mg3、3’、5、5’ 一四甲基联苯胺、IOOml无水こ醇、加双蒸水至1000ml得底物液A ；Na2HPO414. 60g、朽1檬酸9. 33g、0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml、加双蒸水至1000ml，调至pH5. (T5. 5得底物液B ;将底物液A和底物液B按I : I I. 5的体积比混合制得；所述的终止液是由IOOml浓硫酸缓慢滴加引入600ml双蒸水中不断搅拌，然后加双蒸水至900ml制得。本发明提供试剂盒的检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为98%，特异度为99. 7%。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步阐明本发明。应理解，下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。实施例(I)、试剂包被液(0.05mol/L,pH9. 6 的碳酸钠_碳酸氢钠缓冲液)=Na2CO3L 5g、NaHC032. 9g、Na2N3O. 2g,加双蒸水至 1000ml,调至 pH9. 6 ；标本稀释液(含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)pH7. 4)，PBS :由 NaC18. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、硫柳汞 0. lg，加双蒸水至lOOOmL，调至pH7. 4，即得；封闭液(10%小牛血清IPRS溶液)小牛血清100ml XPBS (pH7. 4) 900ml ；洗涤液(PBST,pH7. 4):由 NaC18. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、Tween200. 5ml、硫柳萊 0. lg、加双蒸水至 1000ml,调至 pH7. 4 ；酶标ニ抗(HRP*鼠抗人IGM单抗)辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；底物液(TMB-H202尿素溶液) ①底物液A(3、3’、5、5’ -四甲基联苯胺，TMB) :TMB200mg，无水こ醇100ml，加双蒸水至 IOOOrnl ②底物液B缓冲液(0. Imol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷酸氢ニ钠缓冲液，pH5. 0
5.4) Na2HP0414. 60g,梓檬酸9. 33g, 0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml,加双蒸水至1000ml,调至pH5. 0-5. 5 ；⑧将底物液A和B按I : I或I : I. 5混合，即成TMB-H000尿素溶液。终止液(2mol/LH2S04溶液)双蒸水600ml，浓硫酸IOOml (缓慢滴加并不断搅拌)，加双蒸水至900ml。(2)、主要仪器酶标仪BI0_RADModel550；ELISA 反应板Comning Incorporated costar96ffellEIA/RIA plate。(3)、方法酶标ニ抗最适滴度的选择取96孔酶标板ー块，用100ng/ml人IgMlOOull孔4°C包被过夜，洗涤液洗板3次，350ul/孔，甩干；将酶标抗人IgM单抗用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，IOOull孔，37°C孵育40min，后用洗板3次，350ul/孔，甩干；加底物显色，每孔加入底物液100ul，37°C或室温避光显色15分钟；后加入终止液50U1终止反应、，在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值，取A值在I. 0时的酶标抗体稀释度，作为酶标ニ抗的最适滴度为 I 1000 1100。棋盘滴定法选择包被抗原最适滴度取96孔酶标板ー块；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，37°C温箱放置I小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟菌A与C型(2X109cfu/mL)等体积混合后，用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，每孔IOOuL ;37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200uLPBS稀释的10%小牛血清37°C封闭I. 5小时，得到梯度稀释抗原包被酶标反应板；将强阳性參考血清、弱阳性參考血清和阴性參考血清用标本稀释液按I :100倍稀释，加样，保温，洗涤。加按最适滴度稀释的酶标抗人IgM单抗，保温，洗涤。加底物显色，加酸终止反应后在酶标仪上读取450nm波长处吸光度，即A值；选择强阳性參考血清的A值为0. 8 I. 0间、阴性參考血清的A值小于0. 2的包被抗原的稀释度作为最适滴度，本试剂盒最适包被A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原的稀释度为2X105cfu/ml, IOOul/ 孑し。A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被反应板的制备方法取96孔酶标板一块；每孔加入0. Imol/L的NaHCO3稀释的5%戊ニ醛200ul，37°C温箱放置I小时；去离子水洗涤96孔酶标板4次，甩干；将脑膜炎奈瑟球菌A与C型(3X109cfu/ml)等体积混合后，用包被液I :1000 1100稀释包板，每孔IOOuL ;37°C温箱过夜烘干；取过夜烘干的抗原包被板加200ulPBS稀释的10%小牛血清37°C封闭I. 5小吋，得到抗原包被酶标反应板；脑膜炎奈瑟菌IgMELISA检测试剂盒，由上述脑膜炎奈瑟球菌全菌包被酶标反应板、标本稀释液、洗漆液、酶标ニ抗、底物液、终止液及參考血清构成。
具体分为标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人I gG的0. 0IMpH7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)；洗涤液含有0. 05%Tween20 的 0. 01mol/LpH7. 4 的磷酸盐缓冲液(PBST)；酶标ニ抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗；底物液TMB-H000尿素溶液；终止液2mol/LH2S04溶液。利用上述试剂盒采用ELISA法检测血清中脑膜炎奈瑟菌IgM抗体(I)待检血清，加入用标本稀释液I :100稀释的待检血清到包被好的酶标反虚板，IOOuL/孔，同时另设两孔分别加入强阳性參考血清和阴性參考血清IOOuL/孔，37°C孵育I小时，洗涤液洗板3次，350ul/孔，甩干；(2)加酶标物，加入HRP (辣根过氧化酶)标记的鼠抗人IGM单抗，IOOuL/孔，37°C孵育40min，洗涤液洗板3次，350ul/孔，甩干；(3)显色，用洗涤液洗板后每孔加入底物液100uL，37°C或室温避光显色15分钟；(4)每孔加入终止液50UL，终止反应；(5)结果判断，空白孔调零，读取450nm波长处吸光度，即0D450值，强阳性參考血清的A值需> 0. 9、阴性參考血清的A值需〈O. 2则证明试剂盒结果正确。(6)计算结果，将待检标本血清平均OD值(P)除以阴性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N彡2. I为阳性，P/N<2. I为阴性。特异性实验以脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IGM阳性血清、こ型脑炎病毒阳性血清、麻疹病毒IgM阳性血清、风疹病毒IGM阳性血清、人巨细胞病毒阳性血清和脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM ;阴性血清采用A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板ELISA诫剂盒检测，P/N值分别为
6.17、I. 13、I. 17、I. 16和I. 08，说明该试剂盒特异性良好。重复性实验随机抽取20份脑膜炎奈瑟菌A+C型标准IgM阳性、阴性血清分别于不同的时间进行ELISA重复检測，同一份血清检测结果的P/N值上下浮动均不超过0. 05，变异系数均〈5%，证明该试剂盒具有良好的稳定性和重复性。临床标本检测
采用美国R&D公司流脑A+C型IgM ELISA检测试剂盒检测576例正常人血清血清，其中IgM抗体阳性40例，阴性434例，采用A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板法检测结果与R&D公司流脑A+C型IGMELISA检测试剂盒相比灵敏度为95%，特异度为99. 5%，具体结果如表I所示。表I两种试剂盒IgM检测结果比较
R&D公rfj流脑实施例厨得试麵盒fH卜A+C 型 I式齐Ij倉；+- +59I60
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合诗60516576结果表明，本发明提供给的试剂盒计算灵敏度为98%，特异度为99. 7%。最后有必要在此说明的是以上实施例只用于对本发明的技术方案作进ー步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒，其特征在于它由A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、酶标ニ抗、洗漆液、底物液、终止液构成，具体组份为 标本稀释液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液； 洗涤液含有0. 05%Tween20的磷酸盐缓冲液； 酶标ニ抗辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgM单抗； 底物液TMB-H000尿素溶液； 终止液2mol/LH2S04溶液； 所述A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板通过如下步骤制得 1)、在96孔酶标板的每孔内加入0.IMNaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，于37°C温箱中放置80-90分钟,然后用去尚子水洗漆96孔酶标板3-5次,甩干,备用； 2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按I:1000 1100的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105U1 ;然后于37°C温箱中烘干10-18小时； 3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200uL用PBS稀释的10%小牛血清的填满，然后于35-38°C下封闭1-2小吋，即得抗原包被酶标反应板； 其中，所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为3X 109cfu/mL。
2.ー种制备权利要求I所述的A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，包括制备A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板和配置其标本稀释液、酶标ニ抗、洗涤液、底物液、終止液；其特征在干 所述A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板通过如下步骤制得 (1)、在96孔酶标板的每孔内加入0.IMNaHCO3稀释的5%戊ニ醛200uL，于37°C温箱中放置80-90分钟,然后用去尚子水洗漆96孔酶标板3-5次,甩干,备用； (2)、将A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌等体积混合后，用包被液按I:1000 1100的体积比稀释后，包被处理后的96孔酶标板，每孔95-105ul ;然后于37°C温箱中烘干10-18小时； (3)、取过夜烘干的抗原包被96孔酶标板用200uL用PBS稀释的10%小牛血清的填满，然后于35-38°C下封闭1-2小吋，即得抗原包被酶标反应板； 其中，所述的A型脑膜炎奈瑟菌和C型脑膜炎奈瑟菌的浓度为3X 109cfu/mL。
3.根据权利要求2所述的制备A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，其特征在于所述的标本稀释液中2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸盐缓冲液是由NaC18. 0g、KH2PO4O. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、硫柳汞 0. lg，加双蒸水至 lOOOmL，调至 pH7. 4 制得。
4.根据权利要求2所述的制备A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，其特征在于所述的洗涤液是由 NaC18. 0g、KH2P040. 2g、Na2HPO4. 12H202. 9g、KC10. 2g、Tween-200. 5ml、硫柳萊0. lg、加双蒸水至1000ml,调至pH7. 4制得。
5.根据权利要求2所述的制备A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，其特征在干所述的底物液是经200mg3、3’、5、5’ 一四甲基联苯胺、IOOml无水こ醇、加双蒸水至IOOOrnl得底物液A ；Na2HPO414. 60g、朽1檬酸9. 33g、0. 75%过氧化氢尿素6. 4ml、加双蒸水至IOOOrnl，调至pH5. (T5. 5得底物液B ;将底物液A和底物液B按I : I I. 5的体积比混合制得。
根据权利要求2所述的制备A、C型脑膜炎奈瑟菌酶联诊断试剂盒的方法，其特征在于所述的终止液是由IOOml浓硫酸缓慢滴加引入600ml双蒸水中不断搅拌，然后加双蒸水至900ml制得。
全文摘要
本发明公开了一种A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原酶联诊断试剂盒，包括由A、C型脑膜炎奈瑟菌抗原包被酶标反应板、标本稀释液、酶标二抗、洗涤液、显色液、终止液构成。本发明提供试剂盒的检测结果与美国R&D试剂盒脑膜炎奈瑟菌A+C型IgM ELISA检测试剂盒的一致性高，灵敏度为98%，特异度为99.7%。
文档编号G01N33/577GK102854318SQ20121027164
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者吴克 申请人:吴克
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