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专利名称：一种检测伏马菌素的化学发光试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明公开一种伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于免疫检测领域。
背景技术：
伏马菌素(Fumonisins)是20世纪80年代末期发现的一类主要由串珠镰刀菌 (Fusarium Moniliforme)产生的真菌毒素，到目前为止，已经发现包括伏马菌素有伏马菌素Bl (FBI)、伏马菌素B2 (FB2)和伏马菌素B3 (FB3)等在内的11种，其中FBl是污染玉米或串珠镰刀菌培养物中伏马菌素的主要组分，也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。FBl 相对分子质量为721. 83。在众多的真菌毒素中，伏马菌素被认为是对人、畜健康威胁较严重的真菌毒素之一，它广泛存在于世界范围的玉米及其制品中，与人类食管癌的高发率有关， 可引起马脑白质软化症(ELEM)，猪肺水肿症候群(PPE)、并具有致癌活性。许多动物实验证明，它可引起实验动物的肝、肾损伤。因此其在食品卫生领域中越来越受到人们的重视，是一种具有重大卫生学意义的真菌毒素，已被国际癌症研究中心(IARC)列入人类可能的致癌物名单。自伏马菌素被发现后，立刻引起世界各国的广泛重视，相继建立了各种检测方法， 对伏马菌素在食品中的污染状况进行了广泛的调查，一些国家相继制定了伏马菌素在食品及饲料中的限量标准。目前我国尚未建立伏马菌素的限量标准。检测伏马菌素的方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis)、气/质联用法(GC/MQ、液体二次离子探针质谱法(Liquid- SMQ、放射免疫检测技术(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。HPLC法和毛细管电泳法等仪器分析方法具有较高的灵敏度和特异性，但是需要复杂的提取净化步骤和较贵重的仪器，不易推广使用。ELISA方法虽具有简单、快速、灵敏的特点，也适宜大规模的筛查工作，但其灵敏度有一定的制约。本发明提供的伏马菌素化学发光酶联免疫检测试剂盒，通过检测发光底物产生的光信号代替ELISA方法中的显色底物，提高了检测的灵敏度， 具有特异，快速，可靠的特点。

发明内容
本发明提供了一种伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，具有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等特点，可用于谷物等粮食及其制品中伏马菌素的检测。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理，在间接竞争ELISA 的基础上，将免疫分析法与化学发光法相结合而实现的。本发明检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括已包被的发光板、标准品、酶标羊抗小鼠IgG、伏马菌素单克隆抗体、化学发光底物液、稀释液、10倍浓缩的洗涤液。其中所述发光板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被有伏马菌素与卵清蛋白偶联物制成的包被抗原，其包被浓度为0. 25mg/L。所述伏马菌素系列标准溶液浓度分别是0、0. 1,0. 5,2. 5、12. 25,61. 25Pg/L。所述酶标羊抗小鼠IgG为商品化原液，其工作浓度为1 :5000。所述伏马菌素单克隆抗体是由伏马菌素FBl与血蓝蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠获得的单克隆抗体，该抗体与伏马菌素FB2、FB3的交叉反应率398%和56%。其工作浓度为 1 :20000。所述发光液是增强型鲁米诺化学发光底物液，分试剂A(含有发光增强剂的鲁米诺化学发光底物溶液)和B (过氧化氢溶液)，临用时1 :1混合。所述稀释液为含有0. 5%BSA的磷酸盐缓冲液(0. 01M, pH7. 4)。所述10倍浓缩的洗涤液为0. IM的磷酸盐缓冲液(含有0. 5%吐温-20)。本发明试剂盒最大检测范围为0. 1 61. 25 Pg/L。试剂盒中涉及的试剂主要成份及配制方法如下 1.稀释液0. 5%BSA-PBS
KH2PO4OJg
NaaHPO412H2O2.9g
NaClSJg
KCl0.2g
牛血滑0蛋白(BSA) 0.5g
去离子水溶解，调节pH至7.4并定容値IL
2. 10倍浓缩洗涤液
权利要求
1.一种检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括已包被的发光板、标准品、 酶标羊抗小鼠IgG、伏马菌素单克隆抗体、化学发光底物液、稀释液、10倍浓缩的洗涤液其中，发光板为吸附有伏马菌素与卵清蛋白(OVA)偶联物的可拆96孔不透明白色发光板，偶联物包被浓度为0. 25mg/L ；标准品浓度为 0,0. 1,0. 5,2. 5、12. 25,61. 25ug/L 的甲醇=PBS (7 :93，ν/ν) 化学发光底物液为鲁米诺和过氧化氢溶液两部分按1 :1混合 稀释液为含有0. 5%BSA的磷酸盐缓冲液(0. 01M, pH7. 4) 10倍浓缩的洗涤液为0. IM的磷酸盐缓冲液(含有0. 5%吐温-20)。
2.根据权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)抗原的制备采用戊二醛法将伏马菌素分别与血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原；2)单克隆抗体的制备取Balb/c小鼠，采用足垫免疫并取胭淋巴结，常规融合法制备单克隆抗体；3)化学发光酶免疫检测方法的建立将包被抗原用包被液稀释并纵向包被发光板，用洗液洗涤拍干；加入稀释的伏马菌素单克隆抗体，洗板；加入1 :5000稀释的酶标羊抗小鼠IgG，洗板；加入现配的发光底物溶液，ΙΟΟμ ν孔，测定发光值；以发光值随包被抗原浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定；4)试剂盒的组装包被有包被抗原的发光板发光板为96孔可拆不透明白色发光板，已包被有伏马菌素与卵清蛋白偶联物制成的包被抗原，其包被浓度为0. 25mg/L ； 伏马菌素系列标准溶液； 酶标羊抗小鼠IgG 伏马菌素单克隆抗体发光液增强型鲁米诺化学发光底物液，试剂A (含有发光增强剂的鲁米诺化学发光底物溶液)和B (过氧化氢溶液)单独分装，临用时1 :1混合； 稀释液0. OlM的磷酸盐缓冲液(含有0. 5%BSA, pH7. 4)； 洗涤液0. IM的磷酸盐缓冲液(为10倍浓缩液，含有0. 5%吐温-20)； 发光板取96孔不透明白色发光板，将包被抗原用包被液稀释至0. 25mg/L，每孔内加入lOOPL，4°C 24h,用洗液洗涤3次，250μ 7孔，3min/次，在吸水纸上拍干；用铝箔袋真空密封保存。
全文摘要
本发明涉及一种检测伏马菌素的化学发光酶联免疫检测试剂盒，其特征在于发光板为吸附有伏马菌素与卵清蛋白(OVA)偶联物的可拆96孔不透明白色发光板，偶联物包被浓度为0.25mg/L；标准品浓度为0、0.1、0.5、2.5、12.25、61.25ug/L的甲醇PBS(793，v/v)化学发光底物液为鲁米诺和过氧化氢溶液两部分按11混合稀释液为含有0.5%BSA的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4)10倍浓缩的洗涤液为0.1M的磷酸盐缓冲液(含有0.5%吐温-20)。具有灵敏度高，特异性强，操作简单方便等特点，可用于谷物等粮食及其制品中伏马菌素的检测。
文档编号G01N33/543GK102478577SQ20101056594
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘国文, 唐佳佳, 孔涛, 张燚, 李冬娜, 李小兵, 李岩松, 杨威, 柳增善, 王哲 申请人:吉林大学