专利名称：一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明属于电化学酶联免疫测试技术领域。特别涉及一种基于电化学酶联免疫测 试技术的牙根吸收早期诊断的一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置。
背景技术：
大多数患者在正畸过程中都会出现轻度牙根吸收，矫治结束后不会出现牙齿松 动。但是少数患者会出现严重的牙根吸收，牙齿会出现松动甚至脱落；正畸牙根吸收是正 畸治疗的主要并发症。如果能够及早诊断出牙根吸收，可以防止患者牙齿松动加重或脱落。 目前主要使用曲面断层、根尖片、CT等影像学方法诊断牙根吸收，迫切需要寻找一种更为敏 感、安全、及时的新方法实现对牙根吸收的早期诊断、早期预防。无创性生化方法是近年来 牙根吸收诊断方法的新方向。主要的实验依据是牙根吸收患者口腔龈沟液中牙本质磷蛋白 抗原的量会增加，通过酶联免疫检测法(ELISA)测定其中牙本质磷蛋白(DPP)含量变化可 间接诊断牙根吸收。与传统的影像学方法相比，ELISA法具有敏感性高、辐射损伤性小、可 以实现实时监控等优点，在牙根吸收的临床诊断中具有良好的应用前景。目前主要使用的 分光光度酶联免疫法检测牙本质磷蛋白含量变化，该方法原理简单，仪器价格便宜，可以目 测得到结果，并且仪器的自动化程度高，是一种成熟的检测手段。但是，由于龈沟液样品量 少，待测液中的有效成分更是�：保苣驯Ｖっ噶宓木恍院屯腹庑裕褂梅止夤舛确ㄏ� 制了测定的精密度和检测限，容易出现假阴性结果，目前尚没有解决上述问题的有效方法。
发明内容
本发明的目的是针对传统分光光度酶联免疫方法检测限低、精度差，无法满足牙 本质磷蛋白的精确检测要求而提供一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置。其特征在于所 述牙本质磷蛋白的检测方法是基于电化学酶联免疫的测定法；包括牙本质磷蛋白的提取 及纯化和电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白的含量两个步骤；1)牙本质磷蛋白的提取和纯化采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙 本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯取样前，首先清洁口腔牙面并吹干，将吸 潮试纸尖端紧贴于牙齿的颊舌侧牙面的龈沟边缘，放置30秒以上，取出后放入离心密封管 作待测样品，并于-70°C保存；待测样品提纯是在待测样品中加入20μ 1蛋白提取液，冰浴 20 30分钟，于4°C下15000转/分钟离心10分钟后，提取20 μ 1上清液，加入等量蛋白 上样液，煮沸并冷却，于-20°C保存待测；2)电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白含量a.基于“双抗体夹心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质 磷蛋白的精确含量；酶联免疫反应过程为将兔抗牙本质磷蛋白抗体吸附到以聚苯乙烯容器 作为固相载体上，孵育后洗涤除去未吸附的抗体；加入含有待测牙本质磷蛋白的抗原样品， 使之与吸附于固相载体上的兔抗牙本质磷蛋白抗体反应，孵育后洗涤除去未反应的样品； 加入辣根过氧化物酶标记的特异性牙本质磷蛋白抗体与待测牙本质磷蛋白的抗原反应，形成所谓“双抗体夹心抗原”结构，此时酶与双抗体夹心抗原之间形成等量关系；最后加入主 要成分包括邻氨基酚和过氧化氢的底物，在酶催化下，底物邻氨基酚和过氧化氢反应生成 可进行电化学方法精确测定的产物氨基吩噁嗪；b. “电化学”测试法为主要成分包括邻氨基酚和过氧化氢的底物溶液在辣根过氧 化物酶催化下，过氧化氢将邻氨基酚氧化生成产物氨基吩噁嗪，氨基吩噁嗪在汞电极上发 生还原反应，其反应电流的大小与氨基吩噁嗪的量呈正比定量关系，进而与辣根过氧化物 酶的量在0. 01 X 10-9-4X 10_9g/ml浓度范围内呈I = 22. 6-5. 51og2X关系，式中I为反应电 流的大小，单位为微安μ A，X为辣根过氧化物酶的含量，单位为纳克每毫升ng/ml，则通过 测定上述反应电流的大�。舛ò被試f嗪的量，进而测定辣根过氧化物酶的量，进而测定 待测样品中牙本质磷蛋白的量。所述孵育后洗涤除去未吸附的抗体是用包被缓冲液将兔抗牙本质磷蛋白抗体 (如CSB-P10111Rb-h，武汉华美生物工程有限公司产品)稀释至蛋白质含量为1 10 μ g/ ml，优选5μ g/ml。在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C过夜，以使抗体与固相载体充分吸附。次 日，弃去容器内溶液，用洗涤缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去未发生吸附的抗体；其中包 被缓冲液为PH9. 6的碳酸盐缓冲液，其配制方法为1. 59g碳酸钠Na2CO3与2. 93g碳酸氢钠 NaHCO3溶解于蒸馏水中并稀释至IOOOml配制而成。所述孵育后洗涤除去未反应的样品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀 释液，稀释的待测牙本质磷蛋白抗原样品，于37°C孵育1小时，使固相载体上的兔抗牙本质 磷蛋白抗体与待测牙本质磷蛋白抗原充分结合。用洗涤缓冲冲洗三次，每次三分钟，洗去待 测牙本质磷蛋白抗原样品中的未反应的样品；其中牛血清蛋白稀释液是由0. Ig牛血清蛋 白溶解于IOOOml蒸馏水中稀释配制而成。所述形成所谓“双抗体夹心抗原”结构是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋 白稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记牙本质磷蛋白抗体，于37°C孵育1小时，使酶标牙本 质磷蛋白抗体16与牙本质磷蛋白抗原15充分结合，形成所谓“双抗体夹心”结构，用洗涤 缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去其他成分。一种基于电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白的装置。该装置 包括了电解池1、检测仪表3和储汞瓶9串联构成，外加电源2与检测仪表3连接；所述电解池为以聚苯乙烯容器作为固相载体7内装入待测溶液6，工作电极4在待 测溶液6液面以下、参比电极5为具有恒定电位的饱和甘汞电极，饱和甘汞电极的顶端浸泡 在待测溶液6液面以下；参比电极5与外加电源2正极连接，检测仪表3的电压表连接外加 电源2正极和外加电源2的滑线电阻滑动臂上。所述电解池中的工作电极为汞滴电极，产生汞滴的装置是在储汞瓶9上端插入钼 丝8于汞中，储汞瓶9下端套塑料管10和毛细管11，储汞瓶9中汞在毛细管的下端形成汞 滴，汞滴浸泡在待测溶液液面以下，储汞瓶中的汞通过钼丝与检测仪表3的电流表连接，电 流表接到外加电源的滑线电阻滑动臂上。所述作为固相载体的聚苯乙烯容器7，其成分为聚苯乙烯，聚苯乙烯具有较强的吸 附蛋白质的性能，蛋白质抗原和抗体吸附其上后保留原来的免疫活性，待测牙本质磷蛋白、 抗体、酶标记抗体都吸附固定在固相载体上。所述外加电源2在工作电极4和参比电极5之间由计算机控制施加一个准确电压，由此精确控制工作电极4于-0. 46V (相对于参比电极5)的电位上，在此电位下氨基吩 噁嗪在汞滴表面发生电化学还原反应，检测仪表3的电流表精确记录工作电极4汞滴表面 氨基吩噁嗪发生还原反应而产生的电流。本发明的有益效果是本发明可以实现对龈沟液中牙本质磷蛋白变化规律的精确 检测，基于牙本质磷蛋白含量与牙根吸收发生程度之间的必然联系，可以实现对患者牙根 吸收的早期诊断；本检测方法具有操作简单、灵敏度高、无辐射损伤等优点，在牙根吸收的 临床诊断中具有良好的应用前景。
图1是电化学酶联免疫法检测装置结构示意图。图2是牙本质磷蛋白“双抗体夹心法”酶联免疫反应过程示意图。
具体实施例方式本发明提供一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置。下面将结合附图和实施例来 详细说明本发明。图1为电化学酶联免疫法检测装置，该装置包括了电解池1、检测仪表3和储汞瓶 9串联构成，外加电源2与检测仪表3连接；在作为固相载体7的聚苯乙烯容器内装入待测 溶液6，工作电极4在待测溶液6液面以下、参比电极5为具有恒定电位的饱和甘汞电极，饱 和甘汞电极的顶端浸泡在待测溶液6液面以下；参比电极5与外加电源2正极连接，检测仪 表3的电压表连接外加电源2正极和外加电源2的滑线电阻滑动臂上。所述电解池中的工作电极为汞滴电极，产生汞滴的装置是在储汞瓶9上端插入钼 丝8于汞中，储汞瓶9下端套塑料管10和毛细管11，储汞瓶9中汞在毛细管的下端形成汞 滴，汞滴浸泡在待测溶液液面以下，储汞瓶中的汞通过钼丝与检测仪表3的电流表连接，电 流表接到外加电源的滑线电阻滑动臂上。所述固相载体7，其成分为聚苯乙烯，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，蛋 白质抗原和抗体吸附其上后保留原来的免疫活性，待测牙本质磷蛋白、抗体、酶标记抗体都 吸附固定在固相载体上。所述外加电源2在工作电极4和参比电极5之间由计算机控制施加一个准确电 压，由此精确控制工作电极4的电位，在此恒定电位下氨基吩噁嗪在汞滴表面发生电化学 还原反应，检测仪表3的电流表精确记录工作电极4汞滴表面氨基吩噁嗪发生还原反应而 产生的电流。图2为牙本质磷蛋白酶联免疫反应过程示意图，将兔抗牙本质磷蛋白抗体13吸附 到聚苯乙烯容器作为固相载体7上，孵育后洗涤除去未吸附的抗体；加入含有待测牙本质 磷蛋白(抗原)15样品，使之与吸附于固相载体7上的兔抗牙本质磷蛋白抗体13反应，孵 育后洗涤除去未反应的样品；加入辣根过氧化物酶标记的特异性抗体16与待测抗原15反 应，形成所谓“双抗体夹心抗原”结构，此时酶与抗原之间形成定量关系；最后加入包含过氧 化氢17和邻氨基酚18的底物，在酶催化下，过氧化氢17和邻氨基酚18反应生成可进行电 化学方法精确测定产物，酶的量与产物的量呈正比定量关系。产物的量可以通过图1中所 示的装置及方法加以测定。进而可以测定待测样品中牙本质磷蛋白的含量并诊断牙根吸收
6发生的程度。本方法包括牙本质磷蛋白的提取及纯化。电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检 测牙本质磷蛋白的含量。所述龈沟液中牙本质磷蛋白的提取方法为取样前，首先清洁口腔牙面并吹干。将 吸潮试纸尖端紧贴于牙齿的颊舌侧牙面的龈沟边缘，放置30秒以上，取出后放入离心密封 管并于-70°C保存，作为待测样品待用。上述方法具有良好的可靠性和可重复性。关键影响 因素是放置时间，放置时间30秒，时间过少易导致所采集的龈沟液体积较少，给后续测量 带来误差。所述龈沟液中牙本质磷蛋白的纯化方法为在待测样品中加入20μ 1蛋白提取 液，冰浴20 30分钟，于4°C下15000转/分钟(r/min)离心10分钟后，提取20 μ 1上清 液，加入等量蛋白上样液，煮沸并冷却，于-20°C保存待测。所述蛋白提取液配制方法先以少量蒸馏水(300 500ml)溶解60. 57g Tris (三 羟甲基氨基甲烷)，加入HCl后，用HCl(lmol/L)或Na0H(lmol/L)将pH调至7. 6，最后蒸馏 水加至1000ml，Tis浓度为0. 5mol/L。此液为储备液，4°C冰箱中保存。所述蛋白上样液配制方法先量取120ml上述0. 5mol/L蛋白提取液，依次加入 200ml质量浓度比为10%的SDS (十二烷基磺酸钠)水溶液，500ml质量浓度比为50%的甘 油水溶液，50ml的2-巯基乙醇，IOOml质量浓度比为1 %的溴酚兰水溶液，最后蒸馏水加至 1000ml。此液为储备液，4°C冰箱中保存。电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白含量包括基于“双抗体夹 心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质磷蛋白的精确含量。电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法反应过程为用包被缓冲液将兔抗牙本质磷 蛋白抗体13(如CSB-P10111Rb-h，武汉华美生物工程有限公司产品)稀释至蛋白质含量为 1 10μ g/ml，优选5μ g/ml。在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C过夜，以使抗体与固相载体 充分吸附。次日，弃去容器内溶液，用洗涤缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去未发生吸附的 抗体，如图2所示。于聚苯乙烯容器中加0. Iml稀释液(如图2所示)适当稀释的待测牙本质磷蛋白 抗原样品15，于37°C孵育1小时，使固相载体上的兔抗牙本质磷蛋白抗体13与待测样品中 的牙本质磷蛋白抗原15充分结合；用洗涤缓冲冲洗三次，每次三分钟，洗去待测样品中的 其他成分(如图2所示)；所述稀释液为牛血清蛋白稀释液，其配制方法为将0. Ig牛血清 蛋白溶解于蒸馏水中并稀释至IOOOml中配制而成。于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记牙 本质磷蛋白抗体16，于37°C孵育1小时，使酶标牙本质磷蛋白抗体16与牙本质磷蛋白抗原 15充分结合，形成所谓“双抗体夹心”结构，用洗涤缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去其他 成分，备用(如图2所示)，此时所形成“双抗体夹心”结构中待测牙本质磷蛋白抗原与辣根 过氧化物酶之间形成定量关系。所述包被缓冲液为PH9. 6的碳酸盐缓冲液，其配制方法为1. 59g碳酸钠Na2CO3与 2. 93g碳酸氢钠NaHCO3溶解于蒸馏水中并稀释至IOOOml配制而成。上述酶联免疫反应过 程中洗涤缓冲液为PH7. 4的磷酸盐缓冲液，其配制方法为0. 2g磷酸二氢钾KH2PO4, 2. 9g磷 酸二氢钠，8g氯化钠NaCl，0. 2g KC1，0. 5ml吐温Tween-20，混合溶解于蒸馏水并稀释至
7IOOOml中配制而成。电化学方法检测牙本质磷蛋白的含量包括电化学检测体系的建立以及在此基础 上牙本质磷蛋白含量的测定。电化学检测体系为邻氨基酚-过氧化氢-辣根过氧化物酶检测体系。过氧化氢17 可以氧化邻氨基酚18生成氨基吩噁嗪，该反应十分缓慢，产物微量。而在辣根过氧化物酶 催化下，该反应速度大大加快，生成大量产物氨基吩噁嗪。所生成氨基吩噁嗪可以在工作电 极4上于-0. 46V (相对于参比电极5)发生还原反应产生还原电流，并相应在检测仪表3中 记录下一个灵敏的电流峰。辣根过氧化物酶含量与电流峰大小在0. OlX 10_9-4X 10_9g/ml 浓度范围内呈现正比定量关系，通过该方法可以精确测定辣根过氧化物酶含量。在IOml的比色管中加入少量蒸馏水，依次加入1 X 10_2mol/L的邻氨基酚溶液1ml， 0. 2mol/L的PH = 5. 7的B-R缓冲溶液1 3ml (优选2ml)，4X 10_3mol/L过氧化氢0. 2 Iml (优选0. 5ml)，以及不同量的标准辣根过氧化物酶，稀释至刻度，在37°C下反应30分钟。 取此溶液5ml于另外一只IOml比色管中，计入PH = 8的B-R缓冲溶液2 5ml (优选3ml)， 摇勻并稀释至刻度，将IOml最终配制完成溶液倒入容器中，反应1小时，将滴汞工作电极和 饱和甘汞参比电极插入反应液中，在工作电极4上于-0. 46V (相对于参比电极5)电位处测 定并记录工作电极反应峰电流大小。以标准品辣根过氧化物酶浓度为横坐标，以反应峰电 流大小为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程。以标准品辣根过氧化物酶浓度为横坐标，以反应峰电流大小为纵坐标，可以生成 标准曲线和直线回归方程，根据公式I = 22. 6-5. 51og2X可计算未知样品的浓度，式中I为 反应电流的大小，单位为微安uA，X为辣根过氧化物酶的含量，单位为纳克每毫升ng/ml ；通 过上述方法测定辣根过氧化物酶检测限可达到1 X 10_12g/mL。上述电化学检测体系的待测样品中牙本质磷蛋白含量测定方法是在IOml的比色管中加入少量蒸馏水，依次加入1 X 10_2mol/L的邻氨基酚溶液1ml， 浓度0. 2mol/L的PH = 5. 7的B-R缓冲溶液1 3ml (优选2ml)，浓度4X 10_3mol/L过氧 化氢0. 2 Iml (优选0. 5ml)，以及0. 005 5ml浓度为2X 10_8g/ml的标准辣根过氧化物 酶，稀释至IOml标准刻度，在37°C下反应30分钟。取此溶液5ml于另外一只IOml比色管 中，加入PH = 8的B-R缓冲溶液2 5ml (优选3ml)，摇勻并稀释至IOml标准刻度，将IOml 最终配制完成溶液倒入前述完成酶联免疫反应带有“双抗体夹心结构”的聚苯乙烯容器中， 反应1小时，将工作电极和参比电极插入反应液中，在汞滴电极4上于-0. 46V (相对于饱和 甘汞参比电极5)电位测定并记录工作电极表面反应峰电流大�。荼曜记呒扑� 辣根过氧化物酶量的多少。进而根据辣根过氧化物酶与牙本质磷蛋白抗原含量之间的定量 关系计算待测样品中牙本质磷蛋白含量。上述PH = 5. 7的B-R缓冲溶液配制方法为，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼 酸，浓度均为0. 04mol/L)中，加入40ml的0. 2mol/LNa0H,即得。上述PH = 8的B-R缓冲溶液配制方法为，在IOOml三酸混合液(磷酸、醋酸、硼 酸，浓度均为0. 04mol/L)中，加入60ml的0. 2mol/LNa0H,即得。由于待测样品中辣根过氧 化物酶的量与牙本质磷蛋白抗原的量呈定量关系，因此该方法可精确测定龈沟液中牙本质 磷蛋白的含量。上述结合附图及实施例对本发明的进一步说明、理解，并不构成对本发明的不当
8限定。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组
I=I O
权利要求
一种牙本质磷蛋白的检测方法，其特征在于所述牙本质磷蛋白的检测方法是基于电化学酶联免疫的测定法；包括牙本质磷蛋白的提取及纯化和电化学“双抗体夹心”酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白的含量两个步骤；1)牙本质磷蛋白的提取和纯化采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯取样前，首先清洁口腔牙面并吹干将吸潮试纸尖端紧贴于牙齿的颊舌侧牙面的龈沟边缘，放置30秒以上，取出后放入离心密封管作待测样品，并于 70℃保存；待测样品提纯是在待测样品中加入20μl蛋白提取液，冰浴20～30分钟，于4℃下15000转/分钟离心10分钟后，提取20μl上清液，加入等量蛋白上样液，煮沸并冷却，于 20℃保存待测；其中蛋白提取液配制是先以300～500ml蒸馏水溶解60.57g三羟甲基氨基甲烷，加入HCl后，用浓度为1mol/L的HCl或浓度为1mol/L的NaOH，将pH调至7～8，最后蒸馏水加至1000ml，得到浓度为0.5mol/L的蛋白提取液，在4℃冰箱中保存备用；蛋白上样液配制是先量取120ml上述0.5mol/L蛋白提取液，依次加入200ml质量浓度比为10％的十二烷基磺酸钠SDS水溶液，500ml质量浓度比为50％的甘油水溶液，50ml的2 巯基乙醇，100ml质量浓度比为1％的溴酚兰水溶液，最后蒸馏水加至1000ml，在4℃冰箱中保存备用；2)电化学酶联免疫方法检测牙本质磷蛋白含量a.基于“双抗体夹心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质磷蛋白的精确含量；酶联免疫反应过程为将兔抗牙本质磷蛋白抗体吸附到以聚苯乙烯容器作为固相载体上，孵育后洗涤除去未吸附的抗体；加入含有待测牙本质磷蛋白的抗原样品，使之与吸附于固相载体上的兔抗牙本质磷蛋白抗体反应，孵育后洗涤除去未反应的样品；加入辣根过氧化物酶标记的特异性牙本质磷蛋白抗体与待测牙本质磷蛋白的抗原反应，形成所谓“双抗体夹心抗原”结构，此时酶与双抗体夹心抗原之间形成等量关系；最后加入主要成分包括邻氨基酚和过氧化氢的底物，在酶催化下，底物邻氨基酚和过氧化氢反应生成可进行电化学方法精确测定的产物氨基吩噁嗪；b.“电化学”测试法为邻氨基酚和过氧化氢的底物溶液在辣根过氧化物酶催化下，过氧化氢将邻氨基酚氧化生成产物氨基吩噁嗪，氨基吩噁嗪在汞电极上发生还原反应，其反应电流的大小与氨基吩噁嗪的量呈正比定量关系，进而与辣根过氧化物酶的量呈I＝22.6 5.5log2X，式中I为反应电流的大�。ノ晃拨藺，X为辣根过氧化物酶的含量，单位为纳克每毫升ng/ml，则通过测定上述反应电流的大�。舛ò被試f嗪的量，进而测定辣根过氧化物酶的量，进而测定待测样品中牙本质磷蛋白的量。
2.根据权利要求1所述牙本质磷蛋白的检测方法，其特征在于，所述孵育后洗涤除去 未吸附的抗体是用包被缓冲液将兔抗牙本质磷蛋白抗体稀释至蛋白质含量为1 10 μ g/ ml，优选5 μ g/ml，在聚苯乙烯容器中加0. lml，4°C过夜，以使抗体与固相载体充分吸附； 次日，弃去容器内溶液，用洗涤缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去未发生吸附的抗体；其 中包被缓冲液为PH9. 6的碳酸盐缓冲液，其配制方法为1. 59g碳酸钠Na2CO3与2. 93g碳 酸氢钠NaHCO3溶解于蒸馏水中并稀释至IOOOml配制而成；其中兔抗牙本质磷蛋白抗体为 CSB-P10111Rb-h，武汉华美生物工程有限公司产品。
3.根据权利要求1所述牙本质磷蛋白的检测方法，其特征在于，所述孵育后洗涤除去未反应的样品是于聚苯乙烯容器中加0. Iml牛血清蛋白稀释液，稀释的待测牙本质磷蛋白 抗原样品，于37°C孵育1小时，使固相载体上的兔抗牙本质磷蛋白抗体与待测牙本质磷蛋 白抗原充分结合；用洗涤缓冲冲洗三次，每次三分钟，洗去待测牙本质磷蛋白抗原样品中的 未反应的样品；其中牛血清蛋白稀释液是由0. Ig牛血清蛋白溶解于IOOOml蒸馏水中稀释 配制而成。
4.根据权利要求1所述牙本质磷蛋白的检测方法，其特征在于，所述形成所谓“双抗体 夹心抗原”结构是于聚苯乙烯容器中加入0. Iml牛血清蛋白稀释液稀释的辣根过氧化物酶 标记牙本质磷蛋白抗体，于37°C孵育1小时，使酶标牙本质磷蛋白抗体与牙本质磷蛋白抗 原充分结合，形成所谓“双抗体夹心”结构，用洗涤缓冲液冲洗三次，每次三分钟，洗去其他 成分。
5.一种牙本质磷蛋白的检测装置，其特征在于，该装置由电解池(1)、检测仪表(3)和 储汞瓶(9)串联构成，外加电源(2)与检测仪表(3)连接构成。
6.根据权利要求5所述牙本质磷蛋白的检测装置，其特征在于，所述电解池为以聚苯 乙烯容器作为固相载体(7)内装入待测样品溶液(6)，工作电极(4)在待测样品溶液(6)液 面以下、参比电极(5)为具有恒定电位的饱和甘汞电极，饱和甘汞电极的顶端浸泡在待测 溶液(6)液面以下；参比电极(5)与外加电源(2)正极连接，检测仪表(3)的电压表连接在 外加电源(2)正极和外加电源(2)的滑线电阻滑动臂上。
7.根据权利要求5或6所述牙本质磷蛋白的检测装置，其特征在于，所述电解池中的工 作电极为汞滴电极，产生汞滴的装置是在储汞瓶(9)上端插入钼丝⑶于汞中，储汞瓶(9) 下端套塑料管(10)和毛细管(11)，储汞瓶(9)中汞在毛细管的下端形成汞滴，汞滴浸泡在 待测溶液液面以下，储汞瓶中的汞通过钼丝与检测仪表(3)的电流表连接，电流表接到外 加电源的滑线电阻滑动臂上。
8.根据权利要求5所述牙本质磷蛋白的检测装置，其特征在于，所述固相载体的成分 为聚苯乙烯，聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，蛋白质抗原和抗体吸附其上后保留 原来的免疫活性，待测牙本质磷蛋白、抗体、酶标记抗体都吸附固定在固相载体上。
9.根据权利要求5所述牙本质磷蛋白的检测装置，其特征在于，所述外加电源(2)在 工作电极(4)和参比电极(5)之间由计算机控制施加一个电压，由此精确控制工作电极(4) 相对于参比电极(5)于-0. 46V的电位，在此电位下氨基吩噁嗪在汞滴表面发生电化学还原 反应，检测仪表(3)的电流表精确记录工作电极(4)汞滴表面氨基吩噁嗪发生还原反应而 产生的电流。
全文摘要
本发明公开了属于电化学酶联免疫测试技术领域的一种牙本质磷蛋白的检测方法及其装置。在由电解池、检测仪表和储汞瓶串联连接，及外加电源与检测仪表连接构成的装置中采用“双抗体夹心法”酶联免疫反应及“电化学”检测法相结合精确测定牙本质磷蛋白的精确含量，采用“滤纸吸着法”提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，并采用“蛋白提取液纯化法”提纯提取患者口腔龈沟液中的牙本质磷蛋白，提纯后放入离心密封管作待测样品；本发明可以实现对龈沟液中牙本质磷蛋白变化规律的精确检测，可以实现对患者牙根吸收的早期诊断；本检测方法具有操作简单、灵敏度高、无辐射损伤等优点，在牙根吸收的临床诊断中具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/68GK101986158SQ20101025970
公开日2011年3月16日 申请日期2010年8月23日 优先权日2010年8月23日
发明者沙海亮, 白玉兴 申请人:首都医科大学附属北京口腔医院
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