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ʱ¼ä:2025-06-04    ×÷Õß: ¹ÜÀíÔ±

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(2)ÔÚµ°°×ÖÊоƬÉÏ·ÖÎö¿¹Ô­-¿¹ÌåÏ໥×÷ÓÃÒÔ¼°°üÀ¨ÏÞÖÆÐÔø¡¢¹ýÑõ»¯Îïø¡¢Á×Ëáø¡¢µ°°×¼¤Ã¸µÈ¸÷ÖÖøµÄ·´Ó¦µÄ¼¼Êõ(US2002/0055186A1£»WO01/83827A1£»Braunwalder£¬A.µÈ£¬Anal.Biochem.£¬23423-6£¬1996£»Houseman£¬B.µÈ.£¬Nat.Biotechnol.£¬20270-4£¬2002£»ÒÔ¼°Ruud£¬M.µÈ£¬Nat.Biotechnol.£¬18989-94£¬2000)¡£ÓÈÆäÊÇ£¬¸Ã¼¼ÊõÄÜͨ¹ýµ°°×-µ°°×Ï໥×÷Óᢼ¤Ã¸-µ×ÎïëÄÏ໥×÷Óú͵°°×ÅäÌå½áºÏ·´Ó¦ÓÃÓÚ´ó¹æÄ£É¸Ñ¡¡¢Éú»¯·ÖÎö¡¢ÐµĺòѡҩÎïµÄ·ÖÎö¡¢¼²²¡µÄÕï¶ÏµÈ·½Ãæ¡£µ«ÊÇ£¬Ôڹ̶¨¼¤Ã¸»òµ°°×ÌØÒìÐԵĵͷÖ×ÓÁ¿µ×ÎïëĵÄÇé¿öÏ£¬´æÔÚµÄȱÏÝÊÇ£¬¹Ì¶¨µÄÎïÖʻᱻ°üÂñÔÚÓÃÓÚÒÖÖÆ·ÇÌØÒìÐԹ̶¨µÄ·â±ÕÒºBSAÖС£´ËÍ⣬¾Ý±¨µÀ£¬µ±²»Í¬ÖÖÀàµÄ¿¹Ìå¹Ì¶¨µ½Ð¾Æ¬Éϲ¢ÓëÓ«¹â±ê¼ÇµÄ¿¹Ô­»ìºÏÎﷴӦʱ£¬½öÓÐ60£¥µÄ¿¹Ìå±íÏÖ³ö¶¨Á¿½á¹û£¬½öÓÐ23£¥µÄ¿¹Ìå±íÏÖ³ö¶¨ÐԵĽá¹û(MacBeath£¬G.µÈ£¬Science£¬2891760-3£¬2000£»ÒÔ¼°Haab£¬B.µÈ£¬Genome Biol.£¬2research 0004£¬2001)¡£
(3)ÔÚоƬÉÏ´ÓcDNAÎÄ¿â±í´ï´óÁ¿µÄµ°°×Öʲ¢½øÐзÖÎöµÄ¼¼Êõ(WO01/83827£»WO 02/50260)¡£¸Ã¼¼ÊõÄܶԵ°°×ÖʵÄÉú»¯»îÐÔ½øÐдó¹æÄ£Ñо¿¡£
(4)ͨ¹ýÔÚоƬ±íÃæÐγɾùÔÈÎȶ¨µÄµ¥²ãÉúÎï·Ö×Ó£¬²¢ÓÃÇ׺ϱê¼ÇÔÚ·Ö×Óˮƽ±£³ÖÉúÎï·Ö×Ó·½ÏòÀ´·ÖÎöÑùÆ·µÄ¼¼Êõ(US2002/0055125A1£»US 6,406£¬921£»Paul£¬J.µÈ£¬JACS£¬1227849-50£¬2000£»RaVi£¬A.µÈ£¬Anal.Chez.£¬73471-80£¬2001£»ÒÔ¼°Benjamin£¬T.µÈ£¬TrendsBiotechnol.£¬20279-81£¬2002)¡£ÀýÈ磬µ°°×ÖÊÒÔHis-±ê¼ÇÈںϵ°°×µÄ·½Ê½±í´ï£¬È»ºóÓëNi-NTA½áºÏоƬ·´Ó¦¶ø¹Ì¶¨µ½Ð¾Æ¬ÉÏ£¬´Ó¶ø±£³ÖÁËÉúÎï·Ö×ӵĻîÐÔ¡£ÁíÍ⣬µ°°×ÖÊÒÔÄÚµ°°××Ó(intein)Èںϵ°°×µÄ·½Ê½±í´ï£¬´Ó¶øÄܺÜÈÝÒ׵ر»´¿»¯¡£¶øÇÒ£¬Ò²¿ÉÒÔÔÚÌØ¶¨Î»µã½«µ°°×ÖÊÉúÎïËØ»¯£¬²¢ÔÚ¿¹ÉúÎïËØµ°°×´¦ÀíµÄоƬÉÏÒÔ¸ø¶¨µÄ·½Ïò¹Ì¶¨£¬ÕâÑùÄÜʹµ°°×Öʱ£³ÖÔÚÒ»¸ö¸ü¼ÓÎȶ¨ºÍ¸ü¾ß»îÐÔµÄ״̬(ZhuµÈ£¬Science£¬2932101-5£¬2001£»Marie-Laure£¬LµÈ£¬JACS£¬1248768-9£¬2002)¡£´ËÍ⣬ÓëÖ§³ÖÎïÌØÒìÐÔ½áºÏµÄµ°°×ÖÊ(Èç¸Æµ÷µ°°×)ÒÔÓë±ê¼ÇÎï(ÀýÈ磬¾Û°ëë×°±ËᣬÀµ°±Ëᣬ×é°±ËáµÈ)Èںϵķ½Ê½±í´ï£¬È»ºó¹Ì¶¨ÖÁÖ§³ÖÎïÉÏ£¬ËùµÃµ½µÄ½á¹¹ÄÜÓÃÓÚµ°°×´¿»¯¡¢±íÃæµÈÀë×ÓÌå¹²Õñ(SPR)·ÖÎöºÍÓ«¹â¼¤»îµÄϸ°ûɸѡ(FACS)·ÖÎö(HentzµÈ£¬Anal.Chem.£¬683939-44£¬1996£»HodnelandµÈ£¬PANS£¬995048-52£¬2002£»KukarµÈ£¬Anal Biochem.£¬30650-4£¬2002£»US 6,117,976)¡£
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ÒýÎï1(SEQ ID NO2)5¡ä-CGGAATTCATATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCA-3¡äÒýÎï2(SEQ ID NO3)5¡ä-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCACGACGCAGGCACCCAGGGCTGAGG-3¡ä
´ËÍ⣬ÒÔ¶þ¾ÛÌåÐÎʽÈÚºÏʱ£¬²ÉÓÃÉÏÊöµÄÄ£°åDNAºÍÒýÎï1ÒÔ¼°ÏÂÁеÄÒýÎï3½øÐÐPCRÀ©Ôö£¬´Ó¶øµÃµ½È±Ê§ÁËBamHIÏû»¯Î»µãºÍÖÐÖ¹ÃÜÂë×ÓµÄÄ£°åDNA¡£
ÒýÎï3(SEQ ID NO4)5¡ä-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCGCGGCGCAGGGGGCCCAGGCTCGCACGACG-3¡äÈ»ºó£¬Ê¹ÓÃÏÂÊöÒýÎï4½øÐÐPCR£¬µÃµ½Ò»¸ö°üº¬±àÂëµ°°×ÐÎʽµÄ»ùÒòµÄDNA£¬¸Ãµ°°×ÐÎʽÖаüº¬ÏÞÖÆÐÔøBamHIµÄÏû»¯Î»µãºÍÖÐÖ¹ÃÜÂë×ÓµÄ¿ÏÆÕëÄÒÔ¶þ¾ÛÌåÐÎʽÓëCÄ©¶ËÈںϡ£
ÒýÎï4(SEQ ID NO5)5¡ä-GCGGATCCTTAGCCCAGGCTCGCGCGGCGCAGGGGGCCCAGGCTCGCACGACG-3¡ä²ÉÓÃÏÂÊöÌõ¼þ½øÐÐPCR94¡æÏµÚÒ»´Î±äÐÔ5·ÖÖÓ£»30¸öÑ­»·°üº¬94¡æÏµڶþ´Î±äÐÔ1·ÖÖÓ£»56¡æÏÂÍË»ð50ÃëÖÓ£¬72¡æÏÂÑÓÉì90Ã룻×îºóÔÚ72¡æÏÂÑÓÉì5·ÖÖÓ¡£PCRÀ©ÔöµÃµ½µÄDNA½øÐÐÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾£¬È»ºó·ÖÀë³öÔ¼435bpºÍ459bpµÄDNA¡£ÓÃNdeIºÍBamHIÏû»¯·ÖÀëµÃµ½µÄDNA£¬µÃµ½DNAƬ¶Î¡£
È»ºó£¬ÓÃÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÏû»¯°üº¬T7Æô¶¯×ÓµÄÖÊÁ£pET-3a(Novagen£¬USA)£¬»ìºÏDNAƬ¶Î£¬²¢ÓÃT4DNAÁ¬½ÓøÁ¬½Ó£¬´Ó¶ø¹¹½¨ÁËÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKD(¼ûͼ2)¡£Í¼2ÊÇÖÊÁ£pLKMºÍpLKDµÄʾÒâͼ¡£ÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKD°üº¬±àÂëÈËÊÝËØµÄcDNA£¬±àÂëµ°°×¼¤Ã¸AÌØÒìÐÔµÄ¿ÏÆÕëĵĹѺËÜÕËᣬÒÔ¼°¿¨ÄÆÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¬²¢ÄÜ·Ö±ð±í´ïÊÝËØ-µ¥Ìå¿ÏÆÕëÄÐÎʽµÄµ°°×ºÍÊÝËØ-¶þ¾ÛÌå¿ÏÆÕëÄÐÎʽµÄµ°°×ÖÊ¡£
ÓÃÈÈÐݿ˷½·¨£¬½«ÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKDµ¼Èëµ½E.coli BL21(DE3)[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm fDE3)£¬¾ßÓÐT7RNA¾ÛºÏø»ùÒòµÄǰÊɾúÌå](Novagen£¬USA)£¬ÔÚº¬Óп¨ÄÆÃ¹ËØ(50¦Ìg/mL)µÄLBÅàÑø»ùÖÐÅàÑø£¬È»ºóɸѡת»¯µÄE.coli¡£·ÖÀë³öÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKD£¬²¢ÓÃÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÏû»¯£¬´Ó¶ø»ñµÃ439bpºÍ459bp´óСµÄDNAƬ¶Î¡£ÕâЩDNAƬ¶ÎÊDZàÂë×÷Ϊµ×ÎïëÄµÄ¿ÏÆÕëÄÓëÈËÊÝËØÏàÈںϵĵ°°×ÐÎʽµÄ»ùÒò¡£
(2)¹¹½¨ÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3
¹¹½¨±í´ïÌØÒìÐÔÕë¶Ôµ°°×¼¤Ã¸AµÄÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×(ͼ1)µÄÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3¡£ÔÚÓëʵʩÀý1-(1)µÄÏàͬÌõ¼þϽøÐÐPCRÀ©Ôö£¬µÃµ½ÆäÖÐ6¸ö×é°±Ëá²Ð»ùÓëNÄ©¶ËÏàÁ¬µÄÆ»¹ûËáø£¬Ê¹ÓõÄÄ£°åΪÀ´Ô´ÓÚE.coli K-12µÄE.coli W3110(¦Ë-£¬F-£¬Ô­ÑøÐÍ)µÄȾɫÌåDNA£¬Ê¹ÓõÄÏÂÊöÒýÎï5(ÔÚNÄ©¶Ë°üº¬±àÂë6¸ö×é°±Ëá²Ð»ùµÄÐòÁÐ)°üº¬ÏÞÖÆÐÔøNcolºÍXbaIµÄÏû»¯Î»µã£»ÒÔ¼°ËùÓõÄÏÂÊöÒýÎï6ÔÚCÄ©¶Ë°üº¬¿ÏÆÕëÄ»ùÒòÐòÁÐ(HongµÈ£¬Biotechnol.Bioeng.£¬20£¬74(2)89-95£¬2001)¡£
ÒýÎï5(SEQ ID NO6)5¡ä-CATGCCATGGGCATCACCATCATCACCATGATATTCAAAAAAGAGTG-3¡äÒýÎï6(SEQ ID NO7)5¡ä-GCTCTAGATTAGCCCAGGCTCGCACGACGCAGGATGGAGGTACGGCGGTA-3¡äPCRÀ©ÔöµÃµ½µÄDNA¾­ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾·ÖÀë³ö1782bp´óСµÄDNA¡£ÓÃÏÞÖÆÐÔøNcoIºÍXbalÏû»¯·ÖÀëµÃµ½µÄDNA£¬È»ºó²åÈëµ½ÓÃÏàͬÏÞÖÆÐÔøÏû»¯¹ýµÄÖÊÁ£pTrc99A(Pharmacia Biotech Co.£¬Sweden)ÖУ¬´Ó¶ø¹¹½¨ÁËÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3(FIG.3)¡£Í¼3ÊÇÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3µÄʾÒâͼ¡£ÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3°üº¬±àÂëÀ´Ô´ÓÚE.coliµÄÆ»¹ûËáøµÄcDNA¡¢±àÂë¿ÏÆÕëĵĹѺËÜÕËá¡¢ÒÔ¼°°±ÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¬¸ÃÖÊÁ£Äܱí´ïÆ»¹ûËáø-µ¥Ìå¿ÏÆÕëĵ°°×£¬ÆäÖеÄ6¸ö×é°±Ëá²Ð»ùÓëNÄ©¶ËÏàÁ¬¡£
E.coli L1-Blue(Stratagene£¬La Jolla£¬USA)¾­ÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3ת»¯ºó£¬ÔÚ°üº¬°±ÜÐÇàÃ¹ËØ(50¦Ìg/mL)µÄLBÅàÑø»ùÖÐÅàÑø¡£É¸Ñ¡×ª»¯µÄE.coli£¬´ÓE.coliÖзÖÀë³öÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3¡£
(3)¹¹½¨ÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLAD¹¹½¨±í´ïÌØÒìÐÔÕë¶ÔAb1¼¤Ã¸µÄÊÝËØ-Ab1ëÄ(ͼ1)µÄÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLAD¡£ÓÃÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÏû»¯±àÂëAb1(SEQ ID NO8)µÄDNAÐòÁУ¬µÃµ½Ô¼477bpºÍ516bp´óСµÄDNAƬ¶Î¡£Í¬Ê±£¬ÓÃÏàͬµÄÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÀ´Ïû»¯°üº¬T7Æô¶¯×ÓµÄÖÊÁ£pET-30a(Novagen£¬USA)¡£
ΪÁ˵õ½±»Ñ¡ÓÃ×÷ΪÁ¬½Óµ°°×µÄ438bpÈËÊÝËØ»ùÒò£¬PCRÀ©Ôö²ÉÓÃÖØ×éÖÊÁ£pEDOb5(Jeong etal.£¬Appl.Environ.Microbiol.£¬653027-32£¬1999)×÷Ϊģ°å£¬Ê¹Óðüº¬ÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÏû»¯Î»µãµÄÏÂÊöÒýÎï7ºÍ8¡£
ÒýÎï7(SEQ ID NO9)5¡ä-CGGAATTCATATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCA-3¡äÒýÎï8(SEQ ID NO10)5¡ä-CGGGATCCTCATTATTTTTTTTTCGCAAACGGCGCCGCATAGATCGCTTCGCACCCAGGGCTGAGGT-3¡ä´ËÍ⣬ΪÁ˽øÐжþ¾ÛÌåÐÎʽµÄÈںϣ¬Ê¹ÓÃÉÏÊöµÄÏàͬģ°åDNA¡¢ÒýÎï1ºÍÏÂÊöÒýÎï9½øÐÐPCR£¬´Ó¶øµÃµ½È±Ê§ÁËBamHIÏû»¯Î»µãºÍÖÐÖ¹ÃÜÂë×ÓµÄÄ£°åDNA¡£
ÒýÎï9(SEQ ID NO11)5¡ä-CGGGATCCTTTTTTTTTCGCAAACGGCGCCGCATAGATCGCTTCGCACCCAGGGCTGAGGT-3ʹÓúϳɵÄÒýÎï7ºÍ9½øÐÐPCRÀ´À©ÔöÄ£°å£¬¹¹½¨°üº¬BamHIÏû»¯Î»µãµÄÏÂÊöÒýÎï10ÒԵõ½¶þ¾ÛÌåPCR²úÎï¡£
ÒýÎï10(SEQ ID NO12)5¡ä-CGGGATCCTCATTATTTTTTTTTCGCAAACGGCGCCGCATAGATCGCGGGTTTTTTTTTCGCAAACGGCGC-3¡äPCRÀ©ÔöµÄDNA¾­ÇíÖ¬ÌÇÄý½ºµçÓ¾·ÖÀë³öÔ¼477bpºÍ516bp´óСµÄDNAƬ¶Î¡£·ÖÀë³öµÄDNA¾­ÏÞÖÆÐÔøNdeIºÍBamHIÏû»¯ºó£¬²åÈëµ½ÓÃͬÑùÏÞÖÆÐÔøÏû»¯¹ýµÄÖÊÁ£pET-30aÖУ¬´Ó¶ø¹¹½¨ÁËÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLAD(ͼ4)¡£Í¼4ÊÇÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLADµÄʾÒâͼ¡£ÖÊÁ£pLAMºÍpLAD°üº¬±àÂëÈËÊÝËØµÄcDNA£¬±àÂëAb1µÄ¹ÑºËÜÕËᣬÒÔ¼°¿¨ÄÆÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¬¸ÃÖÊÁ£ÄÜ·Ö±ð±í´ïÊÝËØ-µ¥ÌåAb1ÐÎʽµÄµ°°×ºÍÊÝËØ¶þ¾ÛÌå-Ab1ÐÎʽµÄµ°°×¡£
E.coli BL21(DE3)¾­ÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLADת»¯ºó£¬ÔÚ°üº¬¿¨ÄÆÃ¹ËØ(50¦Ìg/mL)µÄLBÅàÑø»ùÖÐÅàÑø¡£É¸Ñ¡×ª»¯µÄE.coli£¬´Óת»¯µÄE.coliÖзÖÀë³öÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLAD¡£
ʵʩÀý2Ôڹ̶¨ÁËÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄµ°°×ÖÊоƬÉÏ·ÖÎöÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×ºÍµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃ(1)ÖÆ±¸ÆäÉϹ̶¨ÁËÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄµ°°×ÖÊоƬ¾­ÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKDת»¯µÄÖØ×éE.coli±»½ÓÖÖµ½200ml LBÅàÑø»ùÖУ¬ÔÚ37¡æÏÂÅàÑø£¬ÆäÖÐÖØ×éÖÊÁ£pLKMºÍpLKD°üº¬±àÂëÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄ»ùÒò¡£µ±600nm²¨³¤ÏµĹâÃܶȴﵽ0.7ʱ£¬¼ÓÈë1mMµÄIPTGÓÕµ¼ÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄ±í´ï¡£4СʱÒÔºó£¬ÅàÑøÈâÌÀÔÚ4¡æ¡¢6000rpmÏÂÀëÐÄ5·ÖÖÓ£¬ËùµÃµÄ³ÁµíÓÃ100ml TE»º³åÒº(Tris-HCl 10mM£»EDTA 1mM£¬pH 8.0)³åÏ´¡£³åÏ´ºóµÄÎïÖÊÔÚ4¡æ¡¢6000rpmÏÂÀëÐÄ5·ÖÖÓ£¬È»ºóÐü¸¡ÓÚ100mlµÄTE»º³åÒºÖС£Óó¬ÉùÆ÷(Branson Ultrasonics Co.£¬USA)ÆÆËéËùµÃµÄϸ°û¡£
ÆÆËéÒºÔÚ4¡æ¡¢6000rpmÏÂÀëÐÄ30·ÖÖÓ£¬½«ËùµÃµÄ¿ÅÁ£Ðü¸¡ÔÚ10mlµÄ±äÐÔÒºÖÐ(8Më壬10mM Tris£¬pH 8.0)¡£Ðü¸¡ÒºÔÚÊÒÎÂÏÂÕñµ´4Сʱ£¬²¢Èܽ⣬Ȼºó½«Õñµ´ÒºÔÚ4¡æ¡¢6000rpmÏÂÀëÐÄ30·ÖÖÓ¡£ÊÕ¼¯ÉÏÇå²¢ÓÃ0.2¦Ìm¹ýÂËÆ÷¹ýÂË¡£ÓÃBradfordµ°°×¼ì²â·¨(Bradford£¬M.M.£¬Anal.Biochem.£¬72248-54£¬1976)¶¨Á¿ÂËÒºÖаüº¬µÄµ°°×ÖÊ£¬È»ºóÓù̶¨Òº(40£¥¸ÊÓÍ£¬PBS£¬pH 7.4)Ï¡ÊÍÖÁŨ¶ÈΪ1mg/mL¡£
ʹÓÃ΢ÕóÁÐÆ÷£¬ÒÔ¼ä¸ô300-500¦Ìm(500/cm2)½«Ï¡ÊÍÒºÔÚº¬È©ÀàÎïÖʵÄÔØ²£Æ¬ÉϵãÑù(Yoon£¬S.H.µÈ£¬J.£¬Microbiol.Biotechnol.£¬1021-6£¬2000)£¬²¢ÔÚ30¡æÏ³±ÊªµÄ·´Ó¦ÊÒÖй̶¨1Сʱ¡£È»ºóÔÚÊÒÎÂÏÂÓë·â±ÕÒº(1£¥ BSA£¬PBS£¬pH 7.4)·´Ó¦1Сʱ£¬´Ó¶øÖƵõ°°×ÖÊоƬ¡£ÓÃÏàͬ¹Ì¶¨ÒºÏ¡Ê͵Ä1mg/mL¿ÏÆÕëÄ£¬1mg/mL BSA£¬1mg/mLÊÝËØºÍÁ×ËỺ³åÒºÓÃ×÷¶ÔÕÕ¡£
(2)·ÖÎöÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×ºÍµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃʵʩÀý2-(1)ÖÆµÃµÄµ°°×оƬÓÃÏ´µÓÒº(20mM Tris£¬150mM NaCl£¬10mMEDTA£¬1mM EGTA£¬0.1£¥ Triton-X100£¬pH 7.5)Ï´µÓ3´Î¹²5·ÖÖÓ£¬È»ºóÓü¤Ã¸ÈÜÒº(50mM Tris£¬10mM MgCl2£¬pH 7.5)Ï´µÓ¡£È»ºó½«200¦Ìl¼¤Ã¸ÈÜÒº(°üº¬100¦ÌM ATP)É¢²¼ÔÚоƬÉÏ£¬Óø²¸Ç¿×¸²¸Ç£¬È»ºóÓëÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×Ï໥×÷ÓÃ1Сʱ¡£
Ï໥×÷Óúó£¬Óü¤Ã¸ÈÜÒº³ä·ÖÏ´µÓµ°°×ÖÊоƬ£¬½«200¦Ìl¼¤Ã¸·´Ó¦Òº(°üº¬100¦ÌM ATPºÍ10µ¥Î»µÄcAMP-ÒÀÀµÐ͵°°×¼¤Ã¸)É¢²¼ÓÚоƬÉÏ£¬Óø²¸Ç¿×¸²¸Ç£¬È»ºóÓëÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×Ï໥×÷ÓÃ1Сʱ¡£Ï໥×÷Óúó£¬ÓÃÁ×ËỺ³åÒº(PBS£¬pH 7.4)³ä·ÖÏ´µÓµ°°×ÖÊоƬ£¬È»ºóоƬÉϵÄÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×ÓëCy3±ê¼ÇµÄ¿¹Á×Ëữ˿°±ËΌÌå·´Ó¦¡£È»ºó£¬ËùµÃµÄÈÜÒº¾­³ä·ÖÏ´µÓºó£¬200gÏÂÀëÐÄ1·ÖÖÓ£¬ÍêÈ«³ýÈ¥¹ýÁ¿µÄÈÜÒº¡£½Ó×Å£¬ÓÃScanArray 5000(Axon Instrument£¬Forster£¬USA)¼¤¹âɨÃèÒÇ·ÖÎö·´Ó¦(ͼ5)¡£
ͼ5ÊÇÊÝËØ-¿ÏÆÕëĵ°°×ºÍµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äÏ໥×÷ÓõÄÓ«¹â·ÖÎöÕÕÆ¬¡£ÔÚͼ5ÖУ¬1´ú±í1mg/mLµÄÊÝËØ-¶þ¾ÛÌå¿ÏÆÕëÄ£¬2´ú±í10±¶Ï¡Ê͵ÄÊÝËØ¶þ¾ÛÌ壬3´ú±í1mg/mLµÄÊÝËØ-µ¥Ìå¿ÏÆÕëÄ£¬4´ú±í10±¶Ï¡Ê͵ÄÊÝËØµ¥Ì壬P´ú±íPBS£¬K´ú±í¿ÏÆÕëÄ(1mg/mL)¡£
Èçͼ5Ëùʾ£¬µ°°×¼¤Ã¸AÏÔʾ³öÓëÈÚºÏÁËÊÝËØµÄ¿ÏÆÕëļäµÄÌØÒìÐÔÏ໥×÷Ó㬵«ÊÇÓë¿ÏÆÕëĵĵ¥¶ÀÐÎʽûÓвúÉúÏ໥×÷Óá£ÔÚ2ºÍ4ËùʾµÄÏ¡ÊÍ״̬£¬¶þ¾ÛÌå±íÏÖ³ö±Èµ¥Ìå¸ü¸ßµÄ·´Ó¦ÐÔ¡£Òò¶ø£¬ÕýÈçËùÔ¤Áϵ쬷¢ÏֵͷÖ×ÓÁ¿µÄëÄÓëøµ°°×·´Ó¦ÐԺܵͣ¬¶øÓëÁ¬½Óµ°°×ÈçÊÝËØÈںϵÄëľßÓи߷´Ó¦ÐÔ£¬ÆäÖУ¬ÓëÁ¬½Óµ°°×ÒÔ¶þ¾ÛÌåµ°°×·½Ê½ÈںϵÄëÄÐÎʽ±Èµ¥ÌåÐÎʽÈںϵÄëÄÐÎʽ±íÏÖ³ö¸ü¸ßµÄ·´Ó¦ÐÔ¡£
ʵʩÀý3ʹÓù̶¨ÁËÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄµ°°×ÖÊоƬÀ´·ÖÎöÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëÄÓëµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃ(1)ÖÆ±¸ÆäÉϹ̶¨ÁËÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄµ°°×ÖÊоƬ¾­ÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3ת»¯µÄÖØ×éE.coliÔÚºÍʵʩÀý2-(1)ÏàͬµÄÌõ¼þÏÂÅàÑø£¬ÆäÖÐÖØ×éÖÊÁ£pTLMK3°üº¬±àÂëÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×µÄ»ùÒò£¬È»ºóÅàÑøµÄϸ°ûÓó¬ÉùÆ÷ÆÆËé¡£ÆÆËéÒºÔÚ4¡æ¡¢6000rpmÏÂÀëÐÄ30·ÖÖÓ£¬ÊÕ¼¯ÉÏÇ壬ÓÃÆ½ºâÈÜÒº(50mM NaH2PO4£¬300mM NaCl£¬10mMßäßò£¬pH 8.0)͸Îö£¬½Ó×ÅÓÃÄøòüºÏµÄÊ÷Ö¬´¿»¯(Quiagen£¬USA)£¬ÔÙÓÃPBS͸Îö£¬È»ºó¾­0.2¦ÌmµÄ¹ýÂËÆ÷¹ýÂË¡£²ÉÓÃʵʩÀý2-(1)ÖÐÏàͬµÄ·½·¨¶¨Á¿Â˳öÒºÖаüº¬µÄµ°°×ÖÊ£¬È»ºóµãÑùÔÚº¬È©ÀàÎïÖʵÄÔØ²£Æ¬ÉÏ£¬´Ó¶øÖƵõ°°×ÖÊоƬ¡£
(2)·ÖÎöÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×Óëµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃʹÓÃʵʩÀý3-(1)ÖÆµÃµÄµ°°×оƬ£¬ÒÔʵʩÀý2-(2)ÖÐÏàͬµÄ·½·¨À´·ÖÎöÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×Óëµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃ(¼ûͼ6)¡£Í¼6ÊÇÆ»¹ûËáø-¿ÏÆÕëĵ°°×Óëµ°°×¼¤Ã¸AÖ®¼äµÄÏ໥×÷ÓõÄÓ«¹â·ÖÎöͼ¡£ÔÚͼ6ÖУ¬1´ú±íÑôÐÔ¶ÔÕÕ(Cy3±ê¼ÇµÄ¿¹Á×Ëữ˿°±ËΌÌå)£¬2-1´ú±íÊÝËØ-µ¥Ìå¿ÏÆÕëÄ£¬2-2´ú±íÊÝËØ-¶þ¾ÛÌå¿ÏÆÕëÄ£¬3´ú±í¿ÏÆÕëÄ£¬4´ú±íPBS£¬5´ú±íÆ»¹ûËáø-µ¥Ìå¿ÏÆÕëÄ¡£
Èçͼ6Ëùʾ£¬µ°°×¼¤Ã¸AÏÔʾ³öÓëÈÚºÏÁËÊÝËØ»òÆ»¹ûËáøµÄ¿ÏÆÕëÄÖ®¼äµÄÌØÒìÐÔÏ໥×÷Ó㬵«ÊÇÓë¿ÏÆÕëĵĵ¥¶ÀÐÎʽûÓвúÉúÏ໥×÷ÓûòºÜÈõµÄÏ໥×÷Óá£Òò´Ë£¬Èçͼ5ÖÐËùʾµÄ½á¹û£¬µ°°×ÖÊоƬÉϵĵͷÖ×ÓÁ¿ëÄÓëøµ°°×·´Ó¦ÐԺܵͣ¬µ«ÊÇÓëÁ¬½Óµ°°×ÈçÆ»¹ûËáø»òÊÝËØÈںϵÄëľßÓкÍøµ°°×µÄ¸ß·´Ó¦ÐÔ¡£
ʵʩÀý4ʹÓù̶¨ÁËÊÝËØ-Ab1ëĵĵ°°×ÖÊоƬÀ´·ÖÎöÊÝËØ-Ab1ëÄÓëAb1¼¤Ã¸Ö®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃ(1)ÖÆ±¸ÆäÉϹ̶¨ÁËÊÝËØ-Ab1ëĵĵ°°×ÖÊоƬ¾­ÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLADת»¯µÄÖØ×éE.coliÔÚºÍʵʩÀý2-(1)ÏàͬµÄÌõ¼þÏÂÅàÑø£¬ÆäÖÐÖØ×éÖÊÁ£pLAMºÍpLAD°üº¬±àÂëÊÝËØ-Ab1ëĵĻùÒò¡£´ÓÅàÑøµÄE.coliÖзÖÀëÊÝËØ-Ab1ëÄ£¬ÔÚº¬È©ÀàÎïÖʵÄÔØ²£Æ¬ÉϵãÑù£¬´Ó¶øÖƵõ°°×ÖÊоƬ¡£
(2)·ÖÎöÊÝËØ-Ab1ëÄÓëAb1¼¤Ã¸Ö®¼äµÄÏ໥×÷ÓÃʵʩÀý4-(1)ÖÆµÃµÄµ°°×оƬÓÃÏ´µÓÒº(PBS£¬pH 7.5)Ï´µÓ3´Î¹²5·ÖÖÓ£¬È»ºóÓü¤Ã¸ÈÜÒº(50mM Tris£¬10mM MgCl2£¬1mM EGTA£¬2mM¶þÁòËÕÌÇ´¼£¬0.01£¥ Brij 36£¬pH 7.5)Ï´µÓ¡£È»ºó½«°üº¬100¦ÌM ATPµÄ200¦Ìl¼¤Ã¸ÈÜҺɢ²¼ÔÚоƬÉÏ£¬Óø²¸Ç¿×¸²¸Ç£¬È»ºóÓëÊÝËØ-Ab1ëÄÏ໥×÷ÓÃ1Сʱ¡£Ï໥×÷Óúó£¬Óü¤Ã¸ÈÜÒº³ä·ÖÏ´µÓµ°°×ÖÊоƬ£¬½«200¦Ìl¼¤Ã¸ÈÜÒº(°üº¬100uM ATPºÍ100µ¥Î»µÄAb1¼¤Ã¸)É¢²¼ÓÚоƬÉÏ£¬Óø²¸Ç¿×¸²¸Ç£¬È»ºóÓëÊÝËØ-Ab1ëÄÏ໥×÷ÓÃ1Сʱ¡£
Ï໥×÷Óúó£¬ÓÃÁ×ËỺ³åÒº(PBS£¬pH 7.4)³ä·ÖÏ´µÓµ°°×ÖÊоƬ£¬È»ºóоƬÉÏÈÜÒºÓëCy5±ê¼ÇµÄ¿¹Á×Ëữ˿°±ËΌÌå·´Ó¦£¬¾­³ä·ÖÏ´µÓºó£¬200gÏÂÀëÐÄ1·ÖÖÓ£¬ÍêÈ«³ýÈ¥¹ýÁ¿µÄÈÜÒº¡£½Ó×Å£¬¶ÔÏ໥×÷ÓõĽá¹û½øÐзÖÎö(ͼ7)¡£
ͼ7ÊÇÊÝËØ-Ab1ëĺÍAb1¼¤Ã¸Ö®¼äÏ໥×÷ÓõÄÓ«¹â·ÖÎöÕÕÆ¬¡£ÔÚͼ7ÖУ¬1´ú±íÊÝËØ-¶þ¾ÛÌåAb1£¬2´ú±íÊÝËØ-µ¥ÌåAb1£¬P´ú±íPBS¡£Èçͼ7Ëùʾ£¬Ab1¼¤Ã¸±íÏÖ³öÓëÈÚºÏÁËÊÝËØµÄAb1µ¥ÌåºÍ¶þ¾ÛÌå¼äµÄÌØÒìÐÔÏ໥×÷Óá£
½áºÏ¸½Í¼¶Ô±¾·¢Ã÷½øÐÐÁËÏêϸµÄÃèÊö£¬µ«ÊDZ¾ÁìÓòµÄÆÕͨ¼¼ÊõÈËÔ±ÄܺÜÈÝÒ×Àí½â˵Ã÷ÊéÖеÄʵʩÀý½ö½öÊÇÓÅÑ¡µÄʵʩ·½Ê½£¬ËüÃDz»ÊÇÓÃÀ´ÏÞÖÆ±¾·¢Ã÷µÄ¡£Òò¶ø£¬±¾·¢Ã÷µÄʵ¼Ê·¶Î§½«Óɺ󸽵ÄȨÀûÒªÇó¼°ÆäµÈͬÌåÏÞ¶¨¡£
¹¤ÒµÓ¦ÓÃÐÔÈçÉÏËùÊö£¬Ê¹Óñ¾·¢Ã÷µÄS-L-SPÐ͵°°×ÖÊоƬÄÜÔÚµ°°×ÖÊоƬÉÏÌá¸ßµÍ·Ö×ÓÁ¿ëÄÓë¸ß·Ö×ÓÁ¿Ã¸Ö®¼äµÄ·´Ó¦ÐÔ£¬²¢ÇÒÌá¸ßëÄÓë·´Ó¦ÐÔ¿¹ÌåÖ®¼äµÄ·´Ó¦ÐÔ£¬´Ó¶øÄÜ¿ìËÙÓÐЧµØ·ÖÎöëÄÓëµ°°×ÖÊÖ®¼äµÄÏ໥×÷Óá£Òò¶ø£¬±¾·¢Ã÷µÄµ°°×ÖÊоƬÄÜÓÐЧºÍ¾­¼ÃµØÓÃÓÚÑо¿ºÍÓ¦Ó㬰üÀ¨´ó¹æÄ£ËÑË÷¡¢Éú»¯·ÖÎö¡¢·ÖÎöеĺòÑ¡»¯ºÏÎ¼²²¡µÄÕï¶ÏµÈ¡£
ÐòÁбí<110>º«¹ú¿ÆÑ§¼¼ÊõÔº<120>Ò»ÖÖ·ÖÎöµ°°×ÖÊÓëµ×ÎïëÄÖ®¼äÏ໥×÷Óõĵ°°×ÖÊоƬ<130>PCF051165C<140>PCT/KR2003/002183<141>2003-10-18<150>KR10-2003-0000464<151>2003-01-04<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>7<212>PRT<213>È˹¤<220>
<223>¿ÏÆÕëÄ<400>1Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly1 5<210>2<211>33<212>DNA<213>È˹¤<220>
<223>ÒýÎï1<400>2cggaattcat atggtgccca tccaaaaagt cca 33<210>3<211>48<212>DNA<213>È˹¤<220>
<223>ÒýÎï2<400>3gcggatcctt agcccaggct cgcacgacgc aggcacccag ggctgagg 48<210>4<211>53<212>DNA<213>È˹¤<220>
<223>ÒýÎï3<400>4gcggatcctt agcccaggct cgcgcggcgc agggggccca ggctcgcacg acg 53<210>5<211>53<212>DNA<213>È˹¤<220>
<223>ÒýÎï4
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