专利名称：瘦肉精多残留联检试纸卡的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种快速检测微量“瘦肉精”的器具，特别是涉及一种“瘦肉精”多残留分析的金标层析检测试纸卡。
背景技术：
“瘦肉精”是指一类药物，任何能够促进瘦肉生长、减少脂肪沉积的物质都可以叫做“瘦肉精”，包括“克伦特罗”(Clenbuterol，CL)，盐酸克伦特罗是其盐酸盐，“莱克多巴胺” aactopamine，RAC，也译为雷托巴胺)、“沙丁胺醇”(Salbutamol，SAL)、“特布他林” (Terbutaline, TBL)和“西马特罗”(Cimaterol，CIM)等。“瘦肉精”在肉用动物生产中剂量为治疗量的5-10倍时，具有促进肌肉发育和脂肪分解作用，可以提高肉用动物胴体瘦肉率。因为消费者对瘦肉的特殊偏好，瘦肉产出率高的猪可以卖个好价钱，添加“瘦肉精”给养殖户带来了额外收益。因此，受不法利益的驱使，养殖户常在养殖环节添加“瘦肉精”到动物饲料中去。但是“瘦肉精”是一种选择性β2_肾上腺素受体激动剂，副作用极大，当摄入量较大时会造成心血管系统的损害和出现严重的神经症状。当人们食用了含“瘦肉精”残留的动物内脏和肉品后，会造成急性或慢性食肉中毒，�：ο颜叩慕】蛋踩�。目前为止没有一个国家批准“盐酸克伦特罗”可用于动物生产中，但长期以来一直存在着非法使用，在世界各地造成严重食物中毒的事件并不鲜见。在我国北京、香港、上海、浙江、广东、山东、河北、 广西、黑龙江和安徽等地也出现了“瘦肉精”的中毒事件，极大地威胁着消费者的身心健康。 因国家对盐酸克伦特罗的严格管控，现在出现了“莱克多巴胺”、“沙丁胺醇”等所谓的“新型瘦肉精”产品。用于“瘦肉精”残留检测的方法较多，(1)理化分析方法，如高压液相色谱仪 (High performance liquid chromatography, HPLC)、气相色谱(Gas chromatography, GC)、薄层层析(Thin-layer chromatography，TLC)、毛细管区域电泳法(Capillary zone electrophoresis，CE)等；(2)免疫分析法，如放射免疫法(Radio-immunoassay，RIA)、酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)等；(3)生物测定法，如微生物学测定法(microbiological assays,ΜΑ)、 放射受体测定法(rediorec印tor assays,RA) 等。但这些方法有的需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，需要时间较长，限制了其应用范围，难以在生产实际中推广应用。免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作“瘦肉精”的筛查有独特的优势，是需要优先发展的检测技术，但目前“瘦肉精”多残留试纸检测技术在国内尚属空白，急待研究解决。
实用新型内容本实用新型要解决的技术问题提供一种适用于现场检测的特异、敏感、快速和简便的瘦肉精多残留联检试纸卡。[0006]本实用新型的技术方案一种瘦肉精多残留联检试纸卡，包括塑料支撑物和试纸芯，塑料支撑物包括底座和面板，其中底座上设有安装试纸芯的固定槽，面板上设有加样孔和结果显示窗，试纸芯由样品垫、金标物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成，层析膜上设有检测线和对照线，所述金标物结合垫为吸附有二 五种混合金标抗体的玻璃纤维棉，金标抗体为胶体金标记的抗瘦肉精的单克隆抗体或多克隆抗体，检测线为二 五条相应的瘦肉精-载体蛋白结合抗原或人工合成的模拟结合抗原，对照线为羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体印制而成，检测线和对照线沿层析膜横向平行排列。所述金标抗体和相应的瘦肉精-载体蛋白结合抗原或人工合成的模拟结合抗原为第一组金标抗盐酸克伦特罗CL抗体，检测线为CL-载体蛋白结合抗原；第二组金标抗莱克多巴胺RAC抗体，检测线为RAC -载体蛋白结合抗原；第三组金标抗沙丁胺醇SAL 抗体，检测线为SAL-载体蛋白结合抗原；第四组金标特步特林TBL抗体，检测线为TBL-载体蛋白结合抗原；第五组金标抗西马特罗CIM抗体，检测线为CIM-载体蛋白结合抗原；采用其中的二组、三组、四组或五组，分别组成二联检试纸卡、三联检试纸卡、四联检试纸卡或五联检试纸卡。所述吸水垫采用滤纸、海绵或无纺布制作，所述衬板用不吸水的硬质塑胶条制作。所述样品垫采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制作；层析膜采用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜制成，对照线采用硝酸纤维素膜、 纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。本实用新型的积极有益效果①试纸卡特异性强，敏感性高，最低检出限可达到lppb，符合我国瘦肉精的限量检测要求。②试纸卡实现了“瘦肉精”多残留金标层析的快速检测，用同一试纸卡一次加样， 可同时检测多种“瘦肉精”残留物，克服了常规单项检测试纸卡一次只能检测一种药物的不足，实现了较高通量的检测，大大节省了检测时间，在提高工作效率的同时节省了检测成本。G")使用该试纸卡时，无需其它额外试剂和仪器，用于现场检测在5min内即可判定检测结果，简便、快速。④使用该试纸卡以棕红色线条“ I ”显示检测结果，判定依据形象、直观，简单明了，不易出现人为误判。⑤本实用新型的试纸卡可节省检测费用，适用范围广。使用该试纸卡比用仪器分析和常规单项检测试纸条的费用大幅下降；同时该试纸卡适用范围广，可满足不同层次人员的需要，包括专业检验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、加工企业和养殖场户等，可保持对非法添加瘦肉精的威慑，保障食品安全，便于推广应用。
图1、试纸芯侧视结构示意图。[0019]图2、试纸芯俯视结构示意图。图3、二项联检试纸卡面板构造俯视图。图4、试纸卡底座构造示意图。图5、三项联检试纸芯俯视结构示意图。图6、三项联检试纸卡面板构造俯视图。图7、五项联检试纸芯俯视结构示意图。图8、五项联检试纸卡面板构造俯视图。图中，1 衬板；2 样品垫；3 金标物结合垫；4 层析膜；5 吸水垫；6 对照线；7:检测线；8:加样孔；9:显示窗；10:面板；11:底座；12:固定槽。
具体实施方式
在制备“瘦肉精”多残留联检层析试纸卡时，需要先制备某种“瘦肉精”-载体蛋白结合抗原、“瘦肉精”金标物，制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体或羊抗兔IgG抗体，或兔抗载体蛋白IgG抗体，进而制备成试纸芯，并安装在塑料壳底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起。实施例一“瘦肉精” 二项联检金标层析试纸卡。在得到瘦肉精-载体蛋白结合抗原、瘦肉精金标物和IgG抗体的基础上，组装得到本发明的试纸卡(以盐酸克伦特罗和莱克多巴胺二联检为例)。试纸卡塑料壳包括底座11和面板10，底座上设有安装试纸芯的固定槽12，面板上设有加样孔8和显示窗9，显示窗旁边设有1\、T2和C标识，参见图1-4。试纸芯的构造衬板1用硬质塑胶条制成；样品垫2用玻璃纤维棉制成；金标物结合垫3为吸附有胶体金标记的抗CL和抗RAC单克隆抗体的玻璃纤维棉；层析膜4用硝酸纤维素膜，其上分别用偶联CL-载体蛋白和RAC-载体蛋白的结合抗原制备两条检测线7 (隐形)，载体蛋白为牛血清白蛋白。两条检测线由样品端依次排列，用羊抗小鼠IgG抗体制备对照线6 (隐形)，对照线6采用硝酸纤维素膜；检测线和对照线平行排列成“ I I |”;吸水垫5用吸水滤纸制成。将样品垫、金标物结合垫、层析膜、吸水垫依次相互搭接并粘贴固定在衬板上，组装成CL和RAC联检试纸芯。将试纸芯安装在底座11上的固定槽12内，样品垫和层析膜分别与面板上的加样孔和显示窗相对应，两条隐形检测线和隐形对照线分别与显示窗旁边的1\、T2和C相对应， 嵌合面板后即制成试纸卡。检测样品检测样品可为尿样。检测样品制备尿样无需特殊处理，如过于浑浊，静置后离心取上清即可。操作方法检测时，将试纸卡平放，从加样孔滴加待测样品，1 5min内从显示窗判定检测结果。结果判定如只有C位置隐形对照线处显示一条棕红色线“ I ”，表示CL和RAC检测结果均为阳性，说明在待测样品中含有这两种待测药物；如在T1和C位置显示两条棕红色线“ I I ”时，表示CL检测结果为阳性，RAC检测结果为阴性，说明在待测样品中含CL而不含RAC;如在T2和C位置显示两条棕红色线“ I I ”，表示CL检测结果为阳性，RAC检测结果为阴性，说明在待测样品中含CL而不含RAC ；如在I\、T2和C位置显示三条棕红色线“ II I ”，表示CL和RAC检测结果均为阴性，说明在待测样品中不含CL和RAC;如在层析膜上没有棕红色线显示，则表明试纸卡已失效。实施例二“瘦肉精”二项联检金标层析试纸卡(以盐酸克伦特罗和莱克多巴胺二联检为例)试纸卡结构和实施例一基本相同，不同之处在于样品垫采用尼龙膜制成；用抗 CL和抗RAC的多克隆抗体替代抗CL和抗RAC的单克隆抗体，制备金标结合垫；层析膜用尼龙膜制成，用羊抗兔IgG抗体替代羊抗鼠IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”，对照线采用纯纤维素膜制成；其它如检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再赘述。实施例三“瘦肉精”二项联检金标层析试纸卡(以盐酸克伦特罗和莱克多巴胺二联检为例)。试纸卡结构和实施例一基本相同，不同之处在于样品垫采用聚偏二氟乙烯膜制成；用CL-载体蛋白和RAC-载体蛋白结合抗原替代抗CL和抗RAC的单克隆抗体，制备金标结合垫；层析膜用聚偏二氟乙烯膜，用兔抗载体蛋白IgG抗体替代羊抗鼠IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”，对照线采用羧化纤维素膜制成；其它如检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例一，不再赘述。实施例四“瘦肉精”三项联检金标层析试纸卡(以盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇三联检为例)。试纸卡塑料壳的构造包括底座和面板，底座设有安装试纸芯的固定槽，面板上设有加样孔和显示窗，显示窗旁边设有I\、T2、T3和C标识。参见图5-6。试纸芯的构造衬板用硬质塑胶条制成；样品垫采用聚酯膜制成；金标物结合垫为吸附有胶体金标记的抗CL、抗RAC和抗SAL单克隆抗体的玻璃纤维棉；层析膜用醋酸纤维素膜，其上分别用偶联CL-载体蛋白、RAC-载体蛋白和SAL-载体蛋白结合抗原制备的三条隐形检测线“ I ”，所述载体蛋白为鸡卵清白蛋白。三条隐形检测线由样品端依次排列，用兔抗小鼠IgG抗体制备隐形对照线“ I ”，对照线采用纯纤维素膜，三条检测线和对照线平行排列组合成“ Illl ”；吸水垫用吸水滤纸制成。将样品垫、金标物结合垫、层析膜、吸水垫依次相互搭接粘贴固定在衬板上，组装成CL、RAC和SAL联检试纸芯。将试纸芯安装在底座的固定槽内，试纸芯的样品垫和层析膜分别与面板上的加样孔和显示窗相对应，层析膜上的三条检测线和对照线分别与显示窗旁边的1\、T2、T3和C相对应，嵌合面板后制成试纸卡。其它包括检测样品制备和操作方法均同实施例一，不再赘述。结果判定如只有C位置显示1条棕红色线“ I ”时，表示CL、RAC和SAL检测结果均为阳性，说明在待测样品中含这3种待测药物；如显示1条棕红色T线和1条棕红色C线 “ I I ”时，表示2种药物检测结果为阳性，另外1种药物检测结果为阴性，说明在待测样品中含对应的2种药物而不含另外1种药物；如显示2条棕红色T线和1条棕红色C线“ I
I I ”时，表示1种药物检测结果为阳性，另外2种药物检测结果为阴性，说明在待测样品中含1种药物而不含另外2种药物；如显示3条棕红色T线和1条棕红色C线“ I I I |” 时，表示3种药物检测结果均为阴性；如在层析膜上没有棕红色线显示，则表明试纸卡已失效。[0046]实施例五“瘦肉精”三项联检金标层析试纸卡(以克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇三联检试纸为例)试纸卡构造和实施例四基本相同，不同之处在于样品垫采用玻璃纤维棉制成； 用抗CL、抗RAC和抗SAL的多克隆抗体替代抗CL、抗RAC和抗SAL的单克隆抗体，制备金标结合垫；用羊抗兔IgG抗体替代兔抗鼠IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例四，不再重述。实施例六“瘦肉精”三项联检金标层析试纸卡(以克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇三联检试纸为例)。试纸卡构造和实施例四基本相同，不同之处在于用CL-载体蛋白、RAC-载体蛋白和SAL-载体蛋白结合抗原替代抗CL、抗RAC和抗SAL的单克隆抗体，制备金标结合垫； 用兔抗载体蛋白IgG抗体替代兔抗鼠IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例四，不再重述。实施例七“瘦肉精”五项联检金标层析试纸卡试纸卡塑料壳的构造包括底座和面板，底座上设有安装试纸芯的固定槽，面板上设有加样孔和显示窗，显示窗旁设有1\、112、113、114、115和(标识。参见图7-8。试纸芯的构造衬板用硬质塑胶条制成；样品垫用玻璃纤维棉制成；金标物结合垫为吸附有胶体金标记的抗CL、抗RAC、抗SAL、抗CML和抗TBL单克隆抗体的玻璃纤维棉； 层析膜用硝酸纤维素膜，其上分别用偶联CL-载体蛋白、RAC-载体蛋白、SAL-载体蛋白、 CML-载体蛋白和TBL-载体蛋白结合抗原制备的隐形检测线“ I ”，载体蛋白为人血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。五条检测线由样品端依次排列，用羊抗兔IgG抗体制备隐形对照线“ I ”，对照线采用羧化纤维素膜，六条线平行排列组合成“ I Illl I”;吸水垫用吸水滤纸制成。将样品垫、金标物结合垫、层析膜、吸水垫依次相互搭接粘贴固定在衬板上，组装成CL、RAC、SAL、 CML和TBL联检试纸芯。将试纸芯安装在底座的固定槽内，试纸芯的样品垫和层析膜分别与面板上加样孔和显示窗相对应，层析膜上的五条检测线和对照线分别与显示窗旁边的1\、 T2> T3、T4、T5和C相对应，嵌合面板后制成试纸卡。其它包括检测样品制备和操作方法均同实施例一，不再赘述。结果判定若C位置不显示1条棕红色线“ I ”时，表示本次检测无效；C位置显示 1条棕红色线“ I ”时，表示本次检测有效，并且Ι\、τ2、τ3、τ4、τ5哪一条显色即表示对应的那种待测物在本次检测中未检出，不显色的即表示对应的那种待测物在本次检测中被检出， 结果为阳性。如此可在一次测定中判断五种被检物的阴阳性，即五联检试纸卡。实施例八瘦肉精五项联检金标层析试纸卡试纸卡构造和实施例七基本相同，不同之处在于用抗CL、抗RAC、抗SAL、抗CML 和抗TBL的多克隆抗体替代抗抗CL、抗RAC、抗SAL、抗CML和抗TBL的单克隆抗体，制备金标结合垫；用兔抗鼠IgG抗体替代羊抗兔IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”。其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例七，不再赘述。实施例九瘦肉精五项联检金标层析试纸卡试纸卡构造和实施例七基本相同，不同之处在于用CL-载体蛋白、RAC-载体蛋白、SAL-载体蛋白、CML-载体蛋白和TBL-载体蛋白结合抗原替代抗CL、抗RAC、抗SAL、抗CML和抗TBL的单克隆抗体，制备金标结合垫；用兔抗载体蛋白IgG抗体替代羊抗兔IgG抗体在层析膜上制备隐形对照线“ I ”。 其它包括检测样品制备、操作方法和结果判定等均同实施例七，不再赘述。
权利要求1.一种瘦肉精多残留联检试纸卡，包括塑料支撑物和试纸芯，塑料支撑物包括底座和面板，其中底座上设有安装试纸芯的固定槽，面板上设有加样孔和结果显示窗，试纸芯由样品垫、金标物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成，层析膜上设有检测线和对照线，其特征是所述金标物结合垫为吸附有二 五种混合金标抗体的玻璃纤维棉，金标抗体为胶体金标记的抗瘦肉精的单克隆抗体或多克隆抗体，检测线为二 五条相应的瘦肉精-载体蛋白结合抗原或人工合成的模拟结合抗原，对照线为羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔 IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体印制而成，检测线和对照线沿层析膜横向平行排列。
2.根据权利要求1所述的试纸卡，其特征是所述金标抗体和相应的瘦肉精-载体蛋白结合抗原或人工合成的模拟结合抗原为第一组金标抗盐酸克伦特罗CL抗体，检测线为CL-载体蛋白结合抗原；第二组金标抗莱克多巴胺RAC抗体，检测线为RAC -载体蛋白结合抗原；第三组金标抗沙丁胺醇SAL抗体，检测线为SAL-载体蛋白结合抗原；第四组 金标特步特林TBL抗体，检测线为TBL-载体蛋白结合抗原；第五组金标抗西马特罗CIM抗体，检测线为CIM-载体蛋白结合抗原；采用其中的二组、三组、四组或五组，分别组成二联检试纸卡、三联检试纸卡、四联检试纸卡或五联检试纸卡。
3.根据权利要求1所述的试纸卡，其特征是所述吸水垫采用滤纸、海绵或无纺布制作，所述衬板用不吸水的硬质塑胶条制作。
4.根据权利要求1所述的试纸卡，其特征是所述样品垫采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制作；层析膜采用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜制成，对照线采用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
5.根据权利要求1所述的试纸卡，其特征是所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、人血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
专利摘要本实用新型公开一种“瘦肉精”多残留分析的金标层析检测试纸卡，包括塑料支撑物和试纸芯，试纸芯由样品垫、金标物结合垫、层析膜和吸水垫依次粘贴到衬板上制成，金标物结合垫为吸附有二～五种混合金标抗体的玻璃纤维棉，金标抗体为胶体金标记的抗瘦肉精的单克隆抗体或多克隆抗体，检测线为二～五条相应的瘦肉精-载体蛋白结合抗原，对照线为羊抗或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG或兔抗载体蛋白IgG抗体印制而成，检测线和对照线沿层析膜横向平行排列。本实用新型特异性强，敏感性高，最低检出限可达到1ppb，实现了“瘦肉精”多残留金标层析的快速检测，用同一试纸卡一次加样，可同时检测多种“瘦肉精”残留物，大大节省了检测时间，在提高工作效率的同时节省了检测成本。
文档编号G01N33/577GK202133666SQ201120205560
公开日2012年2月1日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者刘庆堂, 张改平, 李孟顺, 李青梅, 杨继飞, 杨艳艳, 柴书军, 滕蔓, 职爱民, 胡骁飞, 赵东, 邓瑞广, 邢广旭 申请人:河南省农业科学院
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