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专利名称：赤潮毒素腹泻性贝毒的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用抗腹泻性贝毒的单克隆抗体与腹泻性贝毒抗原结合，而分析检测环境样品中的腹泻性贝毒含量的快速方便检测试剂盒。
背景技术：
目前腹泻性贝毒的分析方法有生物小鼠法、高效液相色谱法和免疫化学方法。生物小鼠法是将藻或贝等生物组织的萃取液注射进小鼠腹腔内，根据小鼠死亡时间，对照标准表，查得腹泻性贝毒的含量，该方法误差大、重现性差、费时麻烦；高效液相色谱法是将藻或贝等生物组织的萃取液经前处理，衍生反应后，进行液相色谱分离，结合荧光检测器或直接经质谱检测器，经与标准品的值对照，计算得出腹泻性贝毒的含量，该方法准确、成熟，并能分析鉴定不同的异构体，但缺点是前处理麻烦，仪器昂贵，需要专门的分析技术人员，不适合现场及大批量样品的分析；免疫化学方法是通过免疫动物制得特异性抗体(多克隆抗体或单克隆抗体)，利用抗体对腹泻性贝毒的结合反应，按照酶联免疫分析方法制成检测试剂盒，用于腹泻性贝毒的分析检测，该方法简便、快速，可同时分析大批量样品，国外有售成品试剂盒，但价格昂贵。

发明内容
为了解决腹泻性贝毒的现场、快速、大批量样品的分析问题，本技术发明提供一种国产、利用抗腹泻性贝毒的单克隆抗体研制的间接竞争酶联免疫分析腹泻性贝毒的试剂盒，价格比同类进口试剂盒便宜5-10倍，适于现场、快速、大批量样品的检测。
本技术发明解决其技术问题所采用的技术方案是用水溶性碳二亚胺方法，将腹泻性贝毒的主要成分软海绵酸(OA)偶联到血蓝蛋白(KLH)上，加佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌抗软海绵酸单克隆抗体(MAb-OA)的细胞株，扩大培养，小鼠体内诱生腹水，蛋白G柱纯化，制得抗软海绵酸的单克隆抗体，用合成的软海绵酸-卵清蛋白(OA-OVA)包被96孔酶标板，加入OA标准品或样品，再加入Mab-OA，包被抗原OA与自由的OA竞争抗体Mab-OA，自由的OA和抗体复合物被洗去，与包被抗原OA结合的抗体Mab-OA再与酶标记的二抗结合，经底物显色，终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光值(OD)，OD值越大，样品中自由的OA含量越少，对照标准品回归的方程，计算样品OA的含量。
本技术发明的有益效果是利用得到的阳性细胞可大量制得抗软海绵酸的单克隆抗体，所研制的试剂盒成本低廉、价格便宜，该试剂盒的灵敏度可达0.1ng/mL。
具体实施例方式
以过量的碳二亚胺和OA与KLH反应的方法，制得高分子比的OA-KLH偶联物，多次免疫，得到免疫良好的脾细胞，融合后，应尽早检测，筛选分泌抗体能力强的细胞株以得到优良的抗体，选择合适的包被比例(1∶1000)和抗体稀释度(1∶20000)，以得到最佳的检测灵敏度(0.1ng/mL)。
权利要求
一种快速简易分析检测赤潮毒素腹泻性贝毒的试剂盒，在包装盒内有已包被检测抗原的可拆96孔酶标板、浓缩洗液、特异性检测抗体、酶标二抗、腹泻性贝毒标准品、稀释液、显色剂、终止液，其特征是按说明书制得的待分析样品和系列稀释的标准品分别加在不同孔中与检测抗体反应，经孵育、洗涤，顺序与酶标二抗、显色液和终止液反应，在酶标仪上测得各孔的吸光值，将标准品的吸光值回归分析得到方程，计算得出样品中的毒素含量。
全文摘要
一种能够快速灵敏检测环境样品中的赤潮毒素腹泻性贝毒的酶联免疫检测试剂盒。它是利用合成的高分子比的抗原OA－KLH，经多次免疫BLAB/c鼠，通过细胞融合，筛选、诱生腹水和蛋白柱提纯得到特异性的抗软海绵酸(腹泻性贝毒的主要成分)的单克隆抗体，选择1∶1000的包被比例和1∶20000的抗体稀释度，研制出间接竞争酶联免疫分析赤潮毒素腹泻性贝毒软海绵酸的检测试剂盒，该试剂盒成本低廉、价格便宜，操作简便快速，适合大批量样品的分析，灵敏度可达0.1ng/ml。
文档编号G01N33/531GK1892225SQ200510081659
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者刘仁沿, 许道艳, 梁玉波 申请人:国家海洋环境监测中心