专利名称：一种经济的快速筛选水稻高蛋白品种的方法
技术领域：
本发明专利涉及利用比较1粒水稻种子的横断面筛选高蛋白品种进行水稻遗传育种的领域，是一种快速经济的筛选水稻高蛋白品种的方法。
背景技术：
目前，分析种子蛋白质含量的方法，第一步是提取种子中的蛋白质，然后检测蛋白质含量，常用的有凯氏定氮法、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法。实验过程需要的种子样品多、配制的试剂多，费时费力。近红外光谱测定蛋白质含量操作也相对简单，但需要的 5g(约250粒)的样品才能得到较好的结果。染料吖啶橙的活性基团与淀粉的羟基通过静电作用稳定的结合在一起，在488nm 的激发光下使细胞呈绿色荧光。二硫键的交联作用使蛋白质在淀粉的周围形成网状结构， 降低了水分向籽粒内部渗入的速度，所以在浸泡过程中，高蛋白品种吸收的水分少，细胞间得不到润滑，从而在掰断的过程中，细胞破裂，形成粗糙的横断面，而蛋白含量低的品种，吸收大量水分，细胞间有水分的润滑，容易分离，掰断后形成平滑的横断面。
发明内容
为了提高稻米的营养品质，筛选高蛋白品种进行遗传育种是一项重要措施。本发明提供了一种经济的快速筛选高蛋白水稻品种的方法，仅需1粒精米，将其掰开染色后，用激光共聚焦显微镜观察其横断面结构，根据其光滑、粗糙程度筛选出高蛋白品种，用于以后的遗传育种。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是(1)将要检测的稻米用小型精米机磨成精米；(2)将利用凯氏定氮法测定蛋白质含量(8-9%左右)的精米作为对照；(3)从待检样品中各随机挑选1粒精米作为材料，分别浸泡在装有蒸馏水的1. 5毫升离心管中3小时；(4)用镊子将1粒精米取出，徒手掰至自然断裂；(5)将断裂的精米用吖啶橙(0. 02%, ν/ν)染色10分钟，需避光进行，可在锡箔纸包裹的1. 5毫升小离心管中进行；(6)用滴管吸取蒸馏水洗1分钟，也需避光进行；(7)将米的切面用双面胶固定在载玻片上用激光共聚焦显微镜观察其横断面，横断面粗糙的材料代表蛋白质含量高的品种。本发明的有益效果是，一是不需种植太多的实验材料，不需配制大量试剂，成本低；二是方法简单，技术难度�。菀渍莆眨蝗鞘室擞谏秆∷靖叩鞍灼分纸性咏灰糯种种首试创葱卵芯�。只需要实验室有激光共聚焦显微镜仪器即可。下面结合实施例对本发明进一步说明。高蛋白粳型恢复系的筛选。
具体实施例方式以经过凯氏定氮法检测蛋白质含量的日本优质粳稻品种越光(蛋白质含量 6. 48% )作为低蛋白对照，以蛋白质含量为9. 45%的粳型恢复系m90作为中等蛋白含量的对照，待测的粳型恢复系品种暂命名为mll9。三个品种各随机选取1粒精米，浸于1. 5毫升小离心管的蒸馏水中3小时，徒手将其掰至自然断裂，避光条件下用吖啶橙(0. 02%, ν/ν) 染色10分钟，蒸馏水冲洗1分钟。用尼康ECLIPSE 90i激光共聚焦显微镜进行观察，采用 Ar/Kr激光器，激发光488nm，发射光为575nm_605nm，NIH Image 1. 6. 2软件对图像进行分析。我们注意到越光的横断面非常平滑，而mll9的横断面非常粗糙，m90的横断面粗糙平滑的面积比例相当。因此mll9是蛋白质含量最高的品种，随后我们用凯氏定氮法进一步验证ml 19蛋白质含量高达13. 30%，证实此方法行之有效。
权利要求
1.一种通过观察1粒水稻精米种子的横断面快速判断其蛋白质含量高低的方法，其主要特征是(1)样品米的状态及数量；(2)样品的处理；(3)横断面的观察；(4)观察结果的分析。
2.根据权利1所要求的新方法，其特征是将要检测的稻米用小型精米机磨成精米，分别挑选1粒完整的精米作为样品，其中1份样品是经过凯氏定氮法测定蛋白质含量在8-9% 作为对照。
3.根据权利1所要求的新方法，其特征是将待测样品1粒精米分别浸泡在装有蒸馏水的1. 5毫升离心管中3小时；用镊子将1粒精米取出，徒手掰至自然断裂；将断裂的精米用吖啶橙(0. 02%, ν/ν)染色10分钟，需避光进行，可在锡箔纸包裹的1.5毫升小离心管中进行；用滴管吸取蒸馏水洗1分钟。
4.根据权利1所要求的新方法，其特征是将米的切面用双面胶固定在载玻片上用激光共聚焦显微镜进行观察，采用Ar/Kr激光器，激发光488nm，发射光为575nm-605nm。
5.根据权利1所要求的新方法，其特征是可用激光共聚焦显微镜随机带的图像处理软件对图像进行分析，对比观察精米横断面的情况，比对照样品的横断面粗糙则说明其蛋白含量高，粗糙程度越高蛋白含量越高，反之则蛋白含量低。
全文摘要
遗传育种领域种质资源创新领域一种经济的快速筛选水稻高蛋白品种的新方法。以经过凯氏定氮法检测蛋白质含量在8-9％左右的水稻品种作为中等蛋白质含量对照，从待测品种各随机选取1粒精米，浸于1.5毫升小离心管的蒸馏水中3小时，徒手将其掰至自然断裂，避光条件下用吖啶橙(0.02％，v/v)染色10分钟，蒸馏水冲洗1分钟。用尼康ECLIPSE 90i激光共聚焦显微镜进行观察，采用Ar/Kr激光器，激发光488nm，发射光为575nm-605nm，NIH Image 1.6.2软件对图像进行分析。精米的横裂面比对照粗糙的表明蛋白含量比对照高，粗糙程度越高，蛋白含量越高，反之则蛋白含量低。此方法可用很少的样品快速筛选水稻的高蛋白品种用于以后的遗传育种进行水稻品质改良。
文档编号G01N21/17GK102564958SQ20101062254
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者丁毅, 华泽田, 王芳 申请人:天津天隆农业科技有限公司
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