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专利名称：血液β－羟丁酸电化学传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对血样中β-羟丁酸进行定量检测的传感器，用于定量快速测量血液酮体水平。
背景技术：
近年来，在诊断中，测量血液中β-羟丁酸浓度的含量得到越来越多的重视。目前，β-羟丁酸检测方法主要是通过大型血液生化分析仪利用β-羟丁酸试剂盒来进行。但该方法存在的问题是需要使用特殊装置，测定所需血量较多、时间较长，价格昂贵，只适合在大型医院中进行，不能在小型诊所或是病人家庭中使用。
技术内容本发明的目的在于提供一种能够在各种场所方便快速测量血液中β-羟丁酸含量的传感器，并且本发明只需微量血液便可在短时间内测出β-羟丁酸的含量。
本发明是这样实现的血液β-羟丁酸电化学传感器包括绝缘性基板，基板上覆有工作电极和参比电极。基板上设定一血样测量工作区，该工作区范围内包括了工作电极和参比电极。血样测量工作区范围外部覆有化学惰性的绝缘覆盖膜。血样测量工作区范围内部工作电极和参比电极上覆有能够与β-羟丁酸反应并产生电子传递的酶试剂反应膜，酶试剂反应膜分别与工作电极和参比电极相连。工作电极和参比电极分别通过电极引线通出绝缘覆盖膜外。
所述的酶试剂反应膜含有β-羟丁酸脱氢酶、黄递酶、NAD、电子传递体、用于酶活性保持的稳定剂和亲水高分子物质。β-羟丁酸脱氢酶为每平方厘米0.01-200μ活性单位。反应层中超过100单位的β-羟丁酸脱氢酶不仅会增加产品成本，还会引起响应电流的不稳定。黄递酶为每平方厘米0.01-600μ活性单位。
亲水高分子物质可以使样品溶液快速地渗透进入酶反应层进行反应，亲水高分子物质可以是羧基甲基纤维素(CMC)、羟基乙基纤维素(HEC)、羟基丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素和乙基纤维素、乙基羟基乙基纤维素、羧基甲基乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸和聚氨基酸、聚苯乙烯碘酸、乳胶、丙烯酸或其盐、甲基丙烯酸或其盐、淀粉或其衍生物、马来酐或其盐类、明胶、琼脂糖凝胶、树胶等。
在本发明中，反应层中含有电子受体，当NADH在电极中被氧化时，电子受体被还原。电子传递体可以是铁氰化钾、对苯醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物、β-萘醌-4-磺酸钾、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物等。电子传递体特别的优选为铁氰酸根化合物。
测量时，把含有β-羟丁酸的样品溶液施加在本生物传感器的酶试剂反应膜上，样品中的β-羟丁酸在一定电压下由β-羟丁酸脱氢酶的催化，与NAD发生氧化还原反应，生成的NADH在黄递酶的作用下将铁氰酸根化合物中的Fe3+还原，氧化还原过程中所产生的响应电流正比于样品中的β-羟丁酸底物的浓度。因此，只要测量出传感响应电流即可知道β-羟丁酸的含量，测量方便、用时短。
该血液β-羟丁酸电化学传感器制作方法包含以下步骤1、首先利用厚膜丝印或薄膜蒸涂技术在绝缘基片上形成包含工作电极和参比电极的电极系统。工作电极所用材料选择金、铂、碳等电化学特性稳定的惰性材料的一种；参比电极材料以Ag/AgCl为佳，也可采用金、铂、碳等电化学特性稳定的惰性材料中的一种。采用前述惰性材料时，为减少工艺复杂性，通常选用与工作电极相同的材料。
2、采用厚膜丝印或其他工艺形成具有一定工作电极面积和参比电极面积的反应工作区间。通过适当的几何设计，使反应工作区内的工作电极具有恒定的面积，以保证该发明的测量精确度。
3、配制含有具有一定有效量、能与β-羟丁酸反应作用的酶和辅助试剂以及电子传递体的溶液。
4、采用精密点样机或其他点样设备将含有固定有效量的酶和辅助试剂以及电子传递体溶液，喷滴到反应工作区的电极上。
5、生化试剂的干燥成膜处理。
6、β-羟丁酸电化学生物传感器的分割和封装。
采用本发明的β-羟丁酸电化学传感器可以随身携带，能够在包括小型诊所或是病人家庭中等各种场所使用，并且只需微量血液便可在一分钟内快速测出β-羟丁酸的含量。


图1为本发明的结构分解示意图；图2为图1的局部纵向剖面图；图3为本发明一实施例测量的β-羟丁酸浓度/传感器响应电流关系图。
具体实施例方式
如图1和图2所示，血液β-羟丁酸电化学传感器，包括绝缘性基板1，基板1上覆有工作电极2和参比电极3。基板1上设定一血样测量工作区6，该工作区6范围内包括了工作电极2和参比电极3。血样测量工作区6范围外部覆有化学惰性的绝缘覆盖膜5。血样测量工作区6范围内部工作电极2和参比电极3上覆有能够与β-羟丁酸反应并产生电子传递的酶试剂反应膜4。酶试剂反应膜4分别与工作电极2和参比电极3相连，工作电极2和参比电极3分别通过电极引线7、8通出绝缘覆盖膜5外。
酶试剂反应膜4含有β-羟丁酸脱氢酶、NAD、电子传递体、黄递酶、用于酶活性保持的稳定剂和亲水高分子物质。具体的是在pH值为8.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠混合缓冲液中配成含有β-羟丁酸脱氢酶500单位/ml、黄递酶1500单位/ml、NAD 8mg/ml，铁氰化钾50mg/ml，羧甲基纤维素4mg/ml的酶试剂液，取2微升上述酶液滴加在图1的电极反应区上，将其在45摄氏度的恒温干燥箱中干燥五分钟，形成酶反应层。
经测试，将浓度分别为0、10、20、35、70mg/dL的β-羟丁酸溶液2微升分别滴加在上述方法制成的β-羟丁酸传感器的反应区中，60秒后在300mV电压下测试其反应电流，结果如下表所示

β-羟丁酸浓度与传感器响应电流关系如图3所示，可见β-羟丁酸浓度与传感器响应电流成线性正比例关系，因此只需测出传感响应电流大小即可方便、快捷地测出β-羟丁酸的含量。
权利要求
1.血液β-羟丁酸电化学传感器，包括绝缘性基板(1)，其特征在于基板(1)上覆有工作电极(2)和参比电极(3)；基板(1)上设定一血样测量工作区(6)，该工作区(6)范围内包括了工作电极(2)和参比电极(3)；血样测量工作区(6)范围外部覆有化学惰性的绝缘覆盖膜(5)；血样测量工作区(6)范围内部覆有能够与β-羟丁酸反应并产生电子传递的酶试剂反应膜(4)，酶试剂反应膜(4)分别与工作电极(2)和参比电极相连(3)；工作电极(2)和参比电极(3)分别通过电极引线(7、8)通出绝缘覆盖膜(5)外。
2.如权利要求1所述的血液β-羟丁酸电化学传感器，其特征在于所述的酶试剂反应膜(4)含有β-羟丁酸脱氢酶、黄递酶、NAD、电子传递体、用于酶活性保持的稳定剂和亲水高分子物质。
3.如权利要求2所述的血液β-羟丁酸电化学传感器，其特征在于所述的电子传递体为铁氰根化合物。
4.如权利要求2所述的血液β-羟丁酸电化学传感器，其特征在于所述的β-羟丁酸脱氢酶为每平方厘米0.01-200μ活性单位、黄递酶为每平方厘米0.01-600μ活性单位。
全文摘要
本发明涉及一种对血样中β－羟丁酸进行定量检测的传感器，用于定量快速测量β－羟丁酸水平。传统的β－羟丁酸浓度的检测方法主要是通过大型血液生化分析仪，所需血量较多、时间较长，价格昂贵。本发明包括绝缘性基板，基板上覆有工作电极和参比电极；基板上设定一血样测量工作区，该工作区范围内包括了工作电极和参比电极；血样测量工作区范围外部覆有化学惰性的绝缘覆盖膜；血样测量工作区范围内部覆有能够与β－羟丁酸反应并产生电子传递的酶试剂反应膜，酶试剂反应膜含有β－羟丁酸脱氢酶、NAD、电子传递体、黄递酶、用于酶活性保持的稳定剂和亲水高分子物质。本发明使用简便，并且只需微量血液便可在短时间内测出β－羟丁酸的含量。
文档编号G01N27/333GK1456880SQ0312909
公开日2003年11月19日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者李光, 管文军, 潘敏, 胡贵权, 马念章, 陈裕泉 申请人:浙江大学