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专利名称：基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法
技术领域：
本发明涉及ー种生物样品的浄化方法，尤其是涉及ー种基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的浄化方法。
背景技术：
近几年来，纳米金由于其独特的物理化学特性而在生物医药领域中被广泛应用。在生物-纳米分析技术领域，基于纳米金分散/集聚所致溶液颜色变化的均相生物传感技术仍是研究热点。但是，由于纳米粒子状态对溶液理化性质的高度依赖性及复杂生物样品 基质易对目标分子检测信号产生严重干扰，因此，如何实现繁杂生物样品基质中纳米粒子的快速分离和目标分子的直接、准确检测，是当前納米医学及生物分析领域的ー个重要前沿课题。目前，分离纳米粒子一般采用高速或梯度离心、膜透析或超滤、电泳、排阻色谱、纳米表面修饰、溶剂挥发、有机试剂相转换等方法，其存在的缺点是操作麻烦，耗时费カ；所用试剂成本较高，所用装置复杂且能耗高，经济效益较低。最近，研究发现采用无机盐电解质可以选择性沉淀出胶体金混合制备液中不同形状的纳米金粒子(ひ挪.Commun. , 2011，47 (14) : 4180-4182)，然而该方法不能有效排除复杂生物样品中杂质对目标物的检测干扰，也难以满足生物样品分析中同时面临的纳米金分离和待测物提纯等诸多前处理要求，因而无法直接运用更有效的仪器手段如色谱对目标组分做准确的測定。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供ー种操作简便，成本低，可同时实现纳米金分离和待测物提纯，从而准确测定目标组分的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法。本发明解决其技术问题采用的技术方案是基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的浄化方法，包括以下步骤
(O按含纳米金的生物样品的体积亲水性有机溶剂的体积=1: (O. 5-10)(优选1:0. 8-2，更优选1:1)比例向生物样品中加入亲水性有机溶剂混匀，得混合样品；
所述含纳米金的生物样品，包括但不限于动物和人的体液、组织匀浆、植物提取液、微生物提取液、体外生物样品，所述体外生物样品包括细胞、亚细胞系统、体外重组酶及抗原-抗体反应体系；
(2)按含纳米金的生物样品的体积无机盐的质量=I:(O. 05-5)(优选1:0. 08-2，更优选1:0. I)的比例向混合样品中加入无机盐，超声溶解1-3分钟，再用涡旋震荡器震荡1-3分钟；
(3)在温度-20 20°C(优选0-10°C，更优选4°C )下静置8_15分钟，或在2500-12000转/分离心4-10分钟后，取上层有机相清液，直接用于液相色谱进样分析，含纳米金的下层液移至新离心管中用纯水超声复溶。进ー步，所述亲水性有机溶剂可为こ腈或丙酮等亲水性有机溶剂，优选こ臆。进ー步，所述无机盐可为氯化钠(对彡5 nm的粒子金聚沉效果较好)、硫酸镁(对85-100 nm的粒子金聚沉效果较好)、硫酸钠、氯化镁中的ー种或几种的混合物，优选氯化钠与硫酸镁的混合物，更优选质量比1:1的氯化钠与硫酸镁的混合物。本发明先将含纳米金的生物样品溶液与こ腈或丙酮等亲水性有机溶剂互溶，使生物样品基质稀释和变性，有利于纳米粒子与样品的分离和待测目标物在溶剂中的分散，然后引入无机盐电解质，利用其诱导胶体金聚沉和盐析分相萃取的双重效应，再经低温静置或离心，将水溶液(含纳米金)和亲水性有机溶剂(含目标组分)从单相互溶体系中分离成上下两相。由于低温会加快水-こ腈体系分相，短时间静置即可达到完全分离。 其中混合样品中的纳米粒子聚沉入下层水相，按紫外-可见光谱吸光度数值计算聚沉去除率可达98%，下层聚集纳米金可经纯水重溶解，通过电镜观察发现复溶后其尺寸形态无显著变化；待测组分则富集于上层有机相，分离提纯后的有机溶剂(即上层清液)可直接用于色谱分析(提取回收率达95%以上)。与现有技术相比，本发明具有以下优点所用亲水性有机溶剤、无机盐便宜易得，成本低；无需使用复杂的分离设备，低耗环保；简便快速、适应性强、重复性好，可同时实现从均一样品溶液中快速分离胶体金、富集提取目标化合物，能广泛用于血液、组织匀浆、酶、重组蛋白、细胞提取液等各种生物样品中纳米金的分离和基质的净化。


图I是本发明实施例2所得下层水相的电镜 图2是本发明实施例2所得上层净化清液直接进样的高效液相色谱图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进ー步说明。实施例I
本实施例包括以下步骤(1)取体外药物代谢酶反应体系样品200微升，向样品中加入200微升冰こ腈，涡旋震荡2分钟，得混合样品；
所述体外药物代谢酶反应体系样品的配制(以细胞色素P450中的CYP2D6为酶反应代
表)
在135微升磷酸盐缓冲液(100 mmol/L, pH7. 4)中依次加入5微升解冻后的人肝微粒体(蛋白浓度为20 mg/mL),10微升特异性底物药物右美沙芬(O. 4 mmol/L，由磷酸盐缓冲液配制)，10微升纳米金水溶液(10 nm, I mg/mL),混匀，在37°C预孵育5分钟；然后再加入40微升NADPH溶液(50 mmol/L,由磷酸盐缓冲液临时配制)，在37°C反应10分钟；
(2)向混合样品中加入O.02 g氯化钠与硫酸镁的混合物(氯化钠的质量硫酸镁的质量=1:1)，超声溶解2分钟，再用涡旋震荡器震荡I分钟；
(3)置于4°C的冰箱中静置10分钟，分相后获得上层有机溶液160微升，取10微升上清液直接进样，对右美沙芬及其代谢产物去甲右美沙芬进行高效液相色谱-荧光检测分析。
结果表明纳米粒子和样品基质分离完全，重复进样(30次)不影响色谱柱分离的基线背景、保留时间、峰形和信号強度，经此处理后两个目标物的回收率均为97%。实施例2
本实施例包括以下步骤
(1)取200微升含胶体金(100nm,0. 05 mg/mL)的人体血清样品，向样品中加入200微升冰こ腈，涡旋震荡2分钟，得混合样品；
所述人体血清中加有右美沙芬药物及其代谢物去甲右美沙芬，所述右美沙芬药物的浓度为O. 05mmol/L，所述去甲右美沙芬的浓度为8 mmol/L ； (2)向混合样品中加入O.02 g硫酸镁，超声溶解2分钟，涡旋震荡I分钟；
(3)在转速3000转/分下离心5分钟，分相后获得上层有机溶液160微升，取10微升上清液直接进样，对右美沙芬及其代谢产物去甲右美沙芬进行高效液相色谱-荧光測定分析。结果表明纳米粒子和样品基质分离完全，重复进样(30次)不影响色谱柱分离的基线背景、保留时间、峰形和信号強度，目标物右美沙芬的回收率为96%，目标物去甲右美沙芬的回收率为98%。实施例3
本实施例包括以下步骤
(1)取酿酒酵母提取液样品200微升，向样品中加入200微升丙酮，涡旋震荡2分钟，得混合样品；
所述酿酒酵母提取液样品的配制在140微升酿酒酵母微粒体磷酸盐缓冲液(蛋白浓度20 mg/mL, 100 mmol/L，pH7. 4)中依次加入10微升特异性底物药物右美沙芬(O. 4 mmol/L,由磷酸盐缓冲液配制)，10微升纳米金水溶液(10 nm, I mg/mL),混勻,在37°C预孵育5分钟；然后再加入40微升NADPH溶液(50 mmol/L，由磷酸盐缓冲液临时配制)，在37°C反应10分钟；
(2)向混合样品中加入O.06 g氯化钠，超声溶解2分钟，再用涡旋震荡器震荡I分钟；
(3)置于4°C的冰箱中，静置10分钟，分相后获得上层有机溶液140微升，取10微升上清液直接进样，对右美沙芬及其代谢产物去甲右美沙芬进行高效液相色谱-荧光检测分析。结果表明纳米粒子和样品基质分离完全，重复进样(30次)不影响色谱柱分离的基线背景、保留时间和峰形和信号強度，目标物右美沙芬及其代谢产物去甲右美沙芬的回收率均为96%。
权利要求
1.一种基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的浄化方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)按含纳米金的生物样品的体积亲水性有机溶剂的体积=1:(0. 5-10)比例向生物样品中加入亲水性有机溶剂混匀，得混合样品； 所述含纳米金的生物样品，包括动物和人的体液、组织匀浆、植物、微生物提取液以及体外生物样品，其中体外生物样品包括细胞、亚细胞系统、体外重组酶及抗原-抗体反应体系; (2)按含纳米金的生物样品的体积无机盐的质量=I:(0.05-5)的比例向混合样品中加入无机盐，超声溶解1-3分钟，再用涡旋震荡器震荡1-3分钟； (3)在温度-20 20°C下静置8-15分钟，或在2500-12000转/分离心4_10分钟后，取上层有机相清液直接用于液相色谱进样分析，含纳米金的下层液移至新离心管中用纯水超声复溶。
2.根据权利要求I所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，其特征在于所述亲水性有机溶剂为こ腈或丙酮。
3.根据权利要求I或2所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，其特征在于所述无机盐为氯化钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化镁中的ー种或几种的混合物。
4.根据权利要求3所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，其特征在于所述无机盐为质量比1:1的氯化钠与硫酸镁的混合物。
5.根据权利要求I或2所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的浄化方法，其特征在干步骤(1)，所述含纳米金的生物样品的体积亲水性有机溶剂的体积=1: (0. 8-2)。
6.根据权利要求I或2所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，其特征在于步骤(2)，所述含纳米金的生物样品的体积无机盐的质量=1: (0. 08-2)。
7.根据权利要求I或2所述的基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，其特征在于步骤(3)，所述静置的温度为0-10°C。
全文摘要
基于无机盐促相变分离纳米金的生物样品的净化方法，包括以下步骤(1)按含纳米金的生物样品的体积:亲水性有机溶剂的体积=1:(0.5-10)比例向生物样品中加入亲水性有机溶剂混匀得混合样品；(2)按含纳米金的生物样品的体积:无机盐的质量=1:(0.05-5)的比例向混合样品中加入无机盐，超声溶解1-3分钟，再用涡旋震荡器震荡1-3分钟；(3)在温度-20～20℃静置，或离心分层后，取上层有机相清液。本发明无需使用复杂试剂和分离设备，低耗环保，简便快速，适应性强，重复性好，可同时实现生物样品中纳米金的分离与基质的充分净化。
文档编号G01N30/06GK102662015SQ201210105828
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者朱卫桃, 汤领, 王晓莹, 郭宾, 陈波 申请人:湖南师范大学