专利名称：荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗甲胎蛋白抗体。
甲胎蛋白(Fetoprotein，α-FP)是60年代发现的，在大部分肝癌病人的血液中，可以发现甲胎蛋白。70年代我国就通过大规模的普查，发现甲胎蛋白可用于肝癌的早期诊断。以后又发现，根据甲胎蛋白与植物凝聚素(Lectin)的结合能力，可以将正常胎儿和其它肝病病人所产生的甲胎蛋白与肝癌病人所产生的甲胎蛋白区分，其中肝癌病人所产生的甲胎蛋白被称为甲胎蛋白异质体，它能与多种植物凝聚素结合。而正常胎儿和其它肝病病人所产生的甲胎蛋白，不能与植物凝聚素相结合，因此，根据这种与植物凝聚素结合能力的差异，现用于肝癌的特异性诊断。
目前所用的技术，是先将植物凝聚素加入到已溶化的琼脂糖中，制备成胶板，再加血清进行电泳；电泳后在其垂直方向倒入已混合125-碘标记的抗甲胎蛋白抗体的琼脂糖胶，进行第二相电泳，然后通过放射自显影，显示甲胎蛋白异质体是否存在。这种方法需要三天左右才能获得结果，同时具有同位素污染产生，并对实验人员有伤害。
荧光标记技术的产生已有数十年的历史，它将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微术的高度精确性结合起来。过去的技术，需要用荧光显微镜或荧光分光光度计来观察或测量。
本发明的目的在于提供一种用荧光素取代125-碘标记的抗甲胎蛋白抗体及其制备方法。
荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体是一种具有如下特性的抗体1)分子量16万；2)吸光特性在260，280，490nm波长具有吸收峰，在全波光照射下，可发出黄绿光；3)生物特性具有与甲胎蛋白进行特异性抗原-抗体反应能力。
荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法是1)配制荧光素，其量相当于抗甲胎蛋白抗体蛋白量的1／(50～150)；2)将配制好的荧光素滴加入抗甲胎蛋白抗体溶液中去；3)将反应物移入4～8℃冰箱，使其在低温下形成标记物；4)将标记溶液装入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0．01mol／L磷酸缓冲液(PBS)中，并在冰箱中继续透析；5)用葡聚糖凝胶(Sephadex)在0．01mol／L磷酸缓冲液平衡后，加入透析液，用相同的缓冲液洗脱，收集第一着色峰，即为所需的产物。
所用的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(FITC)、二氯三嗪基氨基荧光素(DTAF)、四乙基罗丹明(RB 200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TMRITC)等。
本发明用荧光素取代125-碘标记抗甲胎蛋白抗体，作为指示剂，使甲胎蛋白异质体的检测可在1小时内完成。由于本发明与免疫电泳技术结合起来，使荧光标记物得以浓缩，达到增强荧光强度的效果，只需普通的验钞机就可以观察，而不需使用昂贵的荧光显微镜或荧光分光光度计来观察或测量检测结果。另外，使用本荧光标记物，取代放射性125-碘标记抗甲胎蛋白抗体，可以避免放射性的�：σ约安恍枰褂梅派渥韵杂笆钡某逑唇浩璞福辜觳夥延么笪档停庋褂獗昙羌际醯挠τ梅段Т蟠笤黾�。本发明的主要用途为1)肝癌的检测；2)乙型肝炎病人癌变的早期检测(良性肝病不会产生异质体)；3)异常妊娠的检测。
荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体标记物的鉴定方法标记物的质量一般用荧光素量(F)与总蛋白质量(P)比值来确定。对FITC来说，F／P在1～2之间为好。
F／P=0．41×(荧光素 微克／毫升÷蛋白 毫克／微升)，P和F的含量用分光光度法测定。蛋白含量用260，280nm的吸光度(OD值)计算蛋白质浓度(毫克／毫升)=1．45OD280-0．74OD260。
荧光素的测定用已知量的荧光素制成标准曲线(即浓度与OD值曲线)，其中，吸收峰分别为FITC 490nm，RB200 570nm，TMRITC550nm，DTAF 495nm，分子量分别为FITC389，RB200 580，TMRITC 443，DTAF 466。
以下给出荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体制备方法的实例。
试剂甲胎蛋白抗体(anti-fetoprotein)可选用纯化马抗甲胎蛋白抗体或抗甲胎蛋白单克隆抗体。选用荧光素FITC。
配制1)0．025mol／L PH9．0碳酸盐缓冲液(CB)NaHCO32．10g，Na2CO30．16g，加入蒸馏水至100mL。
2)0．5mol／L PH9．5碳酸盐缓冲液(CB)NaHCO33．7g，Na2CO30．6g，加入蒸馏水至100mL。
其中1)2)中碳酸盐浓度0．02～0．5mol／L，PH8．5～9．5均可，也可以用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液代替碳酸盐缓冲液。
3)0．01mol／L PH7．2磷酸缓冲液(PBS)Na2HPO4·12H2O 2．58g，NaH2PO4·2H2O0．44g，NaCl 8．50g，加入蒸馏水至1000mL(其中浓度0．005-0．1mol／L，PH 6．8-8．0均可或用生理盐水代替此磷酸缓冲液。
4)抗甲胎蛋白抗体用0．025mol／L PH9．0碳酸盐缓冲液(CB)配成30mg／mL溶液。
制备1)取30mL的抗甲胎蛋白抗体溶液。
2)配制3mg(相当于甲胎蛋白抗体蛋白量1／100)的荧光素FITC，(FITC先溶于相当于抗体溶液量1／10即3mL的0．5mol／L PH9．5碳酸盐缓冲液(CB)中。)3)在电磁搅拌器的搅拌下，将FITC缓慢滴加入抗体溶液中去。在滴加荧光素(FITC)过程中，应经常测定抗体溶液的PH，如PH降低，可用0．5mol／K Na2CO3调整PH至9．0-9．5。PH偏低，标记慢，PH偏高，荧光素易分解，标记时间2～24小时，温度2～30℃。
4)荧光素加毕，将反应物移入4℃冰箱，继续搅拌12小时，或移入8℃冰箱，继续搅拌6小时。
5)将上述标记溶液装入透析袋中，在流水中透析5分钟，再移入2000mL的0．01mol／LPH7．2磷酸缓冲液(PBS)中，在4℃冰箱中继续透析4小时；或移入1000mL的PBS中，在8℃冰箱中继续透析3．5小时。
6)用葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25(或G-50)柱(1．2×30cm)，在0．01mol／L PH7．2磷酸缓冲液(PBS)平衡后，加入透析液，用相同的PBS溶液洗脱，收集第一着色峰，即为所需的产物。
本制备方法中，FITC量的计算一般以FITC∶蛋白量=1∶100为好，可从1∶50-150，反应前蛋白浓度5-50毫克／毫升；而标记时的温度，可从2-30℃，时间从2小时-24小时，其中温度低，反应时间长，温度高，反应时间短；标记时可以逐渐滴加FITC，也可以直接装入透析袋，通过搅拌反应10-24小时。如果抗甲胎蛋白抗体的蛋白浓度低，则装入透析袋标记为好。
在制备过程中，配制的荧光素可选用DTAF，这时可用硼酸钠缓冲液0．1mol／L PH9．0取代碳酸钠缓冲液为好。荧光素DTAF的配制量可相当于DTAF∶甲胎蛋白抗体蛋白量=1～2．0mg∶100mg，抗体蛋白溶液浓度10～30mg／mL。反应时间和温度与FITC相同。
配制的荧光素可选用TMRITC，配制量为TMRITC∶抗体蛋白=1∶20～40mg，结合反应时间为12～24小时，其余与FITC相同。
若选用RB200，则RB200必须先转化成磺酰氯(-SO2Cl)基，才能与抗体蛋白结合，RB200与加倍量的五氯化磷(1∶2)迅速研磨，在3～10分钟后加入5倍量的无水丙酮，抽提反应生成物，用滤纸过滤或离心去除不溶物，溶液可立即用于标记，或用安瓿封装，冰冻(≤-15℃)保存。将抗体溶液、碳酸盐缓冲液和生理盐水按1∶1∶1比例混合，抗体蛋白mg∶RB200=100∶0．1～0．5，最好在10℃以下，PH＞8．5的条件下进行结合反应，反应时间＞15小时。
权利要求
1．荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体，其分子量为16万，在260，280，490nm波长具有吸收峰，在全波长光照下，发出黄绿光，具有与甲胎蛋白进行特异性抗原-抗体反应能力。
2．荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法，其特征在于1)配制荧光素，其量相当于抗甲胎蛋白抗体蛋白量的1／(50～150)；2)将配制好的荧光素滴加入抗甲胎蛋白抗体溶液中去；3)将反应物移入4～8℃的冰箱中，使其在低温下形成标记物；4)将标记溶液装入透析袋中，在流水中透析，再移入1000～2000mL的0．01mol／L磷酸缓冲液中，并在冰箱中继续透析；5)用葡聚糖凝胶在0．01mol／L磷酸缓冲液平衡后，加入透析液，用相同的缓冲液洗脱，收集第一着色峰，即为所需的产物。
3．如权利要求2所述的荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法，其特征在于所说的荧光素为异硫氰酸荧光素，二氯三嗪基氨基荧光素，四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
4．如权利要求1和3所述的荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法，其特征在于所说的荧光素为异硫氰酸荧光素，其量相当于抗甲胎蛋白抗体蛋白量的1／100。
5．如权利要求2所述的荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法，其特征在于配制好的荧光素在搅拌的情况下滴加入抗甲胎蛋白抗体溶液中，溶液的PH值为9．0～9．5。
6．如权利要求2所述的荧光素标记的抗甲胎蛋白抗体的制备方法，其特征在于将反应物移入4～8℃冰箱中继续搅拌6～12小时。
全文摘要
涉及一种抗甲胎蛋白抗体。用荧光素标记,其分子量16万,在260,280,490nm波长具有吸收峰,在全波光照射下发黄绿色,具有与甲胎蛋白进行特异性抗原－抗体反应能力。制备时先配制荧光素,滴入抗甲胎蛋白抗体溶液中,将反应物移入冰箱,在低温下形成标记物,将标记溶液透析,移入磷酸缓冲液,再用葡聚糖凝胶平衡并洗脱即收集产物。用荧光素标记抗甲胎蛋白抗体,作为指示剂,使异质体检测可在1小时内完成,避免放射性�：�,检测费用低。
文档编号G01N33/52GK1281978SQ0011937
公开日2001年1月31日 申请日期2000年7月13日 优先权日2000年7月13日
发明者廖绵初, 李东辉 申请人:厦门大学
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