专利名称：诊断宫颈癌的方法
诊断宫颈癌的方法
交叉参考
本申请要求2003年7月四日提交的美国专利申请No. 10/630,590、2003年7 月25日提交的美国临时申请No.60/490,094、2003年2月27日提交的美国临时申请 No.60/450,464以及2002年9月9日提交的美国临时申请No.60/409J98的权利。发明领域
本发明涉及诸如在某些人乳头状瘤病毒(HPV)感染中所观察到的来源于致病生 物的生物学标记的检测以及运用这样的诊断法以鉴别受到感染并可能导致癌变或其他机 能紊乱的样本。所述发明也公开了作为一种肿瘤诊断手段用于在临床样本中检测致癌的 HPV E6蛋白的组合物、方法和试剂盒。
发明背景
宫颈癌是妇女中第二位最常见的肿瘤，宫颈癌与目前99.7%的高危险性人乳头 状瘤病毒感染有关。现在，每年在美国妇女中诊断出12,000个侵入性宫颈癌新病例，这 导致每年5,000人死亡。而且，全球范围内每年约有400,000例的宫颈癌并有近200,000 个死亡病例。人乳头状瘤病毒(HPV)是全球性传播疾病的最常见的原因之一。大体上， 50-75%的性活跃的男性和女性在其生命的某一时点会招致生殖器HPV感染。仅在美国 估计每年有5百50万人感染HPV，目前至少有2千万的感染者。100多个不同的HPV 纯病毒株按照其与子宫颈癌或与良性子宫颈损伤或子宫颈发育异常的关系大致分成了高 危险性和低危险性亚类。
大量证据指出HPV是宫颈癌的病原物质。1980年的多项研究报道了在子宫颈 发育异常、肿瘤以及源自宫颈癌的细胞系中存在HPV变种。进一步的研究表明致癌的 HPV 18基因组的E6-E7区域在宫颈癌细胞中被选择性保留，这说明HPV感染可能是引 发癌变的原因，而且维持细胞永生化或癌变状态需要E6-E7区域的持续表达。第二年， Sedman等人证实了在培养物中，来自HPV 16的E6-E7基因足以引起人角质化细胞的永 生化。Barbosa等人证实，虽然来自高危险性HPV的E6-E7基因能够转化细胞系，来自 诸如HPV 6和HPV 11的低危险性或非致癌变种的E6-E7区域不能转化人角质化细胞。 最近，Pillai等人对623例处于肿瘤发展不同阶段的子宫颈组织样本通过原位杂交检测了 HPV 16和18的感染并通过免疫细胞化学检测了 E6蛋白的表达，发现了组织学异常与 HPV感染之间的显著相关性。
现行的治疗策略专注于实际的子宫颈发育异常而不是更深层次的HPV感染。医 生每年对子宫颈发育异常的妇女进行筛查，并采用包括冷冻手术、激光切除和切除手术 在内的表面切除技术进行治疗。随着疾病的发展，治疗手段变得更具侵略性，这包括了 部分或完全子宫切除、放射治疗或化学治疗。对致癌的HPV感染的早期准确诊断以及针 对引发癌变的HPV感染的治疗，通过疾病进程的早期干预以防止宫颈癌的发展，存在重 大的需求。目前已有描述的人乳头状瘤病毒与局限于皮肤上皮层、或口腔、咽喉、呼吸 道以及最重要的与肛门和生殖器黏膜损害相关。包括HPV6和11在内的特殊的人乳头状瘤病毒类型经常引起良性的黏膜损伤，而其他诸如HPV 16和18的病毒类型以及许多其 他病毒株主要在高度损害和肿瘤中被发现。感染黏膜表面的个别类型的人乳头状瘤病毒 (HPV)被认为可能是引发子宫颈、肛门、阴茎、咽喉和口腔癌变、偶然引发甲周瘤以及 良性的肛门与生殖器疣的因素。采用对特殊HPV类型进行鉴定的方法来鉴别具有恶化风 险的癌变前损伤的患者。虽然在一些受人乳头状瘤病毒感染的病例中存在可见的肛门和 生殖器损伤，大部分受到HPV生殖道感染的个体不具有临床明显病征，但是可以采用子 宫颈涂片中存在的细胞形态特征分析来检测HPV感染。巴氏试验(Papanicolaou test)是 一种有效的筛查手段，但是由于存在假阳性和假阴性测试结果，这些试验遗漏了高比例 的HPV感染人群。此外，由于对检测结果的解读需要训练有素的病理学家，这样的试验 不适于全球范围的检测。
包括血清学化验、ELISA夹心检测和细胞培养在内的常规病毒检测方法没有商 用现货并/或不适于诊断和跟踪HPV感染。最近，可以采用几种以PCR(聚合酶链式反 应)为基础的HPV感染的检测方法。虽然所述检测方法有助于区分致癌性感染和非致癌 性感染，这些检测的实行是相当昂贵的，而且需要执行PCR操作的训练有素的技术人员 和/或光度计检测。此外，PCR具有天然的假阳性率，可能要借助于进一步的检测和不 必要的操作。由于已经表明，HPV的致癌性是建立在蛋白基础上的，HPVDNA或RNA 的早期检测可能导致身体免疫系统可以天然解决的不必要的医学步骤。
采用传统方法检测人样本(例如肿瘤样本)中致癌HPV存在许多困难。例如， 用抗体检测E6蛋白是困难的，因为人细胞中生成的E6含多种结构改变(如二硫键和磷酸 基团)，使得在细菌系统中生产的野生型E6蛋白或化学合成的E6肽不能识别人细胞中的 E6蛋白。而且，由于致癌E6蛋白没有共有的将其与非致癌E6蛋白相区别的抗原表位， 单一的抗体不能用于所有致癌E6HPV毒株的检测。
疾病的检测和诊断是治疗疾病的先决条件。疾病的许多标记和特征已被鉴定并 可用于疾病的诊断。受侵袭的细胞状态的改变先于许多疾病并且是许多疾病的特征。改 变可以包括受感染细胞中病原体基因或蛋白的表达、受侵袭细胞中基因或蛋白表达的改 变、以及细胞形态的改变。通过准确评估这些改变可以帮助检测、诊断和监测疾病。便 宜、快速、早期准确的病原体检测可以为治疗和预防结果介于身体不适到死亡之间的疾 病提供可能。
以下是感兴趣的重要出版物Munge:K2002)Front.Biosci.7 641-9 ； Glaunsinger (2000) Oncogene 19 5270-80 ； Gardiol (1999) Oncogene 18 5487-96 ； Pim (1999) Oncogenel8 7403-8; Meschede (1998) J.Clin.Microbiol.36 475-80; Kiyono (1997) Proc.Natl.Acad.Sci.94 11612-6;以及 Lee(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94 6670-5。此外，下列是感兴趣的专利和专利申请Bleul, 6,322,794 ； Cole, 6,344,314 ； Schoolnik, 5,415,995 ； Bleul, 5753233 ； Cole, 5,876,723 ； Cole, 5,648,459 ； Orth, 6,391,539 ； Orth, 5,665,535 ； Schoolnik, 4,777,239。
发明概述
这里提供了用于检测在多种细胞类型中(例如子宫颈、肛门、阴茎和咽喉细胞 中)可能导致致癌细胞转化或生物学异常的病原体蛋白的方法和组合物。这些方法和组 合物可以用于检测包括但不限于导致诸如宫颈癌、阴茎癌、肛门癌和咽喉癌在内的病原体。更具体地说，描述了用于检测临床样本中致癌的HPV E6的方法、组合物和检测试剂盒。
所述发明的一个优点是，与抗体不同，许多PDZ结构域蛋白结合大部分或所有 来自人乳状瘤病毒的HPVE6，由此可用于诊断宫颈癌和其它癌症。
图1是说明PDZ蛋白能特异性识别来自人乳状瘤病毒的致癌E6蛋白的柱状图。 采用ELISA检测方法证实PDZ蛋白(TIP-I)能特异性识别来自致癌病毒株(HPV 18)的 全长E6蛋白，但与非致癌病毒株(HPV 11)没有表现出任何反应性。系列1和系列2代 表独立实验。E6ab表示检测采用抗HPV18E6抗体而不是PDZ蛋白。
图2是说明PDZ与HPV 18E6PLs结合的度依赖性的线形图。本图采用改进的 ELISA检测方法测定TIP-I的PDZ结构域或MAGI-I (结构域2)与对应于来自HPV18的 E6蛋白的C-末端20个氨基酸的肽段的结合。图例中的数字代表独立实验。-RT表示 结合实验在室温下进行。没有-RT标志的数据系列是在4°C下进行的结合实验。
图3是说明抗HPV 18E6抗体识别GST-HPV 18E6融合蛋白的线形图。检测了 用HPV 18E6蛋白免疫的Balb/c小鼠第观天的血清与GST-HPV18E6蛋白或单独GST的 反应性。
图4. (A-D)是说明细胞溶解物对来自HPV 16的重组E6蛋白与不同的PDZ结构 域结合的影响的4个线形图。
图5. (A-B)是表明多种PDZ结构域能与细胞中致癌E6蛋白结合并共沉淀的放射 自显影图像。
图6是证明在幻他宫颈癌细胞系中检测到内源性HPV16E6蛋白的免疫印迹结果 的放射自显影图像。
图7是放射自显影图像说明，通过免疫印迹能在SHa宫颈癌细胞系中 检测到HPV16E6蛋白，在存在蛋白酶体抑制剂的条件下进行细胞溶解处理，检测结果得 到了加强。
图8是显示SiHa和CasKi子宫颈细胞系中HPV16E6蛋白的ELISA检测的线形图。
图9是细胞溶解物中HPV16E6蛋白的点杂交检测的放射自显影图像。
图10是SiHa和CasKi子宫颈细胞系的细胞溶解物中内源性HPV16E6蛋白的点杂交检测的放射自显影图像。
图11是说明能够在携带HPV16的宫颈肿瘤中检测到E6蛋白的免疫印迹的放射 自显影图像。
发明详述
I.定义
这里所使用的“标记物”或“生物学标记”是指生物样本中能够被测量或检测 的实体物。标记的例子包括核酸、蛋白或存在于生物样本中的化学物质。存在于人源的 生物样本中的病毒或病原体的蛋白或核酸是标记物的一个例子。
这里所使用的术语“分离的”是指多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞处于与其天然存在状态不同的环境中。分离的多核苷酸、多肽、抗体或宿主细胞通常是充分纯化 了的。这里所使用的术语“充分纯化”是指将化合物(例如多核苷酸、多肽或抗体)从 其自然环境中移出，至少60%、优选的是75%、最优选的是90%与其在天然条件下结合 的其他成分分离。因而，例如在总的A+B组合物中至少含85% (重量百分比)的A的 情况下，含有A的组合物与B “充分分离”。优选的是，A构成总的组合物A+B重量 比的至少约90%，更优选的是，A构成重量比的至少约95%或甚至99%。
术语“生物样本”包括得自生物体的并可以用于诊断或监测的多种类型的样 品。这一术语包括血样和其他生物来源的液体样本以及固体组织样本(如活体组织切片 样本或组织培养物或源自组织培养物的细胞及其后代)。所述术语包括在其获得后经过任 何方式处理过的样本，例如通过试剂处理、溶解或特定组分富集等方式。所述术语包括 临床样本，也包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶解物、血清、血浆、体液 和组织样本。术语“生物样本”必须将临床样本与可能的重组样本或源自重组样本的样 本加以区分。
被HPV “感染”的个体是指具有含HPV的细胞的个体。细胞内的HPV可能 不表现出任何其他的表型(即HPV感染的细胞不必定是癌细胞)。换言之，HPV感染的 细胞可以是癌前细胞(也就是除了可能与病毒感染相关的表型以外，没有表现出任何异 常表型的细胞)或癌细胞。
这里所使用的“融合蛋白”或“融合多肽”是指复合的蛋白，也就是由两条 (或更多)独立的、异源的、正常情况下没有融合在一条氨基酸序列中的多肽构成的一条 邻接的氨基酸序列。因此，一个融合蛋白可以包括含有两条完全不同的氨基酸序列或两 条相似或相同的多肽序列的单一的氨基酸序列，前提是假如未发现这些序列在自然界中 在正常情况下以所述相同的结构共存于单一的氨基酸序列中。融合蛋白通常可以采用核 酸重组方法(就是由编码本发明所述多肽的片段和编码异源蛋白的片段组成的重组基因 融合产物的转录和译结果)或本领域所熟知的化学合成方法制备。
这里所使用的“融合蛋白构建物”是指编码融合蛋白的多核苷酸。
“致癌HPV病毒株”是由国家癌症研究所(NCI，2001)确定的已知引起宫颈癌 的HPV病毒株。“致癌E6蛋白”是指上述致癌HPV病毒株所编码的E6蛋白。表3列 举了致癌病毒株的例子。这里没有特意列举的本领域所知的致癌HPV病毒株可以在国家 生物技术信息中心(National Center for biotechnology hiformation) (NCBI)的万维网网站上 获得。
“致癌E6蛋白结合伴侣”可以是与E6蛋白特异结合的任何分子。适宜的致癌 E6蛋白结合伴侣包括PDZ结构域(如下所述)、抗致癌E6蛋白的抗体、其他识别致癌 E6蛋白的蛋白(如p53、E6-AP或E6-BP)、DNA(即十字形DNA)以及其他如适体或来 源于噬菌体展示的单链抗体等的伴侣。在一些实施方案中，希望检测1个以上的致癌E6 蛋白(例如，来自HPV病毒株16、18和33的所有致癌E6蛋白或E6蛋白)，由此，致 癌E6蛋白结合伴侣可以是与这些蛋白结合的抗体或各自与一种不同蛋白结合的抗体的混 合物。如本领域所知的，这样的结合伴侣可以进行标记以便于其检测。通常，结合伴侣 与E6结合的亲和力是IO-5M或更高，如ΙΟ—Μ或更高、IO-7M或更高、1(Γ8Μ或更高(例 如 IQ-9M、10,、ΙΟ—11 等)。
这里所使用的术语“PDZ结构域”是指小于约90个氨基酸(即约80-90、约 70-80、约60-70或约50-60个氨基酸)的蛋白序列(也就是�？槭降鞍捉峁褂�)，其特 征是与大脑突触蛋白PSD-95、果蝇隔膜接头蛋白Discs-Large(DLG)以及上皮紧密接头 蛋白ZOl (ZOl)同源。PDZ结构域也称为Discs-Large同源重复序列(DHRs)禾Π GLGF 重复序列。PDZ结构域通�？赡鼙３忠桓龊诵墓餐蛄�(Doyle D.A.，1996，Cell85 1067-76)。
在包括鸟苷酸激酶同源体的MAGUK家族成员、多种蛋白磷酸酶和激酶、神经 元一氧化氮合成酶、肿瘤抑制蛋白以及统称为肌养结合蛋白的多种肌养蛋白相关蛋白在 内的多种膜相关蛋白中发现了 PDZ结构域。
表2和实施例4中展示了示范性的含PDZ结构域的蛋白以及PDZ结构域序列。 术语“PDZ结构域”也包括所述序列的变体(如天然存在的变体，多态性变体，保守置 换变体等)和来自其他物种(如小鼠、大鼠)的结构域。典型的PDZ结构域与美国专利 申请09/7M553中所展示的充分相同，例如，在最大对应度的比较和对齐排列时，具有 至少约70%、至少约80%或至少约90%氨基酸残基相同性。在本领域中需要认识到，可 以对PDZ结构域实行突变以产生能增强或减弱结合并改变特异性的氨基酸改变，但它们 保持为PDZ结构域Schneider等，1998，Nat.Biotech.17 170-5)。除了另有说明以外， 提及具体的PDZ结构域(例如MAGI-I结构域2)意味着包括所述具体PDZ结构域及其 HPV E6结合变体。换言之，如果涉及具体的PDZ结构域，则也同样涉及如下所述的这 一结合HPV致癌E6蛋白PDZ结构域的变体。在这一点上需要指出蛋白中PDZ结构域 的编号可以发生改变。例如，如这里所涉及的MAGI-I结构域2，在其他文献中可能作为 MAGI-I结构域1被提及。同样的，当本申请中提及一个特定的蛋白PDZ结构域时，这 里所提及的应当理解为如这里所述的、尤其是序列列表中的该结构域的序列。插入在权 利要求书之前的表9显示了适当情况下多个结构域在序列列表中的序列和名称与Genbank 登录号之间的关系。
这里所使用的术语“PDZ蛋白”是指包含PDZ结构域的天然蛋白。示范性 的 PDZ 蛋白包括 CASK、MPPU DLGU DLG2、PSD95、NeDLG> TIP-33、SYNla、 TIP-43、LDP、LIM> LIMKl、LIMK2、MPP2、NOSl、AF6、PTN-4、prIL16、 41.8kD、KIAAO 5 59, RGS12、KIAA0316、DVL1> TIP-40、TIAMU MINTU MAGI-I、MAGI-2、MAGI-3、KIAA0303、CBP、MINT 3, TIP-2、KIAA0561 和 TIP-I。
这里所用的术语“PDZ结构域多肽”是指含有PDZ结构域的多肽，如包含PDZ 结构域序列的融合蛋白、天然存在的PDZ蛋白或分离的PDZ结构域肽段。因此，PDZ 结构域多肽的长度可以是约60个氨基酸或更多、约70个氨基酸或更多、约80个氨基酸 或更多、约90个氨基酸或更多、约100个氨基酸或更多、约200个氨基酸或更多、约300 个氨基酸或更多、约500个氨基酸或更多、约800个氨基酸或更多、约1000个氨基酸或 更多、通常达到2000个氨基酸或更多。PDZ结构域肽段通常不大于约100个氨基酸(如 50-60个氨基酸、60-70个氨基酸、80-90个氨基酸或90-100个氨基酸)并编码一个PDZ 结构域。
这里所使用的术语“PL蛋白”或“PDZ配体蛋白”是指与PDZ结构域形成分子复合物的天然存在的蛋白，或是指当其C末端与全长蛋白分开表达时(例如，象4-25 个残基的肽段(如8、10、12、14或16个残基))形成这样的分子复合物的蛋白。所述 分子复合物可以用“A检测法”或“G检测法”在体外或体内进行观测。表3和4中 列举的示范性的PL蛋白经证实能结合具体PDZ蛋白。所述定义不包括抗PDZ抗体及其 他类似物。
这里所使用的“PL序列”是指PL蛋白C末端的氨基酸序列(例如，C末端2、 3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20 或 25 个残基)(“C 末端 PL 序列”)或指 已知结合PDZ结构域的内部序列(“内部PL序列”)。
这里所使用的“PL肽“是指具有来自或基于PL蛋白C末端序列的序列的肽 段。表3中列举了示范性的PL肽(生物素化的)。
这里所使用的“PL探测分子”是能特异性识别并结合PL序列的蛋白。
这里所使用的“PL融合蛋白”是含有将PL序列作为一个结构域的融合蛋白(通 常作为所述融合蛋白C末端结构域)。tat-PL序列融合是PL融合蛋白的一个例子。
这里所使用的“PL抑制肽序列”是指抑制PDZ结构域多肽与PL肽之间相互作 用(例如在A检测或G检测中)的PL肽氨基酸序列(以肽或PL融合蛋白的形式)。
这里所使用的“PDZ结构域编码序列”指编码PDZ结构域的多核苷酸片段。在 不同实施方案中，所述多核苷酸是单链或双链DNA和RNA。
在用于调节相互结合作用(如PDZ结构域序列与PL序列的结合)的上下文中 时，这里所使用的术语“拮抗剂”或“抑制剂”可以交替使用，指降低如PL序列(例 如PL肽)与如PDZ结构域序列(如PDZ蛋白、PDZ结构域肽)的结合的物质。
在用于调节相互结合作用(如PDZ结构域序列与PL序列的结合)的上下文中 时，这里所使用的术语“激动剂”或“增强子”可以交替使用，指增强如PL序列(例 如PL肽)与如PDZ结构域序列(如PDZ蛋白、PDZ结构域肽)的结合的物质。
这里使用的术语“类肽”、“拟肽”和“肽类似物”可以交替使用，是指具有 与本发明中的PL抑制肽或PL结合肽充分相同的结构和/或功能特征的合成的化合物。 所述的类似物可以是完全由合成的、非天然的氨基酸类似物构成，或是部分天然肽氨基 酸和部分非天然的氨基酸类似物组成的嵌合分子。所述类似物也可以包含任何数量的天 然氨基酸保守置换，只要这样的置换不足以改变所述类似物的结构和/或抑制或结合活 性。对于本发明中多肽的保守变体而言，常规实验能够确定一种类似物是否包括在本发 明范围以内，即是否其结构和/或功能发生了充分改变。因而，如果一种模拟组合物能 结合PDZ结构域和/或抑制PL-PDZ相互作用，那么该类似物包括在本发明范围以内。
多肽模拟组合物可以包含通常选自下列三种结构基团的非天然结构组分的任意 组合a)与天然酰胺(“肽”)连接不同的残基连接基团；b)替代天然氨基酸残基的非 天然残基；或c)促进二级结构模拟(即促进或稳定二级结构(如β转角、Y转角、β 折叠、α螺旋及其他构象))的残基。
一条多肽可以具备类似物的特征，如果其全部或一些残基通过与天然肽不同的 化学方法结合。单独的拟肽残基可以通过肽、其他化学或偶联方法(诸如例如戊二醛、 N-羟基琥珀酰亚胺脂、双功能马来酰亚胺、N，N = -二环己基碳二亚胺(DCC)或N， N = _ 二异丙基碳二亚胺(DIC))结合。除传统的酰胺(“肽”)连接外的连接基团可9以包括例如甲叉酮(如针对-C ( = O) -NH-的-C ( = O) -CH2-)、甲叉胺(CH2-NH)、乙 烯、烯烃(CH = CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑(CN4-)、噻唑、糖苷、硫代酰 胺或酯(参见例如Spatola所著(1983)《氨基酸、肽与蛋白的化学与生物化学》一书第7 卷洸7_357 页的《肽骨架修饰》章节(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins, Vol.7, pp 267—357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY))。
通过包含所有或一些取代天然氨基酸残基的非天然残基，一条多肽也可以具备 类似物的特征。非天然残基在科技文献和专利文献中有详细描述；以下描述了一些示范 性的用作天然氨基酸残基类似物的非天然组合物及其指南。
芳香性氨基酸类似物可以通过用下列残基替代产生，例如D-或L-萘基丙氨 酸(naphylalanine) ； D-或 L-苯基甘氨酸；D-或 L-2 噻吩酮丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-I，-2，3_，或4-芘丙氨酸(pyreneylalanine) ； D-或L-3噻吩酮丙氨酸；D-或 L-O-吡啶)_丙氨酸；D-或L-(3-吡啶)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪)-丙氨酸；D-或 L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)_苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)_苯基丙氨 酸；D-p-氟苯丙氨酸；D-或L-p-双苯基苯丙氨酸；K-或L-p-甲氧基双苯基苯丙氨 酸；D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以替代为或 不替代为甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、2-异己基、异戊基 或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳香环包括例如噻唑基、苯硫基、吡唑基、苯并咪唑 基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳香环。
酸性氨基酸类似物可以通过用例如在保持一个负电荷情况下非羧酸化氨基酸、 (膦酸基)丙氨酸；硫酸化苏氨酸替代产生。羧基一侧的基团(如天冬氨酰或谷氨酰)也 可以通过与诸如例如1-环己基-3 (2-吗啉基-(4-乙基))碳二亚胺或1-乙基-3 (4-阳离 子氮-4，4- 二甲氨戊基)碳二亚胺等碳二亚胺(R = -N-C-N-R =)反应进行选择性修 饰。天冬氨酰基或谷氨酰基也可以通过与铵离子反应转化成天冬酰胺酸和酰胺谷氨酸残 基。
碱性氨基酸类似物可以通过用例如(除了赖氨酸和精氨酸以外)氨基酸鸟氨酸、 瓜氨酸或(胍基)_乙酸或(胍基)烷基乙酸(烷基见前文定义)等替代产生。腈类衍生 物(例如含替代COOH的CN部分)可用于替代天冬酰胺酸或酰胺谷氨酸。天冬氨酸和 谷氨酸残基可以脱去氨基形成相应的天冬氨酸和谷氨酸残基。
精氨酸残基类似物可以通过精氨酰与例如一种或多种包括例如苯甲酰甲醛、2， 3-丁二酮、1，2-环己二酮或茚三酮在内的常规试剂优选地在碱性条件下反应产生。
酪氨酸残基类似物可以通过酪氨酰与例如芳香性重盐化合物或四硝基甲烷反应 产生。N-乙酰咪唑(N-acetylimidizol)和四硝基甲烷可以分别用于形成O-乙酰酪氨酰类 化合物和3-硝基衍生物。
半胱氨酸残基类似物可以通过半胱氨酰残基与例如诸如2-氯乙酸或氯乙酰胺的 α-环乙酸(haloacetates)和相应的胺反应产生，生成羧甲基或羧胺甲基衍生物。半胱氨 酸残基类似物也可以通过半胱氨酰残基与例如溴三氟丙酮、α -溴-β -(5-咪唑)丙酸； 磷酸氯乙酸、N-烷基马来酰亚胺、二硫3-硝基-2吡啶；二硫甲基2-吡啶；ρ-氯汞苯 甲酸(p-chloromercuribenzoate) ； 2-氯汞-4硝基酚；或氯_7_硝基苯并-氧杂-1、3-二唑反应产生。
赖氨酸类似物可以通过赖氨酰与例如琥珀酸的或其他羧酸酐反应产生(氨基末 端残基可以改变)。赖氨酸及其他含α氨基的残基类似物也可以通过与诸如甲基吡啶酰 胺酯(methyl picolinimidate)、吡哆醛、吡哆醛、硼氢化氯、三硝基苯、O-甲基异脲、2，4戊二等酰亚胺酯反应以及转酰胺基催化的与乙醛反应产生。
甲硫氨类似物可以通过与例如硫氧甲硫氨反应产生。脯氨类似物包括例如哌 啶、唑烷二、3-或4-羟脯胺、脱氢脯氨、3-或4-甲基脯氨或3，3，- 二甲基脯氨。组 氨残基类似物可以通过组氨酰与例如二乙基焦碳酯或对溴苯酰甲基溴反应生成。
其他类似物包括，例如通过脯氨和赖氨羟基化；丝氨或苏氨残基的羟基
化；赖氨、精氨和组氨的α氨基基团甲基化；N末端氨基乙酰化；主链酰胺残 基甲基化或由N-甲基氨基替代；或C末端基基团胺基化产生的类似物。
天然多肽(例如PL多肽或PDZ多肽)的成分也可以被具有相反手性的氨基(或 类肽残基)所替代。因而，任何以L-构象(取决于所述化学个体的结构，也可以称为R 或S构象)存在的天然氨基可以用相同化学结构类型但相反手性(通常称为D-型氨基， 不过另外也可以称为R-或S-型)的氨基或类肽替代。
本发明中的类似物还可以包括含结构类似残基，尤其是促进或模拟诸如β转 角、β折叠、α旋结构、Y转角及其他类似结构的二级结构的组合物。例如，用D 型氨基、Ν-α-甲基氨基、C-α-甲基氨基或脱氢氨基替代肽内的天然氨基残基，可 以促进或稳定β转角、β折叠、α旋结构、γ转角等构形。如在Nagai(1985)Ut. Lett.26 647-650 ； Feigl (1986) J.Amer.Chem.Soc. 108 181-182; Kahn (1988) J.Amer. Chem.Soc.110 1638-1639; Kemp (1988) Tet.Lett.29 5057-5060; Kahn (1988) J.Molec. Recognition 1 75-79等文献中已对β转角类似结构进行了描述。β折叠类似结构在例 如 Smith(1992) J.Amer.Chem.Soc. 114 10672-10674 中已有描述。例如，Beusen(1995) 在Copolymers 36 181-200中描述了一种cis氨基化合物替代物1，5- 二基取代四氮唑促 进VI型β折叠形成。Banerjee(1996)在Biopolymers 39 769-777中描述了合并非手性 Ω氨基残基生成作为酰氨替代物的聚亚甲基单元。多肽二级结构可以通过例如高场IH NMR 或 2D NMR 光分析进行分析，参见例如 Higgins (1997) J.Pept.Res.50 421-435。也 可参见 Hraby(I997)Biopolymers 43 219-266 和 Balaji 等人的美国专利 Νο.5,612,895。
这里所使用的术语“肽变体”和“保守氨基替代”是指通过相似性质的氨基残 基(基于大小、极性、亲水性及其他性质)的替代使肽区别于参肽(例如，含特定PL蛋 白基末端序列的肽)。为此，本发明范围内所包括的化合物根据指定类别的氨基残基进行 部分阐述，主要根据氨基侧链的性质，所述氨基通�？梢苑殖扇鲋饕啾鹗杷园� 基酸、亲水性氨基酸和半胱氨酸类氨基酸。这些主要类别可以进一步分为亚类。亲水性 氨基酸包括具有酸性、碱性或极性侧链的氨基酸，疏水性氨基酸包括具有芳香性或非极 性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以进一步细分为包括脂肪族氨基酸及其他。这里所使 用的氨基酸类别定义如下
“疏水性氨基酸”指具有在生理ρΗ值下不带电荷并排斥水溶液的侧链的氨基 酶。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括lie、Leu和Val。非遗传编码的疏水性氨基酸 的例子包括t-BuA。
“芳香件氨基酸”指具有含至少一个具备共轭S电子体系的环(芳香环)的侧链 的疏水性氨基酸。芳基可以用诸如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基及其 他基团进一步替代。遗传编码的芳香性氨基酸的例子包括Phe、Tyr和Trp。通常遇到的 非遗传编码芳香性氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、1，2， 3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯-苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和 4-氟苯基丙氨酸。
“非极件氨基酸”指具有在生理ρΗ值下通常不带电荷并不是极性的侧链的疏水 性氨基酸。遗传编码的非极性氨基酸的例子包括Gly、Pro和Met。非编码的非极性氨 基酸的例子包括Cha。
“脂肪族氨基酸”指具有饱和的或不饱和的直链、分支的或环状碳氢侧链的非 极性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和He。非编码的脂 肪族氨基酸的例子包括NIe。
“亲水件氨基酸”指具有亲和水溶液的侧链的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基 酸的例子包括Ser和Lys。非编码的亲水性氨基酸的例子包括Cit和hCys。
“酸件氨基酸”指具有小于7的pK值的侧链的亲水性氨基酸。由于一个氢离 子解离，在生理ρΗ值下酸性氨基酸通常带负电。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括Asp 和 Glu。
“碱性氨基酸”指具有大于7的pK值的侧链的亲水性氨基酸。由于与水合氢 离子结合，在生理ρΗ值下碱性氨基酸通常带正电。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括 Arg, Lys和His。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3-二氨 基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
“极性氨基酸”指具有在生理ρΗ值下不带电的侧链，但其包含的通常由两个原 子共享的电子对更靠近其中一个原子的亲水性氨基酸。遗传编码的极性氨基酸的例子包 括Asx和Glx。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、N-乙酰赖氨酸和硫氧甲硫氨酸。
“半胱氨酸类氨基酸”指具有能与另一个氨基酸残基形成如二硫的共价连接的 侧链的氨基酸。一般而言，半胱氨酸类氨基酸通常具有含至少一个硫醇6H)基团的侧 链。遗传编码的半胱氨酸类氨基酸的例子包括Cys。非遗传编码的半胱氨酸类氨基酸的 例子包括高半胱氨酸和青霉胺。
正如精通本领域的人员所认识到的，上述分类不是绝对的-几种氨基酸表现出 多种特征性质，因而能够包括在几个类别中。例如，酪氨酸既有芳香环又有极性的羟 基。因此，酪氨酸具有双重特性并能同时包含在芳香性和极性类别内。类似的，除了能 够形成二硫，半胱氨酸也具有非极性特征。因而，虽然没有严格地将其划分为疏水性或 非极性氨基酸，在许多情况下半胱氨酸可以用于使肽具有疏水性。
可以构成本发明中的肽和肽类似物的某些经常使用的非遗传编码的氨基酸包 括但不限于β-丙氨酸(b-Ala)以及其他如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸 (Dpr)、4-氨基丁酸等Ω氨基酸；α-氨基异丁酸(Aib) ； ε-氨基己酸(Aha); δ-氨 基戊酸(Ava) ； N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit) ； t_ 丁 基甘氨酸(t-BuG) ； N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己胺(Cha)；正亮氨酸(Nle) ； 2-萘基丙氨酸Q-Nal) ； 4-氯苯丙氨酸CPhe(4_Cl)) ； 2-氟苯丙 氨酸CPhe(2-F)) ； 3-氟苯丙氨酸CPhe(3-F)) ； 4-氟苯丙氨酸CPhe(4_F))；青霉胺 (Pen) ； 1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic) ； β _2噻吩丙氨酸(Thi)；硫氧甲硫氨 酸(MSO)；高精氨酸ChArg) ； N-乙酰赖氨酸(AcLys) ； 2，3-二氨基丁酸(Dab) ； 2， 3-二氨基丁酸(Dbu) ； ρ-氨基苯基丙氨酸CPhe(pNH2)) ； N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半 胱氨酸(hCys)以及高丝氨酸(hSer)。这些氨基酸也方便地归入上述的类别中。
下面的表1中总结了上述遗传编码和非编码氨基酸的分类。需要理解的是，表 1只是为了说明的目的，而不意味着包括这里所描述的肽和肽类似物的氨基酸残基的完全 清单。其他可用于制备这里所描述的肽和肽类似物的氨基酸残基可以参考如Risman 1989 年所著《CRC生物化学与分子生物学实践手册》(CRC Practical HandbookofBiochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc., 1989)及其引用的参考文献。这里没有特别提 及的氨基酸在已知的表现和/或其与明确鉴别的氨基酸相比特别的化学和/或物理性质的 基础上，可以方便地归入上述类别。
表 权利要求
1.PDZ结构域多肽用于检测样品中致癌人乳头状瘤病毒(HPV)E6蛋白的存在的应 用，所述PDZ结构域多肽包括MAGI-I PDZ结构域2的氨基酸序列，其中所述样品被怀 疑含有致癌HPV E6蛋白；其中所述致癌HPV E6蛋白结合HPV E6结合伴侣；并且其中 所述致癌HPV E6蛋白与所述PDZ结构域多肽的结合表明所述致癌HPV E6蛋白在所述样 品中的存在。
2.包括MAGI-IPDZ结构域2的氨基酸序列的PDZ结构域多肽用于在体外测试中确 定受检人是否被人乳头状瘤病毒(HPV)的致癌病毒株感染的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度为60-1000个氨基酸。
4.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度少于500个氨基酸。
5.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽长度少于200个氨基酸。
6.如权利要求1或2所述的应用，其中所述致癌HPV的毒株选自由HPV毒株16、 18、 26、 30、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 69、 73 和 82 组成的组。
7.如权利要求1或2所述的应用，其中所述致癌HPV的毒株选自由HPV毒株16、18 和45组成的组。
8.如权利要求1或2所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽直接或间接结合于固体 支持物上。
9.如权利要求2所述的应用，其中所述致癌人乳头状瘤病毒E6蛋白结合HPVE6蛋白结合伴侣。
10.如权利要求1或9所述的应用，其中所述HPVE6蛋白结合伴侣是与所述致癌HPV E6多肽结合的标记的抗体。
11.如权利要求1-10任一项所述的应用，其中所述样品是子宫颈刮取物、活组织切片 或灌洗物。
12.如权利要求1-11任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽用作检测宫颈癌 的测试的一部分，所述检测宫颈癌的测试与所述样品的组织学分析联合进行。
13.如权利要求1-12任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽用于ELISA检测 法或夹心检测法。
14.如权利要求1-13任一项所述的应用，其中所述PDZ结构域多肽与异源结构域融合O
15.如权利要求1-14任一项所述的应用，其中所述应用进一步包括a.洗涤步骤；b.加入封闭缓冲液；或C.将在所述样品中所述致癌HPV E6蛋白的结合和不含有E6癌蛋白的对照样品进行 比较。
16.PDZ结构域多肽用于检测样品中致癌人乳头状瘤病毒(HPV)E6蛋白的存在的应 用，所述PDZ结构域多肽包括选自以下的PDZ结构域多肽的氨基酸序列萎缩蛋白-1相 互作用蛋白，Lim-Ril，FJL11215, MUPP-1, KIAA 1095, PTN-4，INADL, Vartul, 肌养蛋白结合蛋白_1α，肌养蛋白结合蛋白γ-1，ΤΑΧΙΡ2, KIAA 0807，KIAA 1634，DLG1, DLG2, NeDLG, Sim.大鼠外膜，PSD 95，或 TIP-1，其中所述样品被怀疑含有致癌HPV E6蛋白；其中所述致癌HPV E6蛋白结合HPV E6结合伴侣；并且其中所述致癌HPV E6蛋白与所述PDZ结构域多肽的结合表明所述致 癌HPV E6蛋白在所述样品中的存在。
全文摘要
本发明提供了用于检测人样品中病原体感染的试剂和方法。所述检测利用特定蛋白质以探测因病原体感染而导致的病原体蛋白质的存在或人蛋白质的反常表达。这里公开了用于在临床样品中检测致癌的人乳头状瘤病毒E6蛋白的具体方法、组合物和试剂盒。
文档编号G01N33/53GK102023220SQ201010245698
公开日2011年4月20日 申请日期2003年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者C·S·迪亚斯-萨米恩托, J·施韦策, M·P·贝尔马斯, P·S·鲁 申请人:生命树股份有限公司
专业数控铣床产品供应商
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