专利名称：一种检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽药残留检测分析技术领域中一种检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒。
背景技术：
磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，4-氨基苯磺酰胺)是应用广泛的抗菌素，由于它在体内的作用时间和代谢时间较长，通过任何途径摄入都有可能在人体中蓄积。药物蓄积浓度超过一定值对人体机能是有害的。人体中磺胺地长期蓄积会导致磺胺药抗药性的产生，且有潜在的致癌性。因此，联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定，食品和饲料中磺胺二甲嘧啶等磺胺类物质单个均不得超过100μg/kg。2002年12月我国农业部公告第235号文规定在所有食品动物的肌肉、脂肪、肝和肾中最高残留限量为100μg/kg，并将其列为兽药残留监控的重点。
检测磺胺二甲嘧啶残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)、气-质联机(GC/MS)、液-质联机(HPLC/MS)、毛细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒。
本发明所提供的检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒，包括磺胺二甲嘧啶特异性抗体及包被的磺胺二甲嘧啶与载体蛋白偶联物和酶标二抗，或包被的二抗和酶标磺胺二甲嘧啶。
其中，所述磺胺二甲嘧啶特异性抗体可为磺胺二甲嘧啶单克隆抗体或磺胺二甲嘧啶多克隆抗体，所述磺胺二甲嘧啶单克隆抗体优选为磺胺二甲嘧啶鼠单克隆抗体，所述磺胺二甲嘧啶多克隆抗体优选为磺胺二甲嘧啶兔多克隆抗体，以上抗体均可按常规方法制备；所述载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血兰蛋白(KLH)等常用载体蛋白，所述磺胺二甲嘧啶与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺二甲嘧啶和载体蛋白用戊二醛法或重氮化法进行偶联得到；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体或磺胺二甲嘧啶上；所述二抗优选为抗鼠或抗兔抗抗体。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括磺胺二甲嘧啶标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液。
所述浓缩洗涤液为含有0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述浓缩复溶液为含有0.1％-0.5％DMF的磷酸盐缓冲液。
本发明的检测原理为将磺胺二甲嘧啶与载体蛋白的偶联物作为包被原吸附于固相载体上或将抗兔或抗鼠的抗抗体吸附于固相载体上，加入样品和磺胺二甲嘧啶特异性抗体，当酶标板为磺胺二甲嘧啶与载体蛋白偶联物包被的固相载体时，加入酶标记二抗，当酶标板为抗兔或抗鼠的抗抗体包被的固相载体时，加入酶标磺胺二甲嘧啶，待测样品中残留的磺胺二甲嘧啶和固相载体上包被的磺胺二甲嘧啶与载体蛋白偶联物或酶标磺胺二甲嘧啶竞争特异性抗体，显色后终止，测定样品吸光值，该值与样品中磺胺二甲嘧啶残留物含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出磺胺二甲嘧啶的含量。
本发明的检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物组织、血清、尿样、蜂蜜、牛奶及饲料等样品中磺胺二甲嘧啶的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的磺胺二甲嘧啶单克隆抗体或多克隆抗体，主要试剂均以工作液形式提供，检验方法方便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在食品和饲料磺胺二甲嘧啶残留量的检测中发挥重要作用。
图1为检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒的结构示意图
图2为磺胺二甲嘧啶标准曲线图
具体实施例方式
实施例1、抗原及抗体的制备
(1)抗原的合成
将磺胺二甲嘧啶和人血清白蛋白(HSA)采用戊二醛法进行偶联得到免疫原。
将磺胺二甲嘧啶和卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法进行偶联得到包被原。
(2)磺胺二甲嘧啶鼠单克隆抗体制备
动物免疫程序采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以磺胺二甲嘧啶与人血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为80-100μg/只，首免时将抗原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔2-3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
细胞融合与克隆化取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按5-10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106-5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。经辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。
(3)磺胺二甲嘧啶兔多克隆抗体的制备
采用新西兰大白兔作为免疫动物，以磺胺二甲嘧啶与人血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1mg/kg.b.w.，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3-4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价，颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。
(4)二抗的制备
以羊作为免疫动物，以鼠或兔IgG为免疫原进行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗体。
实施例2、检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒
(1)检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒的结构
试剂盒的结构如图1所示，主要由盒体1、铝膜真空包装96孔/40孔酶标板2、6瓶磺胺二甲嘧啶系列浓度标准品3、酶标记物工作液4、磺胺二甲嘧啶抗体工作液5、底物显色液A液6、底物显色液B液7、终止液8、浓缩洗涤液9、浓缩复溶液10和泡沫托架11，泡沫托架11上制有凹孔，上述试剂瓶3-10安放在泡沫托架的凹孔内，泡沫托架11及酶标板2安放在盒体内。其中酶标板2由塑料支架和可拆分的塑料条组成。
(2)所用试剂的配制
a.磺胺二甲嘧啶标准溶液磺胺二甲嘧啶系列标准溶液6瓶，1-3ml/瓶。
b.包被缓冲液pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
c.封闭液3-10％小牛血清。
d.浓缩洗涤液含0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)，为正常使用浓度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.磺胺二甲嘧啶抗体工作液将抗体稀释成蛋白浓度为0.5-5.0μg/L使用，5-8ml/瓶，1瓶。
f.酶标记物工作液酶标记抗鼠或抗兔的抗抗体稀释液，5-8ml/瓶，1瓶；或酶标记抗原稀释液，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
h.底物显色液B液邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
i.终止液1-2mol/L硫酸或盐酸，5-8ml/瓶，1瓶。
j.浓缩复溶液含有0.1％-0.5％DMF的磷酸盐缓冲液，30-50ml/瓶，1瓶。为正常使用浓度的2-3倍。
(3)酶标板的制备
酶标板有两种，一种是磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物包被的酶标板，另一种是二抗包被的酶标板，其制备方法如下
磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物包被的酶标板制备方法
用包被缓冲液将磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
二抗包被的酶标板制备方法
用包被缓冲液将抗兔或抗鼠抗抗体稀释成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例3、检测样品中残留的磺胺二甲嘧啶
(1)样品前处理
动物组织称取5g匀浆物，加乙腈水溶液混合，3000g以上速度离心10min，上清液再次离心。取3ml上清液，加入水和乙酸乙酯静置分层。上层液用氮气吹干或50℃减压蒸干，用1ml复溶液溶解干燥的残留物，加入异辛烷振荡，离心，除去上层液，取下层液50μl进行分析。
血清3000g离心5min，取上层液50μl进行分析。
饲料称取饲料1g，加甲醇-水溶液，超声波提取30min，取3ml上层液氮气吹干，残留物用1ml复溶液溶解，取50μl进行分析。
尿样3000g离心5min，取上层液50μl进行分析。
蜂蜜取2ml蜂蜜加入4ml重蒸水溶解，加入乙酸乙酯振荡10min，离心10min，取1ml上层液氮气吹干，残留物用复溶液溶解，取50μl进行分析。
牛奶用复溶液10倍稀释，取50μl进行分析。
(2)检测方法
可用磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物包被的酶标板和二抗包被的酶标板两种酶标板进行检测
用磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物包被的酶标板检测
向磺胺二甲嘧啶与卵清蛋白偶联物包被的96孔酶标板微孔中加系列标准溶液或样品溶液(各2孔)50μl，然后加入磺胺二甲嘧啶鼠单克隆抗体工作液50μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。取出酶标板，如前述洗板5次。每孔加入底物显色液A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15-30min。每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。
用二抗包被的酶标板检测
向羊抗鼠抗抗体包被的96孔酶标板微孔中加系列标准溶液或样品溶液50μl，然后加入磺胺二甲嘧啶鼠单克隆抗体工作液50μl，再加入辣根过氧化物酶标记的磺胺二甲嘧啶工作液100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，每孔加入250μl洗涤液，30秒后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。每孔加入底物显色液A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15～30min。每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值(OD值)。
本实施例所用的试剂均按照实施例2中的试剂配制方法进行配制。
(3)结果分析
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B为标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B0为0μg/L标准溶液的平均吸光度值。以磺胺二甲嘧啶浓度(μg/L)的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，如图2所示。相对应每一个样品的浓度(μg/L)可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。
根据酶标板上的样品颜色的深浅，与系列浓度的标准溶液颜色的比较可判断样品的浓度范围。
实施例4、试剂盒灵敏度、特异性、精密度、准确度和保存期试验
(1)试剂盒灵敏度试验
50％抑制浓度(既IC50，指0标准溶液的吸光度值的50％处所对应的药物浓度)常作为评价竞争ELISA试剂盒灵敏度的指标。分别测定20次标准曲线的50％抑制浓度，确定该试剂盒标准曲线IC50应在1.7-4.2μg/L的范围之内。分别测定20份鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、血清、牛奶、尿样、蜂蜜和饲料的空白样品及20份磺胺二甲嘧啶0标准品，并将测定平均值加3倍标准差作为最低检测限。结果判定该试剂盒对磺胺二甲嘧啶0标准品最低检测限为1.0μg/L。对空白样品的最低检测限均小于2.0μg/L。
(2)试剂盒特异性试验
选择与磺胺二甲嘧啶类似结构和类似功能的7种磺胺药物测定交叉反应率。通各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率愈�。砻魇约梁械奶匾煨杂�。
试剂盒的特异性
试剂盒特异性试验结果如表所示，结果表明该试剂盒对其它7种磺胺类药物的交叉反应率均＜12％，说明该试剂盒针对磺胺二甲嘧啶特异性高，可保证对动物源食品及饲料中磺胺二甲嘧啶残留检测结果的可靠性。
(3)试剂盒精密度试验
标准可重复性
从三批酶联板中，每板各抽出20个微孔，测定同一浓度标准溶液的吸光度值(OD值)，重复测定10次，计算变异系数。变异系数范围在2.6-9.3％。
样品可重复性
取不同浓度的磺胺二甲嘧啶标样，添加到样品中，分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次。分别计算板内，批内，批间变异系数。肝脏的变异系数均低于9.8％，肌肉的变异系数均低于9.6％，血清、尿样、蜂蜜和牛奶的变异系数均低于7.5％，饲料的变异系数均低于7.6％。
(4)试剂盒的准确度
取4个浓度的磺胺二甲嘧啶标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度设4个平行，分别计算回收率。猪肉为56.2％-96.3％，猪肝为55.6％-105.0％，鸡肉为60.1％-119.0％，鸡肝为59.6％-112.0％。血清、尿样、蜂蜜、牛奶和饲料的添加回收率均在60.0-110.0％范围内。
(5)试剂盒保存期试验
试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、磺胺二甲嘧啶添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存的条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃至少可以保存6个月以上。
权利要求
1、一种检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒，包括磺胺二甲嘧啶特异性抗体及包被的磺胺二甲嘧啶与载体蛋白的偶联物和酶标二抗，或包被的二抗和酶标磺胺二甲嘧啶。
2、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括磺胺二甲嘧啶标准溶液、显色剂、浓缩洗涤液、终止液、浓缩复溶液。
3、根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述磺胺二甲嘧啶特异性抗体为磺胺二甲嘧啶单克隆抗体或磺胺二甲嘧啶多克隆抗体。
4、根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、血兰蛋白。
5、根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
6、根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述二抗为抗鼠或抗兔抗抗体。
7、根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为含有0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液。
8、根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)。
9、根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩复溶液为含有0.1％-0.5％DMF的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒，包括磺胺二甲嘧啶特异性抗体及包被的磺胺二甲嘧啶与载体蛋白的偶联物和酶标二抗，或包被的二抗和酶标磺胺二甲嘧啶。本发明的检测磺胺二甲嘧啶的酶联免疫试剂盒能同时快速检测大批样品；主要试剂均以工作液形式提供，检验方法方便易行；具有高特异性、高灵敏度、高精确度、高准确度等特点，将在动物性食品和饲料磺胺二甲嘧啶残留量的检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK1547013SQ20031011706
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者沈建忠, 史为民, 何方洋, 何继红, 江海洋, 张素霞, 丁双阳 申请人:中国农业大学
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