专利名称：一种同时标记肿瘤iv型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法
技术领域：
本发明属于组织免疫荧光技术领域，更具体涉及一种检测肿瘤间质IV型胶原、巨 噬细胞和肿瘤新生血管的量子点三色荧光标记方法，适用于人肿瘤组织微环境成分变化的 准确、定量检测。
背景技术：
肿瘤的发生、发展不仅涉及肿瘤细胞本身，而且还与肿瘤细胞周围的微环境有密 切关系。恶性肿瘤(肿瘤)微环境由肿瘤细胞及其周围纤维母细胞、上皮细胞、固有及特异性 免疫细胞、肿瘤血管、间叶细胞及其表达产物、代谢产物。肿瘤微环境内成分众多，因缺乏有 效地技术，当前对肿瘤微环境的研究仍然以单一成分为主，无法同时显示肿瘤微环境内的 多种改变，如肿瘤间质的重塑、巨噬细胞浸润和肿瘤血管发生。肿瘤微环境成分众多且相互作用的特性提示研究肿瘤微环境必须有良好的标记 技术能同时研究多种成分。石蜡切片免疫组织化学染色在一定程度上标记特定分子，在肿 瘤病理研究中有重要意义。但该方法染色背景高、特异性差，而且传统的酶-底物显色系统 依赖于色原的沉积，在组织上非常近似，难以同时观察一张切片同一部位两种抗原的共表 达定位。这种局限性使其无法满足肿瘤多成分标记的需要。虽然免疫荧光标记抗原也是 研究肿瘤的常用方法，且比酶-底物显示系统更有优势，但异硫氰酸荧光素(fluorescein iSOthiOCyanate，FITC)、罗丹明(rhodamine)等普通有机荧光基团敏感度低，发生光谱宽而 重叠，抗光漂白能力差，且与组织的高自发荧光难以区分。此外，在传统的免疫荧光双标染 色法中，有机染料必须在不同波长下激发，然后利用图像处理软件进行图像叠加，才能获得 合成的最后的荧光双标染色结果。因此，普通有机荧光染料也不能满足多重染色的需要。量子点是直径2 10nm的近球形纳米颗粒，半径小于或接近于激子玻尔半径的新 型半导体纳米晶粒，与传统有机荧光染料、荧光蛋白和稀土元素螯合物相比，量子点有诸多 优势，激发光波谱宽、连续，紫外光可以激发任何大小的量子点，发射光波谱窄而对称；光稳 定性好。这些特性使量子点在生物成像领域具有独特的优势，在肿瘤研究中具有广阔的应 用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种同时标记肿瘤间质IV型胶原、巨噬细胞和新生血 管的方法，本发明中提供的量子点多重染色方法可用于肿瘤组织微环境多种成分的高效、 准确、快速、同时检测，该方法可推广用于一种操作步骤简单、快速、灵敏、高效、经济实用的 通用肿瘤微环境分子病理学检测技术。一种同时标记肿瘤间质IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法，其步骤是
A、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织4 μ m厚切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱 载玻片上。B、组织切片的准备，将组织切片放入二甲苯中脱蜡三次(不同的器皿中)，每次4-6分钟，脱蜡后将组织切片依次放入无水乙醇4-6分钟、95% (体积比，以下相同)酒精1-3 分钟、95%酒精1-3分钟和80%酒精1-3分钟，流水冲洗3飞分钟。C、抗原修复，用柠檬酸三钠29. 41g，双蒸水IOOOml配制柠檬酸三钠缓冲液，柠檬 酸10. 5g，双蒸水500 ml配制柠檬酸缓冲液，分别取柠檬酸三钠缓冲液20. 25ml、柠檬酸缓 冲液4. 75ml和225ml双蒸水配制成柠檬酸抗原修复液(0. Olmol, pH 6. 0，250ml)。将组织 切片置于加入了 250ml抗原修复液的抗原修复盒中微波修复，即低火(微波功率136W)修 复4-6分钟后转至中火(微波功率440W)修复9-11分钟，然后室温(2(T25°C以下相同)放 置待玻片自然冷却至36-38°C。D、自来水冲洗后取出切片，洗涤切片，用三羟基氨基甲烷(trisQiydroxymethyl) aminomethane, Tris)6. 05g 和氯化钠 38. Og 及双蒸水 5000ml，配制 0. 01M/L、pH7. 2-7. 4 的 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tris buffered saline, TBS)作为洗涤液，洗涤3次，每次3 分钟；
E、封闭，封闭液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封闭条件为湿盒孵育，37°C， 30min ；
F、加一抗，去除上述封闭液后，滴加鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体、兔抗人IV型胶原多 克隆抗体、山羊抗人⑶105多克隆抗体的一抗混合物，37°C湿盒内孵育;T4h或4°C冰箱过夜 (不少于12h)；所述的一抗为对应的免疫球蛋白G (Ig G)抗原结合片段。G、洗涤切片，清洗液为(含0. 5%/vol/vol吐温#20的TBS(TBST)，洗涤3次，每次 3min ；
H、封闭，同步骤4;
I、本实验中所用二抗为量子点(F(ab' )2_)QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子点(F(ab' )2-)QDs525、 量子点(F(ab' )2_)QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子点(F (ab' ) 2_) QDs585、量子点(F (ab ‘ )2-)QDs655 标 记的兔抗山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs655)，(F(ab' )2-QDs525)、(F(ab' ) 2-QDs585)和(F (ab' )2-QDs655)均 购自美国hvitrogen公司。去除上述封闭液后，滴加F (ab ‘ ) 2-QDs525、F (ab ‘ ) 2-QDs585 和F(ab' )2-QDs655混合物，稀释液为含2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，湿盒孵育，37°C， 2H所述的二抗为量子点(F(ab' )2_)QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的 抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子点(F(ab' )2_) QDs525、量子 点(F(ab' )2_)QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子点(F(ab' )2_) QDs585、量子点(F(ab‘ )2-)QDs655 标 记的兔抗山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs655)。J、洗涤切片，清洗液与上述步骤7所用清洗液相同，TBS按上述步骤4的配方制 备，洗涤2次，每次2min，再用TBS洗涤一次，!Min。K、封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%(体积比)缓冲甘油，缓冲甘油封片后4°C 保存。在荧光显微镜下用紫外光(33(T385nm)激发即可观察到显示绿色荧光的巨噬细胞、 显示橙黄色荧光的IV型胶原和显示红色荧光的肿瘤新生血管。
为了检测此技术能否进行量化分析，做了以下实验
按照上述的步骤，通过荧光显微镜，在紫外光(波长33(T385nm)激发下，得到了 IV型胶 原、巨噬细胞和肿瘤新生血管的三色标记成像(图5A)，组织结构和抗原分布部位清晰、易于 MffiCRi Nuance ^7 ] ^ ^ (Cabridge Research & Instrumentation， Inc, Woburn, MA, USA)采集光谱信号(图5Β)，既能得到更清楚地三色图像(图5C)，也能对不同 的荧光信号定量(图5D-E)。巨噬细胞既可以直接记数，在图5中有13个巨噬细胞。IV型 胶原可观察其分布趋势，并根据荧光强度定量，在图5中将其划分为186个连续的区域定量 计算其表达量。肿瘤新生血管也可以直接计数，在图5中有14个新生血管。本发明中提供的量子点多重染色方法可用于肿瘤组织微环境多种成分的高效、准 确、快速、同时检测，该方法可推广用于一种操作步骤简单、快速、灵敏、高效、经济实用的通 用肿瘤微环境分子病理学检测技术。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果
1.检测特异性强，背景清晰，便于组织形态学分析(图1)。2.方法简便、快速，易于标准化及大量检测，重复性较好。从切片脱蜡至观察结果， 实验全程约7、h，可同时对多张组织切片进行染色。3.要观察肿瘤微环境内的多种成分，采用传统的免疫组织化学染色时只能单独染 色，无法实现同一切片上的共表达定位(图4)。本发明有效地解决了次难题，能同时观察到 多种成分，综合分析微环境变化。4.检测灵敏度高、便于量化。量子点荧光亮度强、稳定而持久，可采用光谱分析量 化结果(图5)。5.无需后期图片合成等复杂分析步骤，封片后即能直接观察。6.荧光亮度高，持续时间长，结果容易保存及反复观察。
图1为一种量子点单色标记法显示肿瘤微环境内重要成分示意图。图1中A为用特异性兔抗人IV型胶原抗体作为一抗，量子点QDs585标记的山羊 抗兔IgG Fab段(F(ab' )2-QDs585)作为二抗的标记结果，显示肿瘤微环境间质的重塑。图1中B为用特异性山羊抗人⑶105抗体作为一抗，量子点QDs655标记的兔抗山 羊IgG Fab段(F(ab' )2-QDs655)作为二抗的标记结果，显示肿瘤新生血管。图1中C为用鼠抗人巨噬细胞作为一抗，量子点QDs525标记的山羊抗鼠IgG Fab 段(F(ab' )2-QDs525)作为二抗的标记结果，显示浸润巨噬细胞。图1中D为用TBS作为一抗，量子点QDs655标记的兔抗山羊IgG Fab段(F(ab' )2-QDs655)作为二抗的标记结果，证明基于量子点探针的标记技术特异性强。放大倍数200X(A, B), 400X (C, D)；标尺50 μ m (Α, B), 20 μ m (C, D).量子点图象由紫外光(波长33(T385 nm)激发下，通过Olympus DP72成像系统采集图 象
图2为一种量子点三色标记同时显示肿瘤微环境内三种成分的结果示意图。图3为一种量子点三色标记同时显示肿瘤微环境内三种成分的结果示意图。实验中采用鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体、兔抗人IV型胶原多克隆抗体、山羊抗人 CD105 多克隆抗体的混合物为一抗，F(ab' ) 2-QDs525、F (ab ‘ ) 2-QDs585 和 F (ab ‘ )2-QDs655的混合物为二抗。图2显示，两个癌巢之间有丰富的新生血管和浸润巨噬细胞， 而间质的重要成分IV型胶原则被降解，发生间质重塑。图3显示，随着肿瘤细胞的扩增，间 质屏障逐渐消失，在此过程中可见巨噬细胞在癌巢周边聚集，癌巢周边新生血管丰富。放大倍数400X(图2，图3)；标尺20 μ m (图2，图3)。在紫外光(波长 330^385 nm)激发下，通过Olympus DP72成像系统采集图象
图4为一种传统免疫组织化学染色分别显示肿瘤微环境内三种成分的结果示意图。因无法实现在同一切片上对这三张成分同时染色，因此只能分别染色后再综合分 析肿瘤微环境成分的变化。图4中A为用特异性兔抗人IV型胶原抗体作为一抗，生物素化的山羊抗兔IgG 为二抗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶为反应剂，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine， DAB)为显色底物的记结果，显示肿瘤微环境间质成分。图4中B为用特异性山羊抗人⑶105抗体作为一抗，生物素化的兔抗山羊IgG为二 抗，链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶为反应剂，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB) 为显色底物的记结果，显示肿瘤新生血管。图4中C为用鼠抗人巨噬细胞作为一抗，生物素化的山羊抗鼠IgG为二抗，链霉素 抗生物素蛋白-过氧化物酶为反应剂，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)为显色底 物的记结果，显示浸润巨噬细胞。图4中D为用TBS作为一抗，生物素化的山羊抗鼠IgG为二抗，链霉素抗生物素蛋 白-过氧化物酶为反应剂，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)为显色底物的记结果， 作为对照组。放大倍数400X (A, B, C, D)；标尺20 μ m (Α, B, C, D)。在紫外光(波 长33(T385 nm)激发下，通过Olympus DP72成像系统采集图象
图5为一种光谱定量分析三色标记结果的示意图
图5中A为一种量子点三色标记同时显示肿瘤微环境内三种成分的结果示意图。实验 中采用鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体、兔抗人IV型胶原多克隆抗体、山羊抗人CD105多克隆 抗体的混合物为一抗，F(ab' )2-QDs525, F(ab' )2-QDs585 和 F(ab‘ )2_QDs655 的混合 物为二抗。图5中B为采用光谱定量分析时所分离的F(ab' )2-QDs525, F(ab' )2_QDs585 和F (ab ‘ ) 2-QDs655光谱信号。图5中C为根据B所分离的信号重新赋色后的合成图片。图5中D为对分离出的F(ab' )2_QDs525信号进行定量检测的结果示意图。图5中E为对分离出的F(ab' )2_QDs585信号进行定量检测的结果示意图。图5中F为对分离出的F(ab' )2_QDs655信号进行定量检测的结果示意图。放大倍数400X(A, B, C, D)，在紫外光(波长330 385 nm)激发下，通过 Olympus DP72成像系统及CRi Nuance多光谱成像系统采集图象。
具体实施例方式
实施例1 一种同时标记肿瘤间质IV型胶原、巨噬细胞和生血管的方法，其步骤是 1.福尔马林固定石蜡包埋的胃癌组织4μπι厚切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱 载玻片上。2.组织切片的准备，将组织切片放入二甲苯中脱蜡三次(不同的器皿中)，每次5 分钟，脱蜡后将组织切片依次放入无水乙醇5分钟、95%酒精2分钟、95%酒精2分钟和80% 酒精2分钟，流水冲洗3飞分钟。3.抗原修复，用柠檬酸三钠29. 41g(国药集团化学试剂有限公司)，双蒸水IOOOml 配制柠檬酸三钠缓冲液，柠檬酸10. 5g (国药集团化学试剂有限公司)，双蒸水500 ml配制 柠檬酸缓冲液，分别取柠檬酸三钠缓冲液20. 25ml、柠檬酸缓冲液4. 75ml和225ml双蒸水配 制成柠檬酸抗原修复液(0. Olmol,pH 6. 0，250ml)。将组织切片置于加入了 250ml抗原修复 液的抗原修复盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)中微波(美的微波炉-MK823ESJ-PA)修 复(低火修复5分钟后转至中火修复10分钟)，然后室温放置待玻片自然冷却。4.洗涤切片，用三羟基氨基甲烷(Tris) 6. 05g和氯化钠38. Og (均为国药集团化 学试剂有限公司)及双蒸水5000，配制0. 01M/L、pH7. 2-7. 4的TBS作为洗涤液，洗涤3次， 每次3min ；
5.封闭，封闭液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白(上海如吉生物科技发展有限公司)的 TBS，封闭条件为湿盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限 公司)，30min ；
6.传统的加一抗，去除上述封闭液后，滴加鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体(MA1-38069， ABR, USA)、兔抗人IV型胶原多克隆抗体(ab-6586，Abeam, England)、山羊抗人CD105 多克隆抗体(sc-13595，Santa Cruz, USA)的一抗混合物(三种抗体的稀释比分别为 1:200，1:50和1:50，稀释液为TBS)，湿盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒温培养箱，上海 精宏实验设备有限公司)3^4h或4°C冰箱过夜(不少于12h)；
7.洗涤切片，清洗液为TBST(含0. 5%/vol/vol吐温#20的TBS)，洗涤3次，每次3min ；
8.封闭，同步骤4;
9.免疫组织化学染色方法染色背景高、特异性差，为解决此问题，本实验采用与一抗种 属相对应的免疫球蛋白G (Ig G)抗原结合片段(Fragment antibody binding, F(ab' )2 段)作为二抗及显示剂(见后述)，减少了 IgG可结晶片段(Fragment crystallizable, Fc 段)在组织染色过程中的非特异性吸附及交叉反应。本实验中所用二抗为量子点QDs525标 记的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs525)、量子点QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段 (Fragment antigen-binding, Fab g) (F(ab' )2-QDs585)>fi^;i( QDs655 feidW^^l 山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原结合片段(Fragment antigen-binding, Fab段)(F(ab' )2-QDs655)，均购自hvitrogen公司。去除上述封闭液后，滴加F(ab' )2-QDs525、F(ab' )2-QDs585和F(ab' ) 2_QDs655混合物(三种二抗稀释比均为1:100，稀释液为含2%wt/vol 牛血清白蛋白的TBS)，湿盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备 有限公司)，2 3h。10.洗涤切片，TBST洗涤2次，每次2min，再用TBS洗涤一次，!3min。11.封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%缓冲甘油，缓冲甘油封片后即可观察结果。传统的酶-底物显色系统依赖于色原的沉积，在组织上非常近似，难以同时观察一 张切片同一部位两种抗原的共表达定位。而在传统的免疫荧光双标染色法中，有机染料必 须在不同波长下激发，然后利用图像处理软件进行图像叠加，才能获得合成的最后的荧光 双标染色结果。但本技术采用新型纳米荧光材料量子点显色，在荧光显微镜下经紫外光 (33(T385nm)激发后即可观察到显示绿色荧光的巨噬细胞、显示橙黄色荧光的IV型胶原和 显示红色荧光的肿瘤新生血管。实现了对多种抗原(IV型胶原、巨噬细胞、⑶105)进行多种 颜色(绿色F(ab' )2-QDs525,橙黄色F(ab' )2-QDs585和红色F(ab' )2-QDs655)标记， 无需图像叠加及处理，实现了实验结果的所见即所得，简化了多色标记结果的获取途径，减 少了图像处理引起的偏倚。 用量子点进行免疫荧光多重染色，在敏感度高、特异性强的前提下，同时显示肿瘤 微环境内多种成分的变化特点，并具有石蜡切片免疫组化染色组织细胞结构清晰、抗原定 位准确的特点。通过量子点免疫荧光三标法，同时显示了肿瘤微环境内间质重塑，巨噬细胞 浸润、肿瘤血管发生的过程。该方法适用于石蜡包埋的任何肿瘤组织，更重要的是，采用该 方法能够简便、快捷、灵敏而准确地对肿瘤微环境进行分析，无需图片合成等后期步骤。
权利要求
1. 一种同时标记肿瘤IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法，其步骤是A、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织4μ m厚切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱 载玻片上；B、组织切片的准备，将组织切片放入二甲苯中脱蜡三次，每次4-6分钟，脱蜡后将组 织切片依次放入无水乙醇4-6分钟、95%体积比酒精1-3分钟、95%体积比酒精1_3分钟和 80%体积比酒精1-3分钟，流水冲洗3飞分钟；C、抗原修复，用柠檬酸三钠29.41g，双蒸水IOOOml配制柠檬酸三钠缓冲液，柠檬酸 10. 5g，双蒸水500 ml配制柠檬酸缓冲液，分别取柠檬酸三钠缓冲液20. 25ml、柠檬酸缓冲 液4. 75ml和225ml双蒸水配制成柠檬酸抗原修复液0. Olmol, pH 6. 0，250ml，将组织切片 置于加入了 250ml抗原修复液的抗原修复盒中微波修复，低火修复4-6分钟后转至中火修 复9-11分钟，然后室温放置待玻片自然冷却；D、自来水冲洗后取出切片，洗涤切片，用三羟基氨基甲烷6.05g和氯化钠38. Og及双蒸 水5000ml，配制0. 01M/L、pH7. 2-7. 4的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水作为洗涤液，洗涤3次， 每次3分钟；E、封闭，封闭液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封闭条件为湿盒孵育，370C， 30min ；F、加一抗，去除上述封闭液后，滴加鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体、兔抗人IV型胶原多 克隆抗体、山羊抗人⑶105多克隆抗体的一抗混合物，37°C湿盒内孵育3 4h或4°C冰箱过 夜；G、洗涤切片，清洗液为含0.5%/vol/vol吐温#20的TBS，洗涤3次，每次^iin ；H、封闭，同步骤(D)；I、用二抗为量子点QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原结合片段量子点 QDs525、量子点QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原结合片段量子点QDs585、量子 点QDs655标记的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab' )2_QDs655，去除上述封闭 液后，滴加量子点QDs525、量子点QDs585和量子点QDs655混合物，稀释液为含2%Wt/vol牛 血清白蛋白的TBS，湿盒孵育，37°C，2 3h ；J、洗涤切片，清洗液与步骤(G)所用清洗液相同，TBS按步骤(D)的配方制备，洗涤2次， 每次2min，再用TBS洗涤一次，3min ；K、封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%体积比缓冲甘油，缓冲甘油封片后4°C保存， 在荧光显微镜下用紫外光33(T385nm激发观察到显示绿色荧光的巨噬细胞、显示橙黄色荧 光的IV型胶原和显示红色荧光的肿瘤新生血管。
全文摘要
本发明公开了一种同时标记肿瘤IV型胶原、巨噬细胞和新生血管的方法，其步骤1、组织切片，固定于经多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上；2、将组织切片放入二甲苯中脱蜡；3、抗原修复；4、洗涤切片；5、封闭；6、加一抗；7、洗涤切片；8封闭，同步骤4；9、用二抗为量子点QDs525标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs525、量子点QDs585标记的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs585、量子点QDs655标记的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原结合片段F(ab′)2-QDs655，去除封闭液后，滴加混合物；10、洗涤切片；11、封片，用甘油和TBS10ml配成缓冲甘油，缓冲甘油封片后保存。本发明用于肿瘤组织微环境多种成分的高效、准确、快速、同时检测。
文档编号G01N33/533GK102072959SQ201010546038
公开日2011年5月25日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者庞代文, 彭春伟, 朱小波, 李雁 申请人:武汉大学
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