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专利名称：复杂样品的高通量检测电极及其制备方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，更具体涉及复杂样品的高通量检测电极及其制备方 法。
背景技术：
在水样、血液或是人体细胞的检测时，这些样品同时含有多种复杂成分，例如水样 中的含有(如Pb2+，Hg2+，U02+，微生物)、血液中的蛋白质(凝血酶)或人体中的致病细胞，一 般检测时往往必须要逐一检测(例如金属离子可以用原子吸收法、电感耦合等离子体法、阳 极溶出法、毛细管电泳等进行检测)这样得到结果的时间大大增加。尽管这些常规的方法 有着高的灵敏度的优点，然而检测所用的仪器十分精密，需要对复杂的样品进行前处理，以 及要求训练有素的人进行熟练的操作等。人们利用物质的一些理化性质研制出了一系列的 传感器，能够将这些物质的存在以及含量的高低通过实验室易得到的信号来表示，如光，电 等，这样一般实验室就可以通过一些简单的方法实现复杂物质的检测了，然而这些传感器 也存在着不足之处，就是它们的选择性与常规的方法相比还不令人满意。近十几年来，DNA技术得到了长足的发展。DNA (或RNA)除了能和互补的序列杂交 外，某些特定的序列还能够与金属离子、生物小分子，甚至是细胞发生特异性地结合形成适 配体-目标物的复合结构。目前已经发现的适配体已经超过百种，然而仍有大量的适配体 还未被人们筛选出来。人们利用现有的适配体已经研制出大量的传感器，这些传感器具有 选择性好，灵敏度高，检测限低等优点，同时它们易于操作，仪器及药品的费用低廉，克服了 常规方法的缺陷，有着广阔的应用前景。由于电化学的灵敏度高，且仪器操作简便，基于电 化学的DNA传感器已有诸多报道。这些方法的原理主要基于目标物的引入使DNA链断裂或 是剥离，使得电极表面的DNA结构发生变化，从而引起电化学信号(如电流值，电量，以及阻 抗信号等)的改变。然而这些方法只能对一种目标物(最多是两三种)进行检测，而且信号 表达不直观，如果待测物的数量众多，就要重新对电极进行修饰，这样就需要大量的电极以 及待分析物，因此，对含有多组分的复杂待测物进行同时检测，并且检测的结果能够清晰地 辨认，成为人们关注的焦点。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能够实现多通道检测的电极，该电极可与恒电位仪， 多路复用器，用于控制和采集数据的程序联合，实现了同时对含有多种组成的待测物进行 检测。一种能够实现多通道检测的电极为阵列电极，该电极由横向电极与纵向电极相互 交叉放置构成，该阵列电极的制备方法为
1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮分别超声清洗 10min-30min，放置在丙酮中8_12h ；
2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后，均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15 秒，用显影剂清洗固化；
3)将2)显影后的玻璃表面灰化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd 和Au的厚度分别为0. 5—1. 5nm和5-8nm ；镀上金属的玻璃用丙酮清洗，之前未曝光的部分 随着丙酮的清洗从玻璃表面剥离，在金属层的焊点处接上铜导线，将其中一块定为横向电 极；
4)将3)得到的另一块电极再次灰化后在表面涂覆上一层负光阻剂，平放在曝光仪的 平台上，上方放置另一块Cr板，让紫外光透过该Cr板，对电极进行曝光刻蚀，显影剂用乙醇 清洗，未曝光的部分剥离表面，在电极上形成nXn个100Χ100Χ5μπι，长X宽X高的微 孔，得到纵向电极；
5)将3)和4)得到的横向电极和纵向电极相互交叉垂直放置，使纵向电极的微孔与横 向电极的电极线对齐；两片电极之间通过双面胶隔开。所采用的正光阻剂为常用的正光阻剂，可为S1818正光阻剂；步骤4)中所采用的 负光阻剂为常用的负光阻剂，可为SU-8负光阻剂。所述的阵列电极与恒电位仪，多路复用器，用于控制和采集数据的程序联合，实现 了多组分的同时在线监测的步骤为
步骤1)，捕获探针的固定在纵向电极的微孔内通过金巯键固定上捕获探针； 步骤2)，将目标物的适配体与捕获探针陈化发生杂交，在两片电极间注入铁氰化钾溶 液，利用恒电位仪在两片阵列电极上分别施加0和0. 6V电压，得到的电流转化为电流形貌 图，形貌图上颜色的深浅反映出电流的强弱；
步骤3)，将目标物加到微孔里，目标物可以与适配体结合，让适配体部分发生断裂或是 剥离出微孔表面；之后对表面清洗移除脱落下来的DNA片断，再在两片电极上分别施加0和 0. 6V电压，得到的电流值转化为电流强形貌图，通过与步骤2)的进行比较，可以通过形貌 图颜色的改变来判断某些物质是否存在。本发明的显著优点为
本发明设计了一种新型的多通道检测电极装置。DNA先固定在纵向电极的微孔中，当目 标物引入后，使微孔上的DNA数量发生变化，引起负电荷的磷脂骨架的变化，引起了电流信 号的改变。由于一个微孔可以固定一种DNA，而不同DNA可以对特定的目标物响应，因此这 种方法改变了以往传感器只能检测单一目标物的状况，能够同时对多种不同的组分进行分 析，而且利用了 DNA磷酸骨架电负性这一特点，能够实现免标记检测，并且让DNA的特性没 有发生改变。同时检测的电流信号能够转化为电流的形貌图，电流的强弱能通过形貌图上 颜色的深浅进行直观地辨认。由于DNA具有良好的特异性，因此目标与与其它物质共存时， 可以避免其它物质引起的干扰，因此该方法能够很好地实现多组分的同时在线监测。


图1是本发明的阵列电极与恒电位仪，多路复用器，用于控制和采集数据的程序 联合具有高通量检测的装置的示意图，其中1是多路复用器；2是恒电位仪；3是用于控制 和采集数据的程序；4是阵列电极。图2是本发明的阵列电极示意图，其中(a)为该电极的俯视图，(b)为该电极的前视图。1是横向电极；2是纵向电极；3’和3’’分别是横向电极与纵向电极的玻片底物；4是 硬化后的光阻剂；5是双面胶。
具体实施例方式一种能够实现多通道检测的电极为阵列电极，该电极由横向电极与纵向电极 相互交叉放置构成，该阵列电极的制备方法为
1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮分别超声清洗 10min-30min，放置在丙酮中8_12h ；
2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后，均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在 曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15 秒，用显影剂清洗固化；
3)将2)显影后的玻璃表面灰化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd 和Au的厚度分别为0. 5—1. 5nm和5-8nm ；镀上金属的玻璃用丙酮清洗，之前未曝光的部分 随着丙酮的清洗从玻璃表面剥离，在金属层的焊点处接上铜导线，将其中一块定为横向电 极；
4)将3)得到的另一块电极再次灰化后在表面涂覆上一层负光阻剂，平放在曝光仪的平 台上，上方放置另一块Cr板，让紫外光透过该Cr板，对电极进行曝光刻蚀，显影剂用乙醇清 洗，未曝光的部分剥离表面，在电极上形成nXn个100X 100X 5 μ m，长X宽X高的微孔， 得到纵向电极；
5)将3)和4)得到的横向电极和纵向电极相互交叉垂直放置，使纵向电极的微孔与横 向电极的电极线对齐；两片电极之间通过双面胶隔开。应用本发明的阵列电极与恒电位仪，多路复用器，用于控制和采集数据的程 序联合具有高通量检测的装置检测待测样品包括以下几个步骤
步骤一，捕获探针的固定在纵向电极的微孔内通过金巯键固定上捕获探针。步骤二，将一系列目标物的适配体与捕获探针陈化发生杂交，利用恒电位仪在传 感器两片电极上施加电压，得到的电流转化为电流形貌图，形貌图上颜色的深浅反映电流 的强弱。步骤三，将目标物加到微孔里，目标物可以与适配体结合，让适配体部分发生断裂 或是剥离出微孔表面。之后对表面清洗移除脱落下来DNA片断，再在两片阵列电极上施加 电压，得到的电流值转化为电流形貌图，通过与步骤二的进行比较，可以通过形貌图颜色的 改变来判断某些物质是否存在。以下实施例来叙述本发明的具体工作原理。实施例1
该电极的制作方法为1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮 分别超声清洗IOmin，放置在丙酮中8h，2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后， 均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路 的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15秒，用显影剂清洗固化；3)将2)显影后的玻璃表面灰 化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd和Au的厚度分别为0. 5nm和5nm ； 其余步骤同具体实施方式
。
5
以水样作为作为检测对象进行分析，水样中包含Pb2+、Zn2+，Cu2+，U02+，采用的微孔 个数为4X4个
步骤一，将四种探针DNA(对于金属主要是metal-d印endent DNAzyme,因此探针DNA为 DNA酶(DNAzyme)的互补链)通过金-巯键固定在四个相互独立的微孔中。步骤二，在上述四个微孔中分别加入相应的互补链底物，陈化杂交。在两片电极间 注入铁氰化钾溶液，并分别施加O和0. 6V电压，让铁氰根离子在电极间发生氧化还原，产生 电流信号，电流转换得到有着4X4个格子的反映电流形貌图，形貌图中每个格子颜色的深 浅反映了电流的强弱。步骤三，将电极小心清洗干净，把可能含有上述四种的金属离子的待测液加入到 微孔中，反应一段时间，小心清洗微孔。然后，重复实验例步骤二的检测步骤，得到4X4个 格子的电流形貌图。通过与步骤二得到的图对比，根据颜色深浅的改变来识别待测液中所 包含的离子类型。实施例2
该电极的制作方法为1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮 分别超声清洗30min，放置在丙酮中10h，2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后， 均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路 的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15秒，用显影剂清洗固化；3)将2)显影后的玻璃表面灰 化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd和Au的厚度分别为1. 5nm和8nm ； 其余步骤同具体实施方式
。以吸毒人员的血样作为研究对象进行分析，血样中含有可卡因、三磷酸腺苷、凝血 酶，采用的微孔个数为4X4个
步骤一，将三种探针DNA(由于适配体能特异性地结合小分子以及蛋白质，因此探针DNA 为相应适配体的互补链)通过金_巯键固定在三个相互独立的微孔中。步骤二，在上述三个微孔中分别加入相应的互补链底物，陈化杂交。在两片阵列电 极间注入铁氰化钾溶液，并分别施加0和0. 6V电压，让铁氰根离子在电极间发生氧化还原 产生电流信号，电流转换得到有着4X4个格子的反映电流强弱的形貌图，每个格子颜色的 深浅反映了电流的强弱。步骤三，将电极小心清洗干净，把处理过的血样待测液加入到微孔中，反应一段时 间，小心清洗微孔。然后，重复实验例步骤二的检测步骤，得到4X4个格子的电流形貌图。 通过与步骤二得到的图对比，根据颜色深浅的改变来识别血样待测液中所包含的小分子及 蛋白质类型。实施例3
该电极的制作方法为1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮 分别超声清洗20min，放置在丙酮中9h，2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后， 均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路 的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15秒，用显影剂清洗固化；3)将2)显影后的玻璃表面灰 化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd和Au的厚度分别为Inm和7nm ；其 余步骤同具体实施方式
。以人的细胞样品作为研究对象进行分析，样品中包含人B淋巴瘤细胞，前列
6腺癌细胞，采用的微孔个数仍为4X4个
步骤一，将二种探针DNA(由于适配体能特异性地结合到对应细胞的表面，因此探针DNA 为相应适配体的互补链)通过金_巯键固定在两个相互独立的微孔中。步骤二，在上述两个微孔中分别加入相应的互补链底物，陈化杂交。在两片电极间 注入铁氰化钾溶液，并分别施加O和0. 6V电压，让铁氰根离子在电极间发生氧化还原产生 电流信号，电流转换得到有着4X4个格子的反映电流形貌图，形貌图中每个格子颜色的深 浅反映了电流的强弱。步骤三，将电极小心清洗干净，把细胞样品加入到微孔中，反应一段时间，小心清 洗微孔。然后，重复实验例步骤二的检测步骤，得到4X4个格子的电流形貌图。通过与步 骤二得到的图对比，根据颜色深浅的改变来识别细胞样品中所包含的癌细胞类型。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
复杂样品的高通量检测电极，其特征在于所述的电极为阵列电极，由横向电极与纵向电极相互交叉放置构成。
2.复杂样品的高通量检测电极的制备方法，其特征在于所述的阵列电极的制备方法为1)将两块玻璃片切割成适当尺寸，洗净，用二次水、乙醇和丙酮分别超声清洗 10min-30min，放置在丙酮中8_12h ；2)将上述处理好的两块玻璃片进行表面灰化后，均勻地涂覆上一层正光阻剂；平放在 曝光仪的平台上，玻璃片上放置一块预先刻蚀有纹路的Cr模板，紫外光透过Cr板曝光15 秒，用显影剂清洗固化；3)将2)显影后的玻璃表面灰化，在金属溅射器里将玻璃表面均勻溅射上Cd和Au，Cd 和Au的厚度分别为0. 5—1. 5nm和5-8nm ；镀上金属的玻璃用丙酮清洗，之前未曝光的部分 随着丙酮的清洗从玻璃表面剥离，在金属层的焊点处接上铜导线，将其中一块定为横向电 极；4)将3)得到的另一块电极再次灰化后在表面涂覆上一层负光阻剂，平放在曝光仪的 平台上，上方放置另一块Cr板，让紫外光透过该Cr板，对电极进行曝光刻蚀，显影剂用乙醇 清洗，未曝光的部分剥离表面，在电极上形成nXn个100X100X5 μ m，长X宽X高的微 孔，得到纵向电极；5)将3)和4)得到的横向电极和纵向电极相互交叉垂直放置，使纵向电极的微孔与横 向电极的电极线对齐；两片电极之间通过双面胶隔开。
3.—种如权利要求2所述的阵列电极的制备方法，其主要特征在于步骤2)中所采用 的正光阻剂为常用的正光阻剂，可为S1818正光阻剂；步骤4)中所采用的负光阻剂为常用 的负光阻剂，可为SU-8负光阻剂。
4.一种如权利要求1或2所述的阵列电极，其主要特征在于该电极可与恒电位仪，多 路复用器，用于控制和采集数据的程序联合，实现了多组分的同时在线监测。
5.一种如权利要求4所述的阵列电极，其主要特征在于所述的阵列电极与恒电位仪， 多路复用器，用于控制和采集数据的程序联合，实现了多组分的同时在线监测，其检测方法 为步骤1)，捕获探针的固定在纵向电极的微孔内通过金巯键固定上捕获探针；步骤2)，将目标物的适配体与捕获探针陈化发生杂交，在两片电极间注入铁氰化钾溶 液，利用恒电位仪在两片阵列电极上分别施加0和0. 6V电压，得到的电流转化为电流形貌 图，形貌图上颜色的深浅表示电流的强弱；步骤3)，将目标物加到微孔里，目标物可以与适配体结合，让适配体部分发生断裂或是 剥离出微孔表面；之后对表面清洗移除脱落下来的DNA片断，再在两片阵列电极上分别施 加0和0. 6V电压，得到的电流值转化为电流形貌图，通过与步骤2)的进行比较，可以通过 形貌图颜色的改变来判断某些物质是否存在。
全文摘要
本发明提供了一种能够对含有多种成分的待测物进行在线同时检测的电极。该电极可与恒电位仪，多路复用器，以及数据处理软件结合，利用不同DNA序列对的不同目标物的特异性，对待测物进行在线检测，将阵列的直观性同DNA特异性相结合研制的传感装置鲜有报道。对于含有多种组成的待测物，这种装置也能实现同时在线检测，并且可操作性强，具有仪器简单的优点。
文档编号G01N27/403GK101975810SQ20101052606
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者朱希, 林振宇, 邱彬, 陈国南 申请人:福州大学