专利名称：革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的制备及其使用方法
革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的制备及其
使用方法所属领域生物医药范畴，更确切说是应用人工合成显色基质，利用革兰阴性菌内毒素激活东方鲎血细胞裂解物中C因子，从而水解合成显色基质B0C-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N， N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)进而发生缩合反应而定量检测细菌内毒素方法及相关应用于临床早期诊断革兰阴性细菌感染的产品。
背景技术：
经初步检索，未查到以人工合成显色基质Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)制备成比色检测革兰阴性菌内毒素试剂专利。
发明内容
本发明是以人工合成显色基质Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N- 二乙氨基苯胺)利用微量细菌内毒素特异性地激活东方鲎血细胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细胞裂解物凝固化反应。被激活的凝固酶水解合成显色基质释放出显色基团DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)，DIAN与1-萘酚-4-磺酸钠、(1_萘酚_2_磺酸钠或1_萘酚-5-磺酸钠)在高碘酸钠存在下生成蓝色缩合物，在630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测出样品中细菌内毒素浓度。 该试剂盒可以用来早期诊断临床革兰阴性菌内毒素感染。参照说明书附图
将本发明内叙述如下一、合成显色基质采用生物技术人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、 Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)类显色基质。具体合成工艺(见工艺路线图)。二、东方鲎血细胞裂解物提取、分离2. 1血细胞裂解液配制其中裂解液中成分应含有Na+，Mg2+，Ca2+等金属离子，调节PH后并进行121°C 90分钟灭菌处理后方可使用。2. 2血细胞裂解无菌操作，取约20g血细胞，按照1-5比例加入血细胞裂解液，并用高速均浆机进行200000rpm/min，5-10分钟破损细胞，将破损后的组织细胞液放入_30°C 冰箱内快速冷冻保存10小时，之后将冷冻细胞液取出，在室温下缓慢溶解，待全部溶解后， 再用高速组织均浆机进行200000rpm/min，5-10分钟破损细胞，然后将破损后的组织细胞液再次放入-30°C冰箱内快速冷冻保存10小时，重复上次过程2遍即可。2. 3血细胞分离、提取将上述血细胞裂解液取出后进行3000rpm/min，5-8分钟离心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，剧烈震荡10分钟，然后转移至无热原离心沉淀管中在4°C下进行10000rpm/min，5-10分钟分离，仔细取出上清液备用。三、显色合成基质及缩合溶液的配制及处理1、显色合成基质溶液配制将显色合成基质用灭菌注射用水溶解，配制成6mM浓度，使用0. 22um滤膜过滤， 4°C保存备用。2、显色液A为6mM的1_萘酚_4_磺酸钠溶液(使用pH 8. 5浓度为0. 05mol的硼酸缓冲液配制)。3、显色液B为2%高碘酸钠溶液(使用注射用水配制)。4、显色液A及显色液B处理将上述显色液A及显色液B配制后，分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。5、显色合成基质溶液处理将显色合成基质溶液，分装至西林瓶或安瓿瓶中然后进行冷冻干燥。四、反应主剂的制备与标定1、取提取、分离好的东方鲎血细胞的上清液，加到含有1. OM氯化镁0. 5M氯化钙溶液中，分装至西林瓶或安瓿瓶中进行冷冻干燥即为反应主剂。2、取上述冷冻干燥好的反应主剂，按照标示值加入溶解液使其完全溶解，然后用灭菌注射用水1-10倍稀释，用紫外分光光度计检测，应在270士3nm处有吸收峰。3、将细菌内毒素标准品用溶解液溶解并稀释成最终浓度为50pg/ml溶液，与反应主剂反应，应出现反S型检测峰。五、革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的性能1、灵敏度将细菌内毒素标准品用溶解液依次稀释成100pg/ml，50pg/ml，25pg/ ml, 12. 5pg/ml，6. 25pg/ml，3. 125pg/ml的标准系列，参照试剂盒使用说明书进行检测，测定各自的吸光度值；以各标准溶液浓度为X轴，以吸光度值为Y轴作图分析，其直线相关系数 r应大于0. 980。2、特异性在已知细菌内毒素浓度的空白血浆中添加一定量的细菌内毒素标准溶液，其检测回收率应在80-120%之间。3、重复性对同一样品进行4回检测，其吸光度值的CV值应在10%以内。4、测定范围3. 125-100pg/ml 之间。六、革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的组成1、组成如下表所示
权利要求
1.革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的制备及其使用方法，以人工合成显色基质 Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N, N- 二乙氨基苯胺)，利用微量细菌内毒素特异性地激活东方鲎血细胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，从而诱发东方鲎血细胞裂解物凝固化反应.被激活的凝固酶水解合成显色基质释放出显色基团DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)， DIAN与显色剂A (1-萘酚-4-磺酸钠、1-萘酚-2-磺酸钠或1_萘酚_5_磺酸钠)在高碘酸钠显色剂B的存在下生成蓝色缩合物，在630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸收度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测出样品中细菌内毒素浓度；试验过程应严格按照使用说明书上具体操作方法进行操作，同时要注意一些操作过程中的注意事项；该试剂盒可以用来早期诊断临床革兰阴性菌败血症感染，作为临床诊断的参考之一。
2.如权利要求1所述的人工合成显色基质包括Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 及 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N- 二乙氨基苯胺)三种。
3.如权利要求1所述的显色剂A包括1-萘酚-4-磺酸钠、1-萘酚-2-磺酸钠及1-萘酚-5-磺酸钠以及显色剂B (高碘酸钠)等。
4.如权利要求1所述的所生成的蓝色缩合物，在630-680nm波长处，酶原激活量与形成的缩合物的吸光度在一定范围内呈线形关系。
5.如权利要求2所述的人工合成显色基质的浓度为I-IOMol之间，配制后分装冷冻干燥或溶液在2-8°C避光保存，BoC-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)核磁图见说明书附图3。
6.如权利要求3所述的显色剂1-萘酚-4-磺酸钠、1-萘酚-2-磺酸钠及1-萘酚-5-磺酸钠的浓度为0. 2-lOMol之间，并使用0. 05-5Mol硼酸缓冲液配制(ρΗ 8. 5-8. 9)，其显色剂高碘酸钠的浓度为0. 2-20%之间，使用灭菌注射用水配制，分装在棕色瓶中冷冻干燥或溶液在2-8 °C避光保存。
7.如权利要求1所述的试剂盒具体操作方法为将反应主剂掰开，加入反应主剂用溶解液0. 1ml，轻轻混勻溶解，分别加入标准品稀释系列、阴性对照及待测样品各0. Iml, 37 0C 保温60-120分钟；之后分别加入0. Iml合成显色基质，37°C保温15分钟；(或使用显色基质用溶解液0. 6ml溶解显色基质混勻，然后再溶解反应主剂；取出0. 1ml，分别加入标准品稀释系列、阴性对照及待测样品各0. 1ml，37°C保温60-120分钟)取出振摇均勻，然后加入显色剂A 50ul混勻，之后加入0. Iml显色剂B混勻，室温放置5_20分钟，最后在波长 630-680nm检测吸光度值，计算含量。
8.如权利要求1所述的试剂盒使用过程中注意外环境的影响以及所使用器具中含有的细菌内毒素的污染，会对测定值产生影响；尤其是显色试剂添加前操作一定要避免微生物以及细菌内毒素的污染。
全文摘要
本发明涉及一种革兰阴性菌脂多糖(内毒素)比色检测试剂盒的制备及其使用方法。本发明是利用微量革兰阴性菌内毒素激活鲎血细胞裂解物中C因子，从而水解显色基质(Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，进而发生缩合反应从而定量检测细菌内毒素方法。
发明内容
以人工合成显色基质Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，利用微量内毒素特异性地激活鲎血细胞裂解物中的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，被激活的凝固酶水解显色基质释放出基团DIAN，DIAN与1-萘酚-4-磺酸钠、(1-萘酚-2-磺酸钠或1-萘酚-5-磺酸钠)在高碘酸钠存在下生成蓝色缩合物，在630-680nm波长处，酶原激活量与缩合物的吸光度在一定范围内呈线形关系，从而定量检测样品中内毒素浓度。该试剂盒可以用来早期诊断革兰阴性菌败血症感染。
文档编号G01N21/78GK102305788SQ201010552719
公开日2012年1月4日 申请日期2010年11月22日 优先权日2010年11月22日
发明者何永胜, 苑庆华 申请人:天津市一瑞生物工程有限公司
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