专利名称：泛激酶活化与信号通路的评估的制作方法
技术领域：
本发明的一些实施方式涉及信号转导途径中信号蛋白激活状态的测定方法。在至 少一些实施方式中，提供了监测患者体内信号转导抑制剂效率的方法。本发明更进一步地 提供了高灵敏度的测试方法，该方法可用于难以获得大量细胞样品的患者群体，例如新生 儿等。本发明的一些实施方式涉及识别新的信号转导途径蛋白抑制剂的方法。本发明的一 些实施方式涉及检测患者样本中脓毒症的方法。还提供了实践本发明方法的试剂盒。许多疾病具有细胞信号途径被破坏而导致包括癌细胞不受控制地生长和增殖以 及异常发炎过程等病变的特征。此类缺损可以包括脂类激酶(参与催化磷酸基团向脂质转 移的一类酶)的活性变化。这些磷酸化的脂质依次募集下游蛋白质，从而把上游信号介质 例如受体酪氨酸激酶和抗原受体等产生的信号放大。例如，蛋白激酶Akt由磷脂募集至质 膜并被激活。一旦被激活，Akt就在正常组织和癌变组织的存活中起到关键的作用。磷脂酰肌醇3-激酶(PUKs)是一类在很多细胞表面受体的下游信号通路中起着 关键作用的脂类激酶家族，控制着生长、增殖以及细胞存活。活性的PDKs由两个亚单位组 成，一个分子量为85或者55kD的调节亚单位(p85或，和一个分子量为1 IOkD的催化亚 单位(PllO)。调节亚单位一方面对于PII的功能很关键，此外这些调节亚单位也能独立于 ΡΙ3Κ进行信号传递(Ueki et al. ,J Biol. Chem. November 28 ；278 (48) :48453-66 (2003)) 最近的研究证明，ρ85-α能通过可诱导的转录因子NFAT3不依赖PII信号通路来诱导细 胞程序死亡(Song et al.，Mol. Cell. Biol. 27 :2713-2731 (2007))。包括糖尿病、心力衰竭和包括结直肠癌、急性骨髓性白血病、乳腺癌、神经胶质瘤 和卵巢癌等很多癌症在内的多种人类疾病中都有PII涉及其中(参见Kim et al. ,Curr. Opin. Investig. Drugs. December ；6 (12) :1250-8(2005)等)。PI3K 抑制剂作为用于包括癌 症、心力衰竭和自身免疫/炎症等疾病在内的潜在治疗剂的研究正在进行中。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导途径同样涉及细胞增殖和分化。这个 路径在卵母细胞减数分裂成熟的调节中起作用(Moriguchi et al. , Adv. Pharmacol. 36 121-137(1996) ；Murakami et al. , Methods in Enzymology 283 :584-600(Dunphy, ed., 1997) ；Matten et al. , Seminars in Dev. Biol. 5 :173-181(1994))。在细胞生长、存活和分化的调节中同样涉及MAPK路径(Lewis et al.，同前)。此 外，激活的MAPK和/或MAPK表达水平的提高已在多种人类肿瘤中检测到((Hoshino，R. et al.，Oncogene 18 :813-822(1999) ；SaIh, B. et al.，Anticancer Res. 19 :741-48(1999)； Sivaraman, V. S. et al. , J. Clin. Invest. 99 :1478-483(1997) ；Mandel 1, J. W et al., Am. J. Pathol. 153 :1411-23 (1998) ；Licato, L.L. et al.Digestive Diseases and Sciences 43，1454-1464 (1998))，并且可能与肿瘤细胞的侵入、转移和血管生成活性有关 联。因此MAH(途径不合宜的活化是多种肿瘤普遍的基本特征。因该原因，这一信号通路的 参与者，例如MEK等，成为癌症疗法的潜在靶标。已有几个团队开发了用于监控各种信号转导途径抑制剂的测试方法。一个测试 方法是用外周血小板来检测PII > Akt通路的抑制剂活性(Bowers et al. MoL, CancerTher. 6 :2600-2607(2007)).然而，这一方法仅测量抑制对这一通路的影响(抑制血小板活 化)，而并不直接监控目标信号蛋白的磷酸化(活化)。此外，技术性困难也使得用外周血 小板对这一通路的测定具有挑战性。类似的，West等人(J. Trauma Injury, Inf. and Crit Care 62:805-811(2008)) 报道了一个基于流式细胞术的测试方法来检测脓毒�。淅猛庵苎ズ税紫赴罨娜� 失(由p38和ERK的磷酸化测得)、继之以体外暴露于脂多糖(lipopolysacharide, LPS)。 然而，这个测试方法并未确认特异性，也未记载ERK的早期活化或者所有三个MAPK通路的 二次活化。作为一个临床相关测试，该方法还易受高到无法接受的用于临床相关测试的高 背景水平的影响。例如，作者由其结果做出结论，正常对照组中表达磷酸-ERK (P-ERK)的单 核细胞百分比从没有LPS刺激的35%增加到LPS体外处理后的58%以上(添加LPS 15分 钟后测得)。相比之下，推定的脓毒症患者显示在添加LPS前有25%的P-ERK单核细胞，而 LPS体外加样后提高了不到10%。
发明内容
本领域需要一种能准确监控信号转导抑制剂在患者体内功效的测试方法。也需要 有检测并监控一些与信号转导途径信号蛋白的异常活化有关的疾病或紊乱的方法。现有的 测试方法依靠免疫印迹法技术，该技术无法从混合细胞群体中识别产生反应的实际的细胞 类型。同样，由于必须从样品中除去药物，这些测试方法不但繁琐而且灵敏度低。灵敏的测 试方法对于那些难以由其体内内获得大量样品的患者(例如新生儿)来讲，尤为需要。在一个实施方式中，本发明提供了一种用于测定在含有白细胞的样品(即血 液样品)中信号转导途径信号蛋白的激活程度的方法，包括a)将样品暴露于泛激酶 (pan-kinase)激活剂，以使样品中白细胞的至少一种信号转导途径的可激活蛋白被激活； b)用一种保存剂保存样品；c)将样品中被保存的白细胞的胞内表位解掩蔽；d)使保存的白 细胞中解掩蔽的胞内表位与多个经荧光标记的捕捉分子接触，所述多个捕捉分子包括至少 两种不同的能结合至样品中被保存的已激活的白细胞的至少两个不同的解掩蔽的胞内表 位的激活态的捕捉分子、和至少一种对照捕捉分子，其中对照捕捉分子可结合至在保存的 未被泛激酶激活剂激活(即没有激活)的白细胞上的表位；e)检测由于捕捉分子结合至激 活态的解掩蔽的胞内表位而捕捉到的被保存的活化白细胞的荧光性；f)检测由于对照捕 捉分子结合而捕捉的被保存白细胞的荧光性；以及g)比较由捕捉分子捕捉的被保存的被 活化白细胞所检测到的荧光性和由捕捉分子捕捉的被保存白细胞所检测到的荧光性。在一些实施方式中，所述方法进一步包含评估步骤g)所测得的荧光性比较和未 活化的参比样品中所测得的荧光性比较。在其它实施方式中，所述方法中样品取自于患者，在激活与未激活的样品的荧光 性大致相当时，荧光评估可以指示该患者有信号转导疾病或者症状。在至少一些实施方式中，所述方法包括在患者接受治疗剂治疗炎症、发烧、脓毒 症、癌症、糖尿病或者心力衰竭后，用由该患者所采样品重复步骤a)到g)，并通过监控活化 与未活化样品间荧光检测结果的变化来监控该治疗剂的效果。本发明还提供了一种方法，其中在确定了激活与未激活样品间的荧光检测差异 后，荧光检测的评估能指示激酶抑制剂在治疗信号转导相关疾病或状况患者中是否有效。本发明提供的方法中，把样品暴露于假定的激酶抑制剂，所述方法进一步包括当 激活的样品有至少一个信号转导途径的可激活蛋白不表现出荧光变化时，则可确定激酶抑制剂的效力。本发明还提供了用于监控信号转导抑制的试剂盒，包括泛激酶激活剂、至少两种 能与选自下组的信号转导途径蛋白质中至少一个结合的捕捉分子P38、ERK、PI3K和核糖 体S6。本发明更进一步的实施方式、特征及优势，以及各实施方式的构成与操作，在下文 中进行详细描述，并有相应的附图作为参考。
本发明所使用的附图构成说明书的一部分，各对一个或多个本发明的实施方式作 图解，并且和说明书一同更进一步地解释本发明的原理。图1是单核细胞内脂多糖(LPS)引起胞内激活的示意图。图2是测量未刺激的全血中3个MAPK通路成员(p38、JNK和ERK)的刺激检测结 果。⑶14用于识别全血样品中的单核细胞。图3是正常全血用LPS在37°C刺激10分钟后的检测结果，显示出所有⑶14+单核 细胞都有激活的P38、JNK和ERK。图4是全血单核细胞中LPS应答的动力学。本图显示，LPS在37°C下刺激2分钟 后ERK显示最先被激活，早于JNK或p38的激活。图5是全血单核细胞中LPS应答的动力学。LPS在37°C下刺激6分钟后初始的 ERK激活减弱。在后续的时间点(约10分钟)，p38、JNK和ERK出现增加。图6是LPS应答的动力学。LPS刺激60分钟后，所有3个MAPK通路的活性减弱， 但未恢复至基线。如果加入额外的LPS，没有观察到额外的MAI3K活性提高。LPS的再次刺 激(即使是LPS体外刺激直至2小时后)不能提高这些通路的信号。图7是LPS刺激的单核细胞中核糖体S6蛋白激活的动力学。S6蛋白激活的峰值 在其他MAPK通路蛋白峰值后出现。图8是由ERK抑制剂(U0126)或PII抑制剂(Ly940(^)或两者一同抑制LPS对 S6的激活。仅当两个通路都被抑制时，核糖体S6蛋白的才会被完全抑制。核糖体S6的抑 制只在ERK通路(本处使用U0126)和PII > Akt通路(本处使用Ly2940(^)都被抑制时 才能实现。两种抑制剂同时存在时，核糖体S6的完全抑制提供了 PI3K被抑制的补充证据。图9是正常样品(未预先暴露于LPS)中，LPS引发了 ERKMAP激酶的快速激活，其 特征为一个早的峰值(添加LPS后1-4分钟)、P-ERK的降低、和一个LPS刺激后10-15分 钟出现的第二峰值。P-ERK的第二峰值的出现时间与P-p38和P-SAPK水平达到最高值的时 间相同。图10显示了一旦再次暴露于LPS，LPS再次刺激后，P-ERK的平均荧光强度(MFI) 相对于起始时间(0分钟)对照直至90分钟的期间都未出现显著改变。图11，左上显示来自正常供体的未受刺激全血样品中测得约有10-15%的表达 P-P38的单核细胞(⑶14+)。在初步LPS刺激后，整个单核细胞群体( 100%)显示了 MFI 的显著提高，应答在LPS刺激15分钟后达到最大MFI值。即使在120分钟后，P_p38的水 平仍未回到基线，显示为图11左下图的双峰分布。再次暴露于LPS后，P-p38阳性单核细 胞的百分比从40% (0分钟，左下图)增至46% (再次LPS暴露15分钟后，右下图)。MFI 总值则从0分钟时的5. 0(左下图)增至再次暴露于LPS15分钟后的5. 5 (右下图)。图12，左上图显示，在正常个体中，未受刺激的单核细胞中P-S6水平低，约有10%的单核细胞显示了不同种类的、正的P-S6表达水平。LPS刺激15-60分钟后，P-S6的水平 达到峰值，与其下游于P-ERK激活的二次激活相一致。与P-ERK和P-p38不同，P-S6的水 平在LPS刺激后持续超过120分钟(图12，左下)。LPS再次刺激后，P_S6群体的MFI几乎 没有变化，且MFI呈缓慢下降，如图12右下所示。
具体实施方式
概述在一个实施方式中，本发明涉及在含有白细胞的样品中测定信号转导途径信号蛋 白的激活状态的方法。其它实施方式提供了在患者或测试样品中监控信号转导抑制剂效力 的方法。一些实施方式中，所述方法提供了一种高灵敏度的测试方法，其还可用于难以由其 获得大量细胞样品的患者群体如新生儿等。在另一个实施方式中，本发明涉及识别新的信 号转导途径蛋白抑制剂的方法。在更进一步的实施方式中，本发明涉及检测患者样品中脓 毒的方法。还提供了用于实践本发明所述方法的试剂盒。本发明的一个显著优势在于提高了特异性和灵敏度，从而允许仅使用极小的试样 量就可使用所述方法。这对于仅能获得少量患者样品的情形，例如新生儿，很重要。需要提醒的是，本说明书和所附的权利要求书中，除非上下文明确指明，各单数形 式表示的“一个”、“以及”以及“该”均涵盖相应的复数形式。尽管任何与本文所述相似或等效的方法、装置及材料均可用于实施本发明，但本 文仅描述特定的方法、装置及材料。测试样品的制备本文中术语“测试样品”和“样品”可以互换使用。本发明所述方法中的测试样 品可以包括任何含有白细胞的样品，例如全血、血浆、骨髓穿刺液(或者任何来自骨髓的细 胞)、尿液、血清、唾液、脑脊液、尿液、羊水、间质液、排泄物、粘液、机体组织提取液或细胞提 取液。某些实施方式中，样品为血样。在优选的实施方式中，血样为全血。全血可以用标准 的临床步骤从个体或试验对象获得。血样的获得包括从患者身上直接采集血样，例如由抽血医师完成。血样的获得也 包括取得先前取自病人的血样，例如实验室技术人员获得患者的血样用于采用本发明所述 方法进行分析。血浆可以由全血样品通过将抗凝血样进行而离心获得。该方法将得到底部 堆积的血红细胞层、中间的白细胞层、以及上清液血浆层。白细胞可以用各种本领域已知技术，包括浮力密度离心等，从全血样品中分离出 来。白细胞，即白血细胞，包含单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱细胞以及嗜曙红细 胞。本发明所述方法中特别优选使用单核细胞。样品可以采自人类对象或者具有商业意义的哺乳动物，包括但不局限于猴、牛或 者马。样品也可以采自家常宠物，包括，但不局限于狗或者猫。在一些实施方式中，样品取自“未实验患者”。“未实验患者”是指未经过信号转导 途径蛋白抑制剂治疗的患者。在某些实施方式中，样品来自“年龄匹配的”对照的未实验患 者。“年龄匹配”是指样品来自年龄相仿的未实验患者。在某些实施方式中，年龄匹配的样 品来自年龄、性别和人种相似的个体。在一些实施方式中，年龄匹配的来自正常个体的白细 胞被用作阴性对照以便比较信号转导途径的蛋白活性。在一些实施方式中，样品经过抗凝血剂处理。抗凝血剂的例子包括，但不局限于 维生素K抑制剂如杀鼠灵、EDTA (乙二胺四乙酸)、A⑶(酸性枸橼酸盐葡萄糖)、肝磷脂以及 1，3-茚满二酮。信号转导途径的活化此处所用术语“可激活的信号转导途径蛋白”或者其语义等效表达，均是指一种具有至少一个同工型(及某些情况下有两个或更多同工型)的蛋白质，所述同工型与该蛋白 质的一个特定构型相对应，具备特定的生物的、生化的、或者物理的属性例如酶活性、修饰 (如转录后修饰)或构象。对于特定的生物活性、修饰或者构象，该可激活化的蛋白质可以 是被激活的或者未激活的(即未经激活)。具体来讲，可激活的信号转导途径蛋白的激活 或者活化型具有特定的生物活性、修饰或者构象，而可激活信号转导途径蛋白的未激活的 或非活性的(无活性)构型并不具有(或具有较少或较低水平的)所述特定的生物活性、 修饰或者构象。在一些实施方式中，可以有多于一个同工型与活性或者激活状态相关联；例 如，可以有一个同工型与可供底物结合的“开放式”构象相关，第二个过渡状态的同工型，以 及一个缺乏活性的同工型(如活性被抑制)。在一个特定的实施方式中，可激活信号转导途径蛋白的生物的、生化的、或者物理 的性质(如酶学活性、修饰或构象)可被激活剂或者细胞信号发生所诱导或者激活。激活 剂的例子包括但不局限于激酶、磷酸酶、蛋白酶(如胱天蛋白酶)、以及激素。细胞信号发 生的例子包括，但不局限于受体群集、或者与关联分子或配体相结合。此处所用的术语“同工型”是指可激活蛋白质的一种形式，其具有一种特异的、以 及优选是可检测的生物活性、修饰、或者构象。该同工型可以是可激活受体的一种激活的 (或者活性)形式，或者是未激活的(或非活性的)形式。如前所述，在某些实施方式中，激 活态特异性捕捉分子(例如抗体)与可激活受体元件的相应同工型的结合是该可激活受体 元件的识别、以及该可激活受体元件的激活状态的指示。在一个特定的实施方式中，本发明 提供了用于确定受体元件同工型分布型的方法，该分布型包括测定可激活受体元件的激活 的同工型(或活性同工型)的存在。在特定的实施方式中，可激活受体元件的激活的同工型或活化状态是该可激活受 体的一种形式，其具有该可激活受体的其它至少一个同工型所不具备的特定的或者特异性 的生物的、生化的、或者物理的性质。这些性质的例子包括但不局限于酶学活性(如激酶 活性和蛋白酶活性)和受体元件结合活性。因此，这些特定的或者特异性的性质或活性与 可激活受体的激活同工型相关联。这样的性质或活性有时在此是指激活态活性。激活态活性的实例是被激活受体元件的激酶活性。此处所述术语“具有蛋白激 酶活性的信号转导途径蛋白”是指一种信号转导途径蛋白，其能在被激活时催化氨基酸或 其具有羧基的衍生物的磷酸化。优选的激酶是那些能催化丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸残基 磷酸化的激酶。能通过提供一种可被激酶磷酸化的底物、一种可被激酶利用的磷酸酯源，并 测定激酶存在下的底物磷酸化来测定激酶的活性。可激活受体元件的激活同工型的抗原性可区别于该可激活受体元件未激活同工 型的抗原性、或者可区别于不同激活态的同工型的抗原性。在一个特定的实施方式中，受体 元件的激活同工型所具有的表位是该受体元件的未激活同工型所缺少的，或反之亦然。在 另一个实施方式中，这一区别是由于受体元件上共价添加的部分，例如磷酸酯基团；或者是 由于受体元件的结构变化，例如通过蛋白裂解；或是由于受体元件因其它原因导致的构型 变化，该变化以抗原性不同的方式造成所述元件出现同样的序列。在另一个实施方式中，这 样的构型改变可引起受体元件的激活同工型呈递至少一个在未激活同工型中不存在的表 位，或者不呈递至少一个在未激活(即，非活化的)同工型中存在的表位。在一些实施方式 中，供捕捉分子结合的表位集中在受体元件活性位点周围，尽管如本领域所知，受体元件一个区域的构型变化同样会导致该元件不同区域的变化。在某些实施方式中，所述信号转导途径为促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，该 信号转导途径在对胞外信号的应答中可影响基因调节，并控制细胞增殖以及分化。该通路 还涉及卵母细胞减数分裂的成熟。MAPK通路在例如蛙和哺乳动物如小鼠、大鼠和人类等中 被发现。该通路可以被细胞因子例如白介素-I(IL-I)和肿瘤坏死因子(TNF)激活，并可被 如Mos、Raf, Ras,以及V12HaRas等蛋白质组成型地激活。在其它实施方式中，所述信号转导途径是PII通路。PII通路为磷脂酰肌醇3-激 酶通路，其介导并调节细胞程序性死亡。PII通路还介导包括增殖、生长、分化、运动性、血 管再生、有丝分裂发生、转化、存活力、以及衰老等在内的细胞代谢过程。可介导PII通路 的细胞因子包括PI3K、Akt和BAD。这些因子介导并调节细胞程序死亡。PII因子包括I 型PII--—种包括p85和pllO的胞内酶(cytostolic enzyme)复合体。BAD已被鉴定为 bcl-2家族中的促细胞程序死亡的一员。核糖体蛋白S6(RPS6)属于核糖体蛋白族S6E，它参与经选择性翻译对细胞生长以 及增殖的控制(Molina H. et al. ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 :2199-2204, (2007)) ^t 真核细胞核糖体中，它是核糖体蛋白S6激酶的主要底物。在翻译期间，它调节任何含有5' 末端寡嘧啶序列(5‘ TOP)的RNA的翻译。5' TOP编码细胞周期行进的相关蛋白、核醣体 蛋白以及延伸因子。RPS6的磷酸化与选择性5' TOP翻译的增强有关。RPS6的主要磷酸化 位点包括丝氨酸 235、236、240、以及 244 (Peterson，R. T. and Schreiber，S. L. , 1998) RPS6 的磷酸化受生长因子、肿瘤助长剂、以及促分裂原所刺激。在生长阻滞期间，RPS6被脱磷酸 化。在某些实施方式中，所述信号转导途径蛋白为PII核醣体S6蛋白、p44/42MAP激 酶、TYK2、p38MAP 激酶、PKC、PKA、SAPK, ELK、JNK、cjun、RAS, Raf、MEK 1/2、MEK 3/6、MEK 4/7、ZAP-70、LAT、SRC、LCK、ERK 1/2、Rskl、PYK2、SYK、PDK1、GSK3、FKHR、AFX、PLCg、PLCy、 FAK、CREB、α ΠΙ β 3、Fc ε RI、BAD、p70S6K、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5、STAT6 或上述蛋白 的组合。在特定的实施方式中，信号转导途径蛋白为P38和ERK和PDK或核糖体S6。其它 实施方式中的信号转导途径蛋白为p38、ERK、和核糖体S6。JNK和核糖体S6提供了适用本 发明所述方法的其它信号转导途径蛋白。在某些实施方式中，所述样品与泛激酶激活剂一起孵育。在某些实施方式中，所述 泛激酶激活剂为脂多糖(LPQ。术语“LPS”应当理解为包括各种天然产生的以及人工合成 或者半合成制得的变体。LPS由一个脂质部分脂质A和一个共价结合于膜结构域的多糖单位组成。多糖区 域由末端的0-特异性链、一种包含最多可达50个重复寡糖单位的通常为两个到八个单体 的亚结构、和与脂质A相连接的核心区域组成。0-特异性链的特征在于它在不同种类中巨大的结构可变性。如下所述，脂质A组 分负责下文所述的LPS的生物活性。所述生物活性由脂质A的不同酰基化模式变化来调 控。该活性的范围包括由诸如多数天然产生的LPS变体(如弗里德奥沙门氏菌和马流产沙 门氏菌)可引起的激动效应，直至植物共生微生物或者合成衍生的LPS变体所引起的拮抗 作用(C. Alexander and Ε. Τ. Rietschel，Biospektrum, Vol. 4，No. 5，pp. 275—281，1999)。
LPSffiese, K. Brandenburg, U. Seydel, and S. Muller-Leoennies The Dual Role of Lipopolysaccharide as Effector and Target Molecule. Biol. Chem.， 380，pp. 767-784 中读到。脂多糖由革兰氏阴性细菌所产生，是先天免疫的高效激活剂。它们与人类单核细 胞上的toll样受体4(TLR4)/CD14受体结合并诱发如TNFa、MIF、IL-I β、IL-6、IL-8、 IL-12、IL-15和IL-18等促炎症细胞因子、各种集落刺激因子、各种脂质介体的产生和分 泌，并使氧减少。脂多糖还通过这些机理激活非特异性免疫应答，作为这样的应答的结果是，可以 更好地消除微生物、病毒和癌细胞。被LPS诱导的细胞因子和脂质介体产生会导致发炎、发 热和脓毒等现象。由于LPS在脓毒中的毒性效应，激动性LPS被称为内毒素。在另一些实施方式中，泛激酶激活剂为TLR4激活剂。本发明可使用其它表面酪氨 酸激酶受体激活剂来刺激单核细胞中的其它通路，例如用GM-CSF激活外周血单核细胞中 的JAK/STAT通路，或用激动剂比如IL-4来激活外周血淋巴细胞中的JAK/STAT通路。各样品制备中的最适孵育时间和温度可采用常规的实验来确定。在至少一个实施 方式中，泛激酶激活剂进行的激活持续1-10分钟。在此期间中，可以监测信号转导途径信 号蛋白的早期活化。例如，如下面所举例的那样，ERK的激活在暴露于泛激酶激活剂2分钟 内就可以测得。其它信号转导途径信号蛋白的激活在暴露于泛激酶激活剂15分钟内达到 饱和。在另一些实施方式中，泛激酶激活剂的活化进行得超过30分钟。在此期间中，可 以监测信号转导途径信号蛋白的后期活化。例如，如下面所举例的那样，核糖体S6的信号 有时在暴露于泛激酶激活剂30分钟后开始达到峰值。保存及解掩蔽方法在一个实施方式中，本发明提供了一种制备用于测定蛋白表位的生物样品的方 法，该方法保存胞内蛋白质表位以供后续检测。所述方法包括保存(固定)步骤，包括将 所述样品与用量使终浓度足以使蛋白质、脂质和核酸分子形成交联的保存剂(固定剂)接 触；清洗步骤，包括向所述生物样品中添加用量使终浓度足以溶解样品中所含任何红细胞、 并使白细胞透化的清洁剂；和标记步骤，将所述样品和对一个或多个表位特异的可检测的 结合剂接触。具体的方法在参考文献，待授权的美国专利申请U. S. Appl. No. 10/928，570中 有详述。应当理解，如果所述样品中不含有红细胞，即样品已经过预分级化，那么溶解步骤 就是不必要的。在一个实施方式中，本发明提供了一种制备用于测定蛋白表位的生物样品的方 法，该方法可保存信号转导途径蛋白质表位以供后续检测。所述方法包括一个保存(固定) 步骤，包括将所述样品与用量使终浓度足以使蛋白质、脂质和核酸分子形成交联的保存剂 (固定剂)接触。所述保存剂(固定剂)的浓度可以为约0.1%到20%、约0.5%到15%、 约到10%、约到8%、约到4%、约到2%。所述保存剂(固定剂)可以以浓 缩液或稀释溶液的形式加入从而达到所需的浓度。所述保存剂(固定剂)可以是任何使用 者所需的合适试剂，例如乙醛、甲醛、或者多聚甲醛、或者福尔马林。本发明所述用于保存胞内蛋白质表位以供后续检测的制备用于测定蛋白表位的 生物样品的方法还包括一个清洗步骤，其中向所述样品中添加用量使终浓度足以溶解样 品存在中的任何红细胞、并使白细胞透化的清洁剂。使用者可以根据各种条件来选择清洁剂的浓度，所述清洁剂的浓度可以为约0. 到^^、约化丨^到一^^约化丨^到？^^约 0. 1%到6%、约0. 1%到5%、约0. 1%到4%、约0. 1%到3%、约1%到2%、约0. 到 1%。所述清洁剂可以根据各种因素来选用，可以是离子型或者非离子型的清洁剂。清 洁剂优选非离子型的清洁剂。目前一种优选的清洁剂为乙氧化辛基酚，商品名为Triton X-100 (Sigma T^84)。在优选的实施方式中，所述方法使用Triton X-100。适用于本发 明方法的清洁剂能透化细胞并保留表面表位的完整性。可用于本发明的离子型清洁剂进 一步包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，商品名Ig印al CA-630(Sigma-N-6507)或Nonidet P-40 (NP-40) (Sigma)、Bri j_58、以及线性醇烷氧基化物，商品名为 Plurafac A_38 (BASF 公 司)或 Plurafac A-39 (BASF 公司)。在复合的细胞群体例如未稀释的外周血、骨髓穿刺液、以及腹膜液中，经过一个步 骤来通过表面标记物区分细胞子集并检测胞内磷酸-表位染色是有用的。本发明提供的制 备用于保存胞内蛋白质表位以供后续检测的用于测定蛋白表位的含红细胞的生物样品的 方法，可以胜任将胞内表位检测与细胞表面表位检测进行结合。本发明提供的方法中，胞内 和胞外的表位都能保持完整，从而允许后续流式细胞分析进行测量。例如，用典型的单核细 胞标记物包括，如CD14，进行的表面测定可与胞内表位测定相结合。在进一步的实施方式中，所述方法还包括进一步的醇处理步骤，该步骤包括将生 物样品与足量醇接触，醇的最终浓度达到足以将固定步骤中因为交联而消失的细胞表位解 掩蔽。正如此处所述，醇处理步骤可以保留大部分的胞外表位，使用者可以根据需要保留的 表位来调整孵育的时长、温度和浓度。所述醇的终浓度还可根据其它变量，包括，例如孵育时间、温度、以及解掩蔽和测 定的特定目标表位等，来进行选择。所述醇的终浓度可以为约25%到75%、约30%到70%、 约35 %到65 %、约40 %到60 %、约45 %到55 %。所述醇可以进一步从乙醇和甲醇中选择。 如果需要，可以用丙酮替代醇处理步骤中的醇。样品与醇或者丙酮接触的温度可以是，例如 约-30 V、约-20°C、约-10°C、约-5°C、约0°C、约4°C、约6°C、约8°C、或者任何其它有助于 胞内表位解掩蔽并且不降低细胞表面表位反应性的温度。捕捉分子及本发明中的其它试剂本发明的一个实施方式中，信号转导途径蛋白被激活以便放大信号。信号转导途 径蛋白的水平通常用捕捉分子来测定。在此所用的术语“捕捉分子”是指任何能在适当条 件下与本发明的信号转导途径蛋白结合的分子或者分子复合物。因而，一种捕捉分子，包括 任何分子，如蛋白质、小分子有机物、碳水化合物(包含多糖)、多聚核苷酸、脂质等。这些条 件的选择、以及对结合条件的改动或调整都是公知的。例如，众所周知，温度、PH和孵育时 间都对结合有影响。通常，结合具有高度特异性，排除了大量与多于一个配体的显著结合。 本发明的一些实施方式中，捕捉分子是抗体或者配体结合片段或者其类似物。捕捉分子也 可以是在实践本发明特定实施方式中能与信号转导途径蛋白相结合的其它蛋白质或者核 酸或者其类似物。在优选的实施例中，捕捉分子是抗体，特别是单克隆抗体。在此所用术语“抗体”是 指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白(Ig)中具备免疫活性的部分。所述抗体包括但不局限 于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性多克隆抗体、抗体模拟物、嵌合体、单链、Fab、Fab\ F(ab' )2片段、Fv、以及Fab表达文库。通常，由人体获得的抗体分子属于IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD中的任意一个，这些分类之间的区别在于分子中重链的不同。一些类别还具有亚类，例如IgGl、IgG2等等。此外，人类中的轻链可以是κ链或者是λ链。在此所述抗体包 含上述各种类别、亚类和类型的抗体。研究已经发现，抗体的片段能实现与抗原结合的功能。此处所述术语“抗原结合片 段”包括但不局限于⑴由Vl、VH、Cl和Cm结构域组成的Fab片段；(ii)由Vh和Cm结构 域组成的Fd片段；(iii)由八和Vh结构域组成的Fv片段；(iv) 结构域组成的dAb片 段；(ν)单独的CDR区域；(vi)F(ab' )2片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中一个Vh结构 域和一个\结构域通过肽交联剂交联在一起，使这两个结构域联结形成一个抗原结合位点 (Bird et al，Science 242:423-426(1988) ；Huston et al,Proc. Natl. Acad. ScL USA 55: 5879-5883(1988)) ； (viii)双特异性 Fv 二聚物(PCT/US92/09965)；以及(ix)通过基因融 合构建的双链抗体、多价或者多特异性片段(W094/13804 ;P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90 :6444_6448(1993))。本发明所述捕捉分子可以包含荧光标记。术语“荧光标记，，是指一种可以被直接 (即一级标记)或者间接(即二级标记)测得的分子，例如标记可以是被目测和/或检测或 用其它方式识别其存在或者缺失的分子。化合物可以直接或者间接地与标记形成共轭，该 标记能发出可检测信号，例如荧光剂、酶、抗体、磁性粒子等微粒、化学荧光剂、或特异性结 合分子等等。特异性结合分子包括配对分子，如生物素与链霉亲和素、地高辛与抗地高辛等 等。标记物包括但不局限于荧光标记和酶。 通常，标记物可以是发色或者荧光的染料或者部分及其结合伴侣。标记物也可以 包括酶(辣根过氧化物酶等)和磁性粒子。在某些实施方式中，检测标记为一级标记。一 级标记是指能被直接检测的标记，例如荧光团。在某些实施方式中，标记物可以包括发色团或者磷光体，但优选荧光染料或者部 分。荧光团可以是小分子荧光体或者类蛋白荧光体。荧光标记是指任何可以通过其固有的荧光特性被检测的分子。合适的荧光标记 包括但不局限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀 绿、芪、萤黄、Cascade Blue 、德州红、IAEDANS, EDANS, BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5. 5、LC Red 705以及俄勒R绿。合适的光学染料在本文所引用的Richard P. Haugland著 的1996年的《分子探针手册》中有详述。合适的荧光标记还包括但不局限于绿色荧光蛋白 (GFP ；Chalfie et al, Science 263(5148) :802_805(1994)；和 EGFP ;Clontech_Genbank Accession Number U55762)、蓝色焚光蛋白(BFP ； 1. Quantum Biotechnologies, Inc. 加拿大魁北克；2. Stauber, R. H. Biotechniques 24 (3) :462_471 (1998) ；3. Heim, R. and Tsien, R. Y. Curr. Biol. 6 178-182 (1996))、增强型黄色荧光蛋白(EYFP ；1. Clontech Laboratories, Inc.,美国力口 州)、荧光素酶(Ichiki et al.，J. Immunol. 150(12) 5408-5417(1993))、0-半乳糖苷酶(Nolan et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85(8) 2603-2607(1988))和 Renilla(WC) 92/15673 ；WO 95/07463 ；WO 98/14605 ；WO 98/26277 ； WO 99/49019 ；U. S. Pat. No. 5，292，658 ；U. S. Pat. No. 5，418，155 ；U. S. Pat. No. 5，683，888 ； U. S. Pat. No. 5，741，668 ；U. S. Pat. No. 5，777，079 ；U. S. Pat. No. 5，804，387 ；U. S. Pat. No. 5，874，304 ；U. S. Pat. No. 5，876，995 ；and U. S. Pat. No. 5，925，558)。所有上述参考文献 被引用到本文作为参考。
本发明可用的附加标记包括=Alexa-Fluor系列染料(Alexa Fluor 350，AlexaFluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633,Alexa Fluor 660,Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow> R-藻红蛋白(PE) (Molecular Probes，美国俄勒冈)FITC、罗丹明、德州红(Pierce，美国伊 利诺伊)、Cy5、Cy5. 5、Cy7(Amersham Life Science，美国宾夕法尼亚)。Cy5PE、Cy5. 5PE、 Cy7PE、Cy5. 5APC、Cy7APC的串联共轭方法为本领域已知技术。荧光探针共轭的定量可以由 标记程度来评估，并且包括染料光谱特性的方法是本领域已知的。在另一种实施方式中，荧光标记为GFP，并且在至少一些实施方式中使用的是海 笔、海鳃或发光水母的GFP。在某些实施方式中，使用了二级检测标记。二级标记是指可以间接检测的标记，例 如二级标记可以与可供检测的一级标记结合或者反应、可以作用于其它产物以产生一级标 记(如酶)、等等。二级标记包括但不局限于结合伴侣配对中的一个；可化学修饰的部 分；核酸酶抑制剂，酶比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、荧光素酶等等。在特定的实施方式中，所述二级标记是结合伴侣配对。例如标记可以是能与其结 合伴侣结合的半抗原或者抗原。例如，合适的结合伴侣配对包括但不局限于抗原(诸如蛋 白质(包括肽)和小分子)与抗体(包括其片段(Fabs、等等)；蛋白质与小分子，包括生物 素/链霉亲和素；酶与底物或者抑制剂；其它蛋白质-蛋白质相互作用对；受体-配体；以 及碳水化合物与其结合伴侣。核酸-核酸结合蛋白也可使用。合适的结合伴侣配对包括但 不局限于生物素(或亚氨基生物素)与链霉亲和素、地高辛与其抗体、以及Prolinx 试 剂。在特定的实施方式中，结合伴侣配对包括抗原和将会与该抗原特异性结合的抗 体。所述“特异性结合”是指伴侣间结合的特异性足够将配体与系统内其它组分或杂质的结 合区分开来。结合性必须足以在测试方法的条件下保持伴侣间的结合，所述测试条件包括 清洗步骤以除去非特异性结合。在一些实施方式中，该配对的解离常数应低至10_4至KT6M4 以下，优选低至10_5至IO-9M-1以下，更优选低至10_7至IO-9M-1以下。在特定的实施方式中，所述二级标记是可化学修饰的部分。该实施方式中，包含 反应活性官能团的标记物与待标记的分子结合。所述官能团可以随后用一级标记进行标 记(如实验前或者实验后)。合适的官能团包括但不局限于氨基、羧基、马来酰亚胺基、 桥氧基、硫醇基，其中尤为优选氨基和硫醇基。例如，含有氨基的一级标记可以与含有氨基 的二级标记相连，比如通过使用本领域已知的连接剂如公知的同功或异功的双功能连接剂 (参见 1994 Pierce Chemical Company catalog,technical section on cross-linkers, pages 155-200，并入本文作为参考)。在某些实施方式中，本发明所述捕捉分子使用了多个荧光标记，在优选的实施方 式中，使用至少两个同一荧光共振能量转移(FRET)配对中的荧光标记。
FRET是本领域已知的现象，其中一个荧光染料的激活可以不发射光子而转移到另 一个荧光染料。FRET配对由供体荧光团和受体荧光团组成。供体的荧光发射光谱与受体的 荧光吸收光谱必须有重叠，且两个分子必须紧密靠近。使得50%的供体钝化(将能量转移 至受体)时供体与受体间的距离被定义为Forster半径(Ro)，其代表性数值为10-100入。 含有FRET配对的荧光发射光谱的变化可以被检测到，指示紧密靠近(即相互距离在100 A 以内)的配对的数量变化。这是两个分子相互结合或者解离的代表性结果，其中一个标记有FRET供体，另一个标记有FRET受体，其中这样的结合将FRET配对紧密靠近。这样的分 子间结合会导致受体的荧光发射强度增加或者供体荧光发色的猝灭。本发明可用的FRET配对(供体/受体)包括但不局限于EDANS/荧光素、 IAEDANS/荧光素、荧光素/四甲基罗丹明、荧光素/LC Red 640、荧光素/Cy 5、荧光素/Cy 5. 5以及荧光素LC Red 705.在FRET的另一方面，可以使用荧光供体分子和非荧光的受体分子(猝灭剂)。这 一应用中，当猝灭剂移离供体附近时供体的荧光发射会增强，而当猝灭剂靠近供体附近时 则供体的荧光发射会减弱。可用的猝灭剂包括但不局限于TAMRA、DABCYL、QSY 7、以及QSY 33。可用的供体/猝灭剂包括但不局限于EDANS/DABCYL、德州红/DABCYL、BODIPY/DABCYL、 萤黄/DABCYL、香豆素/DABCYL、以及荧光素/QSY 7染料。利用FRET和荧光猝灭可以实时监测标记分子间的结合，提供关于结合反应时间 过程的连续信息。FRET程度的变化可以由供体和受体部分的荧光量的比例的变化函数来确定，这个 过程叫做“定比例”。底物绝对量的变化、激活强度、以及样品在激发波长下的浊度或其它背 景吸收对供体和受体的荧光强度有相似的影响。因此，相，两个发射强度之间的比例是比两 者中任何一个的单独强度更可靠和优选的测试参数。此处描述的比例法荧光报告系统与现有的蛋白质结合方法相比具有显著的优势， 因为其允许实现对表达性或者非表达性的单个活细胞进行高灵敏度的检测和分离。在特定 的实施方式中，测试系统使用易于加样并截留于胞内的无毒性、非极性的荧光底物。同类蛋 白质对荧光底物的修饰因为底物转化成产物而产生荧光发射漂移。由于报告分子以比例方 式读�。龇椒ㄔ诟髦直ǜ娴鞍撞馐苑ㄖ芯哂卸捞匦裕愿髦直淞咳缃氲ジ鱿赴牡� 物加样量等，有控制。这一稳定的、易于检测的、胞内的读取消除了在进行表达分析前建立 克隆细胞系的需要。该系统和其它类似的流式分类系统可用于从有上百万个细胞的细胞池 中分离出携带特定受体元件簇和/或激活特性的细胞。可以采用标准步骤(drmr. com. abcon)或使用Molecular Probes公司(美国俄勒 冈)的蛋白-蛋白/蛋白-染料交联试剂盒来进行抗体结合。标记部分与检测分子例如抗 体的共轭是免疫分析技术中的标准操作步骤。参见，例如，0' Sullivan等1981年发表在 Langone 和 Van Vunakis 编辑的 Methods in Enzymology 第 73 卷 147-166 页的〃用于酶免 疫测试的酶-抗体共轭物的制备方法〃(Academic Press,New York，N. Y.)。标记部分可用 传统方法与蛋白质或者多肽结合。例如，偶联剂二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺、双_酰亚胺、 双重氮联苯胺、及类似物质等可用于将上述荧光、化学发光以及酶标记物标记到抗体上。参 见，例如，U. S. Pat. No. 3，940, 475 (荧光计)和 U. S. Pat. No. 3，645，090 (酶法)；Hunter 等 人，Nature，144 945(1962) ；David 等人，Biochemistry，13 1014-1021 (1974) ；Pain 等人， J. Immunol Methods, 40 :219_230 (1981)；以及 Nygren J. , Histochem. and Cytochem. ,30 407-412 (1982)。荧光或者化学发光标记可用来提高放大和灵敏度至5-10pg/ml，甚至更好。在本发明实施方式中，捕捉 分子是激活特异性的。本发明所述方法和组分可用于 检测样品中任何特定的受体元件同工型，所述同工型可被抗原性检出或者与其它同工型进 行抗原性区分。例如，如本发明举例说明并描述的那样(参见，例如，实施例)。本发明所述 激活态特异性捕捉分子可用于本发明的方法，来识别复合细胞群体内子集或者亚群的不同的 信号级联、以及在潜在的信号层级中蛋白激活(例如激酶激活)的顺序。进一步地，在本 发明的方法中，流式细胞术，特别是多色流式细胞术的使用允许实现单个细胞内信号通路 的多维度分析和功能评估。此处所用术语“激活态特异性捕捉分子”或“激活态分子”或它们的语义等效表达 是指可特异性地与相应的特定抗原结合的捕捉分子(即抗体)。在某些实施方式中，相应的 特定抗原是可激活受体元件的特定同工型。另外，优选的，激活态特异性抗体的结合指示了 特定可激活受体元件的特定激活态。在某些实施方式中，激活态特异性捕捉分子与相应的可激活受体元件的同工型的 结合指示了可激活受体元件的识别以及该可激活受体元件的激活状态。在特定的实施方式中，激活态特异性捕捉分子是含有可与可激活受体元件上目标 结构相结合的识别结构的肽。多种识别结构在本领域是公知的，并可采用本领域已知方 法制成，包括噬菌体展示文库(参见，如Gururaja et al.，Chem. Biol. (2000) 7 515-27 ； Houimel et al. , Eur. J. Immunol. (2001)31 :3535_45 ；Cochran et al. , J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 625-32 ；Houimel et al.，Int. J. Cancer (2001) 92 :748_55，均并入本文作为参 考)。在特定的实施方式中，所述激活态特异性捕捉分子包含下述识别结构SKVILFE-随机 肽环-SKVILFE。具有这样的识别结构的捕捉分子可以高亲和性地与特定目标结构结合。进 一步的，本发明的方法中使用的捕捉分子可以附接有荧光团。多种识别结构在本领域是公知的(例如Cochran et al.，J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 625-32 ；Boer et al.，Blood (2002) 100 :467_73，均并入本文作为参考)，并可 采用本领域已知方法制成(参见，如:Boer et al. ,Blood(2002) 100 467-73 ；Gualillo et al.，MoI. Cell. Endocrinol. (2002) 190 :83_9，均并入本文作为参考)，包括例如用组合化 学方法生产对可激活蛋白上目标结构具有亲和性的识别结构比如聚合物(参见，如=Barn et al.，J. Comb. Chem. (2001)3 :534_41 Ju et al.，Biotechnol. (1999)64 :232_9，均并入 本文作为参考)。在另一实施方式中，激活态特异性捕捉分子是一种蛋白质，它只和特定的 可激活受体元件的磷酸化同工型结合，而不结合该可激活受体元件的未磷酸化或者非磷酸 化的同工型。在另一实施方式中，激活态特异性捕捉分子是一种蛋白质，它只和可激活受体 元件的胞内同工型结合，而不结合胞外同工型，或者与此相反。抗体中，有很多市售的产品能特异性结合一个蛋白质的磷酸化同工型、但不和该 蛋白未磷酸化的同工型结合。为了研究能可逆地被磷酸化的信号转导蛋白，生产了很多 此类抗体。尤其是，生产出的很多此类能够特异性与蛋白激酶的磷酸化、激活的同工型结 合的抗体，此处有时称之为激酶激活态抗体或者其语义等效表达。在某些实施方式中， 本发明所使用的抗体包括抗下列物质的抗体磷酸-P44/42 MAP激酶(Thr202/Tyr204)、 磷酸-TYK2 (Tyrl054/1055)、磷酸-p38 MAP 激酶(Thrl80/Tyrl82)、磷酸 PKC-PAN-底 物、磷酸-PKA-底物、磷酸-SAPK/JNK(Thrl83/Tyrl85)、磷酸-酪氨酸(P-tyr-100)、 p44/42 MAPK、磷酸-MEKl/2(Ser217/221)、磷酸-p90RSK(Ser381)、p38 MAPK、JNK/SAPK、磷 酸-Rafl (Ser259)、磷酸 Elk-1 (Ser383)、磷酸-CREB(Serl33)、磷酸-SEK1/MKK4(Thr261)、 磷酸-Jun (Ser 63)、磷酸-MKK3/MKK6 (Ser 189/207)、AKT、磷酸-FKHR、FKHR、磷酸 _Gsk3 alp21、pAFX、PARP、BAD、BADser 112、BADser 136、磷酸-BADser 155、p27、p21、cFLIP、抗 MYC、p53、NFKB, Ikka，、Ikk^、磷酸-酪氨酸和磷酸-苏氨酸组合。在本发明的某些实施方式中，这些抗体为单克隆抗体。在某些实施方式中，这些抗体被组合使用。本发明中也可以使用非激活态的捕捉分子，即对照捕捉分子。在特定的实施方式 中，非激活态的捕捉分子和信号转导途径蛋白的激活态与未激活态形式的表位都能结合。 这样的捕捉分子可以用来测定样品中未激活态和激活态的信号转导途径蛋白的总量。在另 一实施方式中，非激活态捕捉分子可结合呈现于受体的未激活态形式、但在信号转导途径 蛋白激活态形式中消失的表位。这样的捕捉分子可用来测定样品中未激活态受体的数量。 这两类非激活态受体都能用于测定，例如来自经候选的生物活性试剂处理前后样品的激活 态受体数量的变化，是否与未激活态受体数量的变化相一致。例如，此类捕捉分子可用于测 定信号转导途径蛋白的激活的增强是否是由于信号转导途径蛋白的未激活态被激活、或是 由于蛋白质表达的提高、或是两者都有。在另一个实施方式中，对照捕捉分子与可激活细胞 的不受信号转导途径激活影响的表位结合。此处引为参考的待授权的美国专利申请U. S. Appl. No. 11/276，948进一步举例说 明了对照捕捉分子的用途。优选的，对照捕捉分子可结合到激活态特异性捕捉分子所结合 的同一细胞上，尽管表位未被泛激酶激活剂激活。因此，例如在本发明的某些实施方式中， 泛激酶激活剂可激活单核细胞上的信号转导途径。激活态特异性抗体可检测单核细胞中信 号通路的激活。CD14对所述泛激酶激活剂无响应，因而可以用作对照捕捉分子的靶标。因 此，所述测试方法可以检测样品中的单核细胞，以及其中哪些已被激活。应当理解，至少在 某些实施方式中，对照捕捉分子可以和不同的细胞结合。因此，举例来说，在监测单核细胞 激活时，抗淋巴细胞特异性捕捉分子可以用作捕捉分子。在多数实施方式中，对照捕捉分子和激活态特异性捕捉分子可被加入到“相同试 管”中。所述“相同试管”应当理解为它是同一个反应容器，所述容器可以是试管、或微孔板 的加样孔或相似容器。因此，对照捕捉分子和传统的同型对照不同，它提供了测试细胞更为 真实的基线荧光评估。例如，在所测细胞为单核细胞的那些实施方式中，对照捕捉分子可以 与CD14结合，后者是不受激活影响的单核细胞标记。这样就允许进行单核细胞群体荧光的 基线设定。当那些细胞被激活后，荧光发生变化，变化的程度因而是对荧光的增强更为真实 的测量。因此，这些对照的使用提供了一个更好的减少所测细胞的背景荧光的方法。由于 蛋白质的磷酸化状态过去难以识别，定量更无从谈起，因此对背景的控制对于本发明所述 方法整体的灵敏度很重要。因此，至少在一个实施方式中，本发明观察到的荧光强度的位移通常为平均荧光 强度增强10倍甚至更高。在其它实施方式中，荧光强度的位移为荧光强度增强20倍或更 高、30倍或更高、甚至50至100倍或更高。免疫分析使用捕捉分子和荧光标记来对捕捉分子进行定量的分析系统是公知的。可用于本 发明的免疫分析方法的例子，包括但不局限于，荧光发光分析(FLA)、化学发光分析(CA)、 酶联免疫吸光分析(ELISA)以及类似技术。参见，例如Blackwell于1996年出版Johnstone 和Thorpe著的《实用免疫化学》第三版(Blackwell Publishing，美国马萨诸塞)；Ausbul 等人2003年编著的《分子生物学通用方案》(Wiley & Sons，美国新泽西)；Ghindilis等人 2003年编著的《免疫分析方法与方案》(Blackwell Publishing，美国马萨诸塞)以及美国 专利公开号20030044865。免疫分析可以是固相分析、液相分析、以及相似情形。 在实施方式中，免疫分析可以设计为自动的、高通量的仪器。例如贝克曼考尔特公司(Beckman Coulter, Inc.)的Access 系列仪器是公知的适用于实现本发明所述方法。 Access 免疫分析系统可通过使用反应管加样器实现多达每小时100个样品的高通量分 析，可达到连续3小时样品的处理。
在特定的实施方式中，使用流式细胞术来检测荧光。也可以使用其它荧光检测方 法，例如Quantum dot methods (参见，例如Goldman et al. , J. Am. Chem. Soc. (2002) 124 6378-82 ；Pathak et al.，J. Am. Chem. Soc. (2001) 123 4103-4 ；以及 Remade et al.，Proc. Natl. Sci. USA(2000) 18 :553_8，均并入本文作为参考)。对于固相免疫分析，捕捉分子(例如单克隆抗体)被固定到固定支持物上。通常， 固定化可以通过在测定步骤前按如下方法通过使捕捉分子不溶化、或者此后通过免疫沉淀 来实现或者吸附于非水溶性基质或表面(U. S. Pat. No. 3，720, 760)；或非共价或者共价偶 联(例如，用戊二醛或者碳二亚胺交联，可以有或者没有对支持物的预激活，如在U. S. Pat. No. 3，645，852 或 Rotmans et al. ;J. Immunol. Methods，57 :87_98 (1983))中描述的那样使 用硝酸和还原剂)。用于固定化的固相可以是任何基本上不溶于水并可用于免疫法分析的惰性支持 物或者载体，包括例如下列形式的支持物表面、颗粒、多孔基质等等。常用的支持物例子包 括小片，SEPHADEX 凝胶，聚氯乙烯，塑料珠，由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及类似原料制成 的微孔板或者试管包括96孔板、以及特殊材料如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其它多糖。捕 捉分子也可被固定于基质上，如聚合物珠、胶体金属或者氧化铁颗粒。珠子可以是塑料、玻 璃或任何其它合适的材料，典型地在1-20微米范围内。在一些实施方式中，可使用顺磁性 珠子。胶体金属颗粒如胶体金和银颗粒以及氧化银颗�？梢杂枚嘀植煌氖惺鄯椒ɑ蛘弑� 领域技术人员所知的其它工艺来制备。可替代地，可以使用反应活性的非水溶性基质如溴化氢活化的碳水化合物和美国 专利申请号 3，969，287,3, 691，016,4, 195，128,4, 247，642,4, 229，537 及 4，330，440 中所述 的反应活性的基质来固定化捕捉分子。在一个实施方式中，固定化的捕捉分子涂布在微孔 板上。另一个实施方式中，固相是一种可以同时分析数个样品的多孔微孔板。固相用如上所述捕捉分子涂布，其可以按要求进行非共价或者共价相互作用或者 物理联接。形成附着的技术在美国专利申请号4，376，110及其参考文献中有描述。如果用 共价方式，平板或者其它固相需与交联剂和捕捉分子一起在文献中公知的条件下孵育。通常用来使捕捉分子附着于固相基质的交联剂包括，例如1，1_双(重氮乙 酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，如带有4-叠氮水杨酸的酯、同功双功能酰 亚胺酯，包括琥珀酰亚胺酯比如3，3' - 二硫代二(丙酸琥珀酰亚胺酯)、和双功能的马来 酰亚胺如二-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。衍生试剂如甲基-3-((对叠氮酚)-二硫)丙酰 亚胺可以产生可光激活的中间体，适用于光存在下形成交联。涂布后的平板通常用封闭试剂处理，封闭试剂可非特异性地与未被占用的结合位 点结合并达到饱和，从而避免游离配体与平板孔上的过多位点之间形成不想要的结合。适 用于这一目的的封闭试剂的例子包括凝胶、牛血清白蛋白、蛋清蛋白、酪蛋白和脱脂奶。封 闭处理通常在室温下进行1-4小时，代表性地为1. 5到3小时。捕捉分子的用量足够大，以得到和校准标准相比较好的信号输出，但与样品中所 关注的信号转导途径蛋白的最高期望水平相比通常不会摩尔过量。为达到充分的灵敏度，测试样品量的添加应使固定化的捕捉分子与样品适当稀释后测试样品中游离的待测分析 物的预期最大浓度相比达到摩尔过量。通常，选择样品和固定化捕捉分子的孵育条件，以使解离最小化从而使分析的灵 敏度最大化，并且确保样品中存在足够多的待测分析物，所述待测分析物可与固定化捕捉 分子结合。应当理解，最适反应条件的选择通常只需要常规的实验。孵育在基本恒定的温度 下进行，温度范围从0°c到40°C，通常为室温，或室温上下。孵育时间通常不超过10小时。 在添加了蛋白酶抑制剂以防止测试样品中的蛋白酶降解待测信号转导途径蛋白的情况下， 孵育时间可以延长。本发明的方法本发明提供了在样品中测定信号转导途径蛋白的激活状态的方法，包括使样品中 被保存的白细胞中解掩蔽的胞内表位与多个荧光标记的捕捉分子接触，所述多个荧光标记 的捕捉分子含有至少两个不同的捕捉分子，这些分子能与样品中被保存的、激活的白细胞 中至少两个不同的解掩蔽的胞内表位的激活态相结合。在该实施方式中，被捕捉分子捕捉 到的被保存的、激活的白细胞可通过用上述免疫分析方法中的一种来检测。在某些实施方 式中，荧光检测可测出结合于激活态解掩蔽胞内表位的带标记捕捉分子。被保存的白细胞 可用相似方法检出。因此 ，在某些实施方式中，免疫分析可通过对照捕捉分子的结合性来检 出被保存白细胞的荧光。当使用本发明所述方法中的荧光标记组分和本发明所述方法中的组合物时，将 会发现不同类型的荧光检测系统，例如流式细胞术系统，可用来实施本发明。在一些实施 方式中，使用流式细胞术系统或用于高通量筛选的系统，如96孔板或者更高孔数的微孔 板。进行荧光材料相关分析的方法是本领域公知的，并且在例如=Lakowicz, J.R.著的《荧 光波谱原理》(Plenum Press，美国纽约，1983) ；Herman, B.著的《共振能转移显微法》(出 自 Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Part B, Methods in Cell Biology, vol. 30, Taylor, D. L.禾口 Wang，Y. -L.编著，Academic Press，美国加利福尼亚， 1989，pp. 219-243) ；Turro, NJ.的《现代分子光化学》(Benjamin/Cummings Publishing Col, Inc.，1978，pp. 296-361)中有详述。样品中的荧光可以用荧光计测量。通常，由激发光源发出的具有第一波长的激发 光穿过激发光学装置。激发光学装置引起激发光来激发样品。作为响应，样品中的荧光蛋 白发出波长不同于激发波长的发射光。采集光学装置然后采集样品所发射的光。所述装置 可以包括温度控制器使样品在扫描过程中保持在特定温度。根据一种实施方式，多轴转换 台移动载有多个样品的微孔板，从而使不同位置的孔都能被照射到。多轴转换台、温度控制 器、自动聚焦装置以及与成像和数据采集有关的电子元件可以通过适当的数字化计算机程 序来管理。所述计算机也可以把测试中采集到的数据转化成另一种形式。另一种实施方式中，捕捉分子，例如抗体，由类似于已知的、并在流式细胞术中用 来标准化的珠子进行固定。可以用本领域已知技术和/或此处所述的方法将多个激活态特 异性捕捉分子附着到珠子上。可以在允许多个激活受体元件(如果有的话)结合于多个固 定化捕捉分子的条件下，将这些被共轭的微珠与样品接触，样品优选为细胞提取物。可以向 固定化的激活态特异性抗体_激活态受体分子复合物中加入第二批包括带有独特标记的 非激活态特异性捕捉分子，并且珠子可以通过流式细胞术基于各个标记的存在进行分�。� 其中标记的存在指示相应的第二捕捉分子的结合性以及相应的被激活受体的存在。
一俟检测完激活态特异性捕捉分子和对照捕捉分子的荧光后，就可以比较它们的 荧光。此处除非上下文表明另有含义，术语“相关联”或“比较”或其语义等效表述可互换使 用。相关联/比较意味着以任何一种方式对第一个分析的表现和/或结果与第二个分析的 表现和/或结果进行比较。例如，正如下文详细叙述的，经受MAPK抑制剂处理的样品中的 MAPK活性水平与未经受同一抑制剂处理的另一样品中的MAPK水平不同。通过确定特定的 活性水平，MAPK蛋白的活性可以作为特定疾状况状的指示剂或者预后的预报器，从而使活 性和疾病状况状态“相关联”。在本文其它部分讨论的疾病和病况中，疾病或病况可以表征 为当暴露于泛激酶激活剂时激活应答的缺失。相似地，本文其它部分描述了疾病或病况对 治疗的响应性可以通过评估不同捕捉分子的荧光以判定泛激酶激活应答的重现性而确定。在另一个实施方式中，激 活的信号转导途径蛋白的荧光可以比照未激活信号转导 途径蛋白的荧光来评估。这样的评估的目的在于可以分清激活的与未激活的样品、或者激 活的样品与标准化的参比样品产生的荧光之间存在的差异。通常，这些评估包含二级关联 步骤。在至少一些实施方式中，未激活的参比样品是所用样品的第二个等分试样。在一个实施方式中，标准化参比样品是未激活样品在高度可重复条件下处理后的 预期荧光的生产商设定值。这些类型的标准化参比值预期用作数值的替代物，所述数值是 终端用户运行平行的未激活样品所能得到的数值。这些标准化参比值的一个目的是，为终 端用户实现劳动效率，终端用户不再需要运行平行样品并节约与运行该平行样品相关的劳 力和试剂成本。诊断试剂盒的生产商，如贝克曼考尔特公司，在对其试剂及试剂盒的标准化 参比值的制定上有丰富的经验。本发明的免疫分析法提供了与本领域现有的测定法相比更高的特异性。特异性通 过有力的对照而实现。具体来讲，在已有技术中，在特定细胞中进行特定标记物阳性细胞百 分比的测量。通常，细胞用一种抗体同型对照进行染色。然后测量MAPK通路蛋白的信号并 将活性减去背景信号来报告活性。由于很多信号的强度很弱，且本性非常短暂，背景的高水 平使得这些分析方法无法用于临床测试。本发明中，蛋白的胞内表位通过清洁剂和醇处理 被解掩蔽。从而，内标以及不同活性的复合分布可确保特异性。在一个实施方式中，流式细 胞术采用侧向和前向散射光与细胞表面标记CD14的表达相结合来识别单核细胞。在进一 步的实施方式中，测量未刺激和LPS刺激下MAPK蛋白的活性。该活性可以被报告为被刺激 的细胞与未被刺激的细胞的活性比例，或者信噪(S/N)比。这一比例提供了真实的基线测 量，并且帮助减少现有技术分析方法中不受欢迎的高背景水平。正如此前指出的，通过采用本发明所述方法，可以取得信噪比大于10。在其它实施 方式中，通过使用本处所述的方法能取得信噪比大于20、大于30、甚至大于50。应当理解，本发明的多数实施方式中，信噪比可能根据所评估的信号通路蛋白的 不同而变化。因此，有些信号通路蛋白固有地会比其它蛋白产生较高的噪音。因此，在某些 实施方式中，一个一级信号通路蛋白取得例如信噪比约为10，而二级信号通路蛋白取得例 如信噪比约为20。正如上文举例说明的，某些癌症或者疾病以信号转导途径信号蛋白的系统性激活 为特征。当这些异常样品用本发明所述方法表征时，该分析方法并不能分清未处理样品和 泛激酶激活剂激活过的样品。事实上，信号转导途径信号蛋白已经处于激活状态。在某些实施方式中，本发明涉及监测给药于患者的信号转导途径蛋白抑制剂的活性的方法。当这些患者接受信号转导途径蛋白抑制剂时，该抑制剂关闭或者减少活化状态 的信号转导途径蛋白。通常，测量来自患者或者测试样品中的这些抑制剂的滴度，并继续给 药以维持其效力/效价。在再度给药抑制剂前一刻，可以获取患者样品(或细胞样品，用于 组织培养分析)，并且用本发明所述分析方法测试样品中的白细胞。如果抑制剂对于疾病或 者病况的治疗有效，那么该分析将显示在正常的，即非带病的样品中观察到的泛激酶响应 的再现性。因此，本发明，至少其一种实施方式，提供了一个高效、灵敏的血液分析方法来监 控以异常的信号转导途径蛋白激活为特征的疾病或状况的临床治疗的进展。应当理解，特定的信号转导相关疾病或者状况包括发炎、发热、脓毒、癌症、糖尿 病、和心力衰竭。在本发明优选的实施方式中，所述状况为脓毒症。当患者有脓毒症时，导致脓毒情况的细菌所分泌的内毒素会导致信号转导途径的 过度激活。这一过度激活在一些情况下导致患者死亡。在本发明的与脓毒检测和/或监测 有关的实施方式中，在按照本发明通常描述的方法处理后，脓毒患者的样品对泛激酶激活 剂并不响应。因此，在本发明的至少一个实施方式中，通过监测对泛激酶激活剂的无响应性 可以测出脓毒症。脓毒症通常通过对脓毒患者给药抗生素制剂进行治疗。作为监控脓毒患者临床进 展的一种方法，本发明所述分析方法可以被用来监测泛激酶激活响应的再次发生。因而，对 于脓毒症患者，之前不显示显著的由泛激酶激活剂引发的信号转导途径蛋白激活，应当理 解，当患者的样品开始显示泛激酶引起的信号转导途径蛋白激活时，表明抗生素疗法开始 对脓毒发挥作用了。在至少某些实施方式中，所述方法包括通过使用多个抗体，这些抗体可与多个受 体元件的活性的、磷酸化的同工型特异性结合，来同时测定多个信号转导途径蛋白的激活 型同工型的存在。本发明还提供了测定激酶激活的附加的方法。已知底物可被蛋白激酶特异性识别 并借此进行磷酸化。可与这些磷酸化底物特异性结合而不与未磷酸化底物结合的抗体(磷 酸-底物抗体)可用于测定样品中已激活的激酶的存在。通过使用本发明的某些实施方式，可以把信号转导途径蛋白的活性水平的变化与 很多疾病或状况的预后相关联，所述疾病或状况包括但不局限于过敏、发炎、自体免疫或 瘤形成。在特定的实施方式中，本发明提供了用于测定单细胞中信号转导途径蛋白激活状 态分布型的方法。所述方法包括通过流式细胞术基于至少两个信号转导途径蛋白的激活状 态进行细胞分检。激活态特异性抗体被用于基于信号转导途径蛋白的激活状态来细胞分 选。在特定的实施方式中，提供了用于测定单细胞中信号转导途径蛋白激活状态分布 的方法。所述方法包括提供一个细胞群并通过流式细胞术对该细胞群进行分选。在特定的 实施方式中，细胞按照至少2个信号转导途径蛋白的激活状态进行分离。在特定的实施方 式中，使用了多个信号转导途径蛋白的激活态抗体，以便同时测定多个信号转导途径蛋白 的激活状态。在特定的实施方式中，通过流式细胞术基于至少两个信号转导途径蛋白的激活状 态进行的细胞分选可和其它流式细胞术的可读输出值的确定相结合，其中所述输出值是诸如表面标记的存在、粒度、细胞大小等，从而提供多个受体元件的激活与单细胞的其它流式 细胞可读性质之间的关联。在某些实施方式中，利用细胞表面标记CD14的存在来识别单核 细胞群体。本发明还可用来基于复合细胞混合物如外周血单核细胞内相关的受体元件激活， 来确定细胞子集的存在。这些子集可以代表不同的分化或者激活状态，或者不同的细胞系 或者亚系。还应认识到，需要均一的细胞群用于信号转导的研究，以便细胞间的信号变化并 不定性和定量地掩蔽信号转导发生。单个细胞是均一系统的终极形式。本发明提供了用于 分析单个细胞中信号转导的方法，其中涉及的信号转导受体元件的激活态能抗原性地区别 于未激活态。这些方法还可用于在复合细胞群体比如外周血单核细胞或未处理的淋巴细胞和 记忆性淋巴细胞中，在人工和刺激条件下，不同信号层级的鉴定。在此提供的方法还可能涉及特定受体元件的特异性抑制剂的用途。在此提供的方 法还可能涉及信号通路的其它药理学抑制剂的用途。这些抑制剂可以被用作对照，以确保 抗体特异性地结合受体元件的激活同工型。例如，已知可磷酸化并激活激酶的信号转导途 径蛋白的抑制剂可被用于抑制所述激酶的磷酸化，并检查抗体是否特异性识别该激酶的磷 酸化同工型。可替代地，所述抑制剂也能用于进一步探查信号通路及蛋白活性的相关性，特 别是在单细胞中。在特定的实施方式中，信号转导途径蛋白的活性用两种以上激活态特异性抗体来 测定。在使用两种以上抗体的实施方式中，所用抗体被独特地标记，意味着识别第一个信号 转导途径蛋白的第一个激活态抗体含有第一种标记，而识别第二个信号转导途径蛋白的第 二个激活态抗体含有第二种标记，其中第一种和第二种标记都可测得并可区分，造成第一 抗体和第二抗体被独特标记。第二个信号转导途径蛋白的使用起到内标的作用，以确认测 得活性的特异性。在某些实施方式中，信号转导途径蛋白的活性用3种以上激活态特异性捕捉分子 尤其是包括单克隆抗体进行测定。在使用三种以上捕捉分子的实施方式中，所用抗体被独 特地标记，意味着识别第一个信号转导途径蛋白的第一个激活态捕捉分子含有第一种标 记，识别第二个信号转导途径蛋白的第二个激活态抗体含有第二种标记，而识别第三个信 号转导途径蛋白的第三个激活态捕捉分子含有第三种标记，其中第一、二、三种标记都可测 得并可相互区分，形成被独特标记的第一捕捉分子、第二捕捉分子和第三捕捉分子。应当理解，在评估多于一个、优选多于两个、一些实施方式多于三个的不同信号转 导途径蛋白中，本发明所述方法提供了细胞对泛激酶激活剂的激活应答的更高灵敏度。细 胞信号通路是复合系统，使用多种捕捉分子来捕捉多个通路蛋白的激活态，允许使用者能 设计出实验系统来对这些信号通路进行精确的测量和监测。特别是包括它们对设计得旨在 控制信号蛋白激活状态的治疗剂的响应。例如在下文所描述的LPS激活实验中，某些信号 蛋白对LPS激活随时间进程有着不同的响应。因此，通过对一系列激活态蛋白的监测，该系 统可以可靠地评估细胞在应答疾病或者状况下的激活状态、以及因此这些接受所述疾病或 者状况治疗的细胞的激活状态。尽管此处举例涉及胞内的磷酸一蛋白/表位，本发明所述方法同样也可用于制备样品用于测量其它转录后修饰例如泛素化、糖基化、甲基化、酰基化、棕榈酰基化、或蛋 白-蛋白相互作用。因此，本发明能实现细胞内多种蛋白的无磷酸表位的测定，进一步扩展 所述方法的用途。带标记的结合试剂可以基于所研究的特定细胞活动来作选择。本发明提 供的方法允许检测此前不能完成的细胞通路的详细时间进程以及通路特异性模式研究。虽 然可选择不同的胞内表位用于流式细胞分析，应当理解，使用者都能在综合考虑所研究的 特定表位的各种相关因素，包括例如位置、构型/结构、抗体的存在、表位的稳定性等等，来 优化和调整此处提供的方法。在此提供的方法可通用于多颜色、多参数的细胞仪分析。在另一个实施方式中，对照细胞未经LPS刺激。这些未刺激的细胞被用来提供刺 激的和未刺激的细胞之间信号水平的比值。在一个实施方式中，所述比值是LPS激活与未 激活的细胞之间平均荧光强度的差异。另一个实施方式中，对照细胞为未激活的单核细胞。 在另一个实施方式中，所述比值为LPS激活的单核细胞与未激活的单核细胞之间平均荧光 强度的差异。通过使用有力的内标，MAPK蛋白活性的差异可以容易地直观呈现，其允许使 活性与特定疾状况状之间相关联。测试化合物候选试剂从很宽范围的途径获得，正如本领域人员所了解的那样，包括合成的或 天然的化合物文库。正如本领域人员所了解的，本发明提供了一个快速简便的方法，用来筛 选任何候选调节剂文库，包括很宽范围的已知组合化学文库。在特定的实施方式中，提供了一种筛选能够抑制信号转导途径蛋白活性的生物活 性试剂的方法，包括将细胞与推定的生物活性试剂接触，并通过流式细胞术测定所述细胞 中信号转导途径蛋白的激活。术语“推定的试剂”、“推定的抑制剂”、“推定的治疗剂”或“推定的信号转导途径 抑制剂”是指任何分子，例如蛋白质、小的有机分子、碳水化合物(包括多糖)、聚核苷酸、脂 质、等等，它们可被评估以供判断其在影响信号转导途径蛋白的信号上的能力。通常多个分析混合物可以采用不同的试剂浓度来平行进行，以此获得应对不同浓 度的区别应答。典型地，所述浓度中的一个用作阴性对照，即浓度为零或者低于检测水平。 此外，还能用阳性对照。在至少一个实施方式中，推定的激酶抑制剂的效力通过将含有白细胞的样品暴露 于推定的激酶抑制剂，以激活所述含白细胞样品中至少一个信号转导途径中当该样品暴露 于泛激酶激活剂时可激活的蛋白，保存血样，再将样品中保存的白细胞的胞内表位解掩蔽。 再通过把样品中保存白细胞的解掩蔽胞内表位与多个可检测的带标记捕捉分子接触，来检 测样品中信号转导途径蛋白的激活态，所述多个捕捉分子包括至少两个不同的能与血样中 保存的、激活白细胞中两个不同解掩蔽胞内表位相结合的捕捉分子。在这一实施方式中，保 存的激活白细胞通过使用前文所述的免疫分析方式中的一种来检测。在某些实施方式中， 荧光检测可测定与激活态解掩蔽胞内表位相结合的带标记的捕捉分子。保存的白细胞也相 似地被测定。因此，在某些实施方式中，免疫分析可检测由于结合了对照捕捉分子而被捕捉 的保存的白细胞的荧光。在这一实施方式中，通常，有一个平行样品在相同条件下被处理，但没有暴露于推 定的激酶抑制剂。从被暴露于推定激酶抑制剂的细胞测得的荧光可以接着与从未处理样品，即未暴 露于推定的激酶抑制剂的样品，所测得的荧光进行比较。在未处理样品的情形中，泛激酶激活剂将激活可利用的信号转导蛋白，并且荧光的位移将被观察到。然而，由于推定的抑制剂 有效地影响信号转导途径蛋白激活，与对照样品相比，荧光的位移或者观察不到，或者位移 较不显著。荧光位移被关闭或者减弱的程度与推定抑制剂的效率相关联。应当理解，前面刚叙述的实施方式中，平行对照样品的使用是可选的。推定的激酶 抑制剂的活性可以在同管分析方式中使用合适的对照来监测。在至少一个实施方式中，本发明提供了识别能影响核糖体S6通路激活的推定抑 制剂的方法。如实施例1所示，核糖体S6通路的激活需要同时抑制ERK和PI3K信号蛋白。 因此，当鉴于所述分析旨在测试推定的ERK抑制剂时，将样品暴露于推定的抑制剂和一个 已知的PI3K抑制剂，如LY294002。当观察到核糖体S6蛋白的激活受到影响时，推定的抑制 剂在影响ERK信号上是有效的。类似地，当所述分析旨在测试推定的PI3K抑制剂时，将样 品暴露于推定的抑制剂和一个已知的ERK抑制剂，如U0126。当观察到核糖体S6蛋白的激 活受到影响时，推定的抑制剂在影响PI3K信号上是有效的。显然可以理解，核糖体S6通路并不是唯一的为了将整个通路关闭需要抑制多个 通路成员的通路。其它类似例子为本领域技术人员所已知，它们皆应包含在本发明保护范 围内。推定的试剂包括大量化合物种类。在特定的实施方式中，候选试剂为小分子。在 另一个实施方式中，候选试剂为有机分子，特别是小有机分子，包含有为与蛋白质发生结构 相互作用所需的官能团，特别是氢键，典型地至少包括氨基、羰基、羟基或羧基，优选为至少 2个化学官能团。候选试剂经常包括环状碳或杂环结构和/或被一个或多个化学官能团取 代的芳香或聚芳香结构。在特定的实施方式中，推定的试剂为合成化合物，如上所述，与信号转导途径蛋白 相连。本方法的一个优势在于，无需在分析之前对候选试剂进行表征。通过使用本发明所 述方法，任何候选试剂都能被筛选其调节(例如增强或减弱)可激活蛋白活性的能力。可替代地，特定的实施方式使用天然化合物文库作为推定的试剂，其形式有可购 买的或者方便制得的细菌的、真菌的、植物的和动物的提取物。此外，天然或者合成方法制 备的候选库和化合物可以方便地通过传统化学、物理、生物化学方法被修饰。已知的药理学 试剂可经受定向的或者随机的化学修饰包括酶法修饰，来制成结构类似物。在特定的实施方式中，推定的试剂是由约2个到约50个、优选约5个到约30个、 更优选约8个到约20个氨基酸组成的肽。这些肽可以是如前所述的天然蛋白的消化物、随 机肽、或“有偏的”随机肽链。术语“随机”是指每个核酸以及肽都分别由基本随机的核苷 酸和氨基酸构成。由于这些随机肽(或者核酸)通常为化学合成，它们能在任意位置并入 任何核苷酸或者氨基酸。合成方法可设计成产生随机的蛋白质或者核酸，以允许形成序列 长度中所有或者大多数可能的组合，从而生成随机化的候选生物活性蛋白类制剂库。这样的库能提供一个随机试剂的集合，其在结构上的多样性足以产生一个统计学 意义上充分的多样性范围，以允许与特定的可激活蛋白相互作用。相应地，一个相互作用文 库必须足够大，以使至少一个成员会具有这样一个结构该结构能与可激活蛋白、或者涉及 该可激活蛋白的信号转导途径中其它特定成分相互作用。尽管很难估量一个相互作用库所 需要的绝对规模，大自然中提供的免疫应答的启示是多达IO7至IO8种不同抗体的多样性 提供了至少一种组合能以充分的亲和性与一个生物可能遭遇的大多数抗原进行相互作用。已发表的各种体外筛选技术也显示，库的规模到IO7至IO8就足以找到对目标具有亲和性的 结构。一个长度具有7到20个氨基酸的肽的所有组合的文库，正如此处大体提出的，可以 达到207 (109)到202°个。因此，使用IO7到IO8个不同分子的文库，现有方法允许从长度为 7个氨基酸的库中得到理论上完整的相互作用库中的一个“工作”子集，为202°的库形式的 子集。因此，在优选的实施方式中，在所述方法中同时分析至少106、优选至少107、更优选至 少108、并且最优选至少IO9个不同的序列。优选的方法可将库的规模及其多样性最大化。在一个实施方式中，所述库被完全随机化，没有序列偏好或者任何位置的恒定。在 特定的实施方式中，所述库是有偏的。也就是说，序列中的一些位置或者保持恒定、或者从 有限数量的可能性中选择。例如，在特定的实施方式中，核苷酸或者氨基酸残基在一个限定 的种类内被随机化，例如疏水性残基、亲水性残基、空间偏向性(或大或小)残基、倾向形成 半胱氨酸、方便交联、用于SH-3结构域的脯氨酸、用于磷酸化位点的丝氨酸、苏氨酸、酪氨 酸或者组氨酸等等，或者嘌呤等等。在特定的实施方式中，所述有偏向是指倾向于和已知类别的分子相互作用的肽或 者核酸。例如，当候选试剂为肽时，已知很多胞内信号发出由蛋白质上的短区域与其它蛋白 质通过小的肽结构域相互作用来进行。例如有研究显示，HIV-I包膜胞内结构域上的一个 短区域阻断了细胞钙调蛋白的作用。Fas的胞内结构域中的区域，该域显示与黄蜂的黄蜂 毒素有同源性，可被限制于一小段肽区域，该肽区域具有诱导死亡的细胞凋亡或者G蛋白 诱导功能。蛙皮素，一种来自于非洲蟾蜍的天然肽，可能具有抗肿瘤、抗微生物的活性。蛋 白激酶C同工酶(β PKC)的短肽片段已显示能阻断非洲蟾蜍卵细胞受刺激后β PKC的核转 位。而且，短的SH-3目标肽已被用作SH-3蛋白特异性结合的伪底物。这里当然仅罗列已 有的具备生物活性的肽中的几个，这方面有大量文献。因而，对于小分子肽在胞内信号级联 中有活性的潜力已有很多先例。此外，也能使用任意数量分子的拮抗剂来作为候选抑制剂 的有偏随机化的基础。因此，许多分子或者蛋白结构域适用于作为产生有偏随机候选抑制剂的起点。已 知有大量小分子结构域可赋予常见的功能、结构或者亲和性。此外，本领域技术人员已知， 氨基酸同源性弱的区域可以有强的结构同源性。许多这些分子、结构域、和/或相应的一致 性序列是已知的，包括但不局限于SH-2结构域、SH-3结构域、普列克底物蛋白、死亡结构 域、蛋白酶裂解/识别位点、酶抑制剂、酶底物、以及Traf。在特定的实施方式中，所述推定的抑制剂是一种多肽。在另一个实施方式中，所述 多肽是含有至少4-20个氨基酸的环状肽。在另一个实施方式中，所述多肽是一种催化惰性 的多肽。催化惰性的多肽实例有，包括但不局限于催化惰性的可激活蛋白，和，更具体的， 催化惰性的激酶(例如PI3K)或者胱天蛋白酶。在更进一步的实施方式中，所述候选的调 节剂是一个可激活蛋白的肽片段，其中所述肽片段包含的氨基酸序列为该可激活蛋白的全 长氨基酸序列中的部分序列。应当意识到，可以在同一时间进行多个类型候选试剂的筛�。缤ü诒痉⒚� 所述方法中进行各候选试剂的组合。从而，推定试剂的库可以包含仅一种类型的试剂(即 肽)、或者多种类型(肽和有机试剂)。所述组合是指在能提升活性的条件下，在体外反应混合物中或者体内细胞中组合 各种不同组分，其中所述的活性应当能用已知方法或者本发明提供的方法(例如，抗体与相应抗原或者可激活蛋白的同工型或者可激活蛋白的激活态相结合)测出。本分析方法为 非限定的应当理解，在此提出的分析方法的顺序可以改变。但是，也应当理解，尽管此处给 出了不同的选择(对于化合物、选定的性质或者步骤的顺序)，所述选择都是单独给出的， 并且每一个都可以独立于此处提供的其它选择而进行。而且，本领域显而易见的且已知的 能够提高分析灵敏度的步骤也应当在本发明的范围内。例如，可以有附加的清洗步骤、封闭
步马聚等ο在特定的实施方式中，反应混合物或者细胞被置于96孔板或其它市售的多孔板 的加样孔中。在可替代的实施方式中，反应混合物或细胞加至流式细胞仪。本发明可使用 的其它多孔板包括但不局限于384孔板和1536孔板。本发明当然也可使用其它容器盛放 反应混合物或者样品。在为测定信号转导途径蛋白的激活状态或者活性、或者此类激活状态或活性的抑 制而进行的分析中，组分的添加可以在适合于待分析的活性的条件下，依次或者按照预先 确定的顺序或者分组进行。所述条件在此已有叙述，并为本领域所已知。在特定的实施方式中，发明所述方法包括液体处理组件的使用。液体处理系统可 包括含有任何数量构件的自动机械系统。此外，此处列出的任何或者所有步骤均可自动化， 因此，举例来讲，系统可以完全或者部分自动化。应当意识到，有很宽泛的组件品种可以使用，包括但不局限于一个或多个机械 臂；布置平板所用的平板管理器；用来从无交叉污染的平板的加样孔上将封盖移除或归位 的自动盖或帽处理器；用一次性吸头进行样品分配的吸头装置；用于样品分配的可清洗吸 头装置；96孔加样�？椋焕淙词约良埽晃⒖装寮右浩鞫ㄎ�(可带冷却功能)；平板和吸头的 叠置塔；以及计算机系统。全自动机械或者微流系统包括带有高通量移液的自动液体、颗粒、细胞以及生物 处理系统，可完成筛选应用中的所有步骤。该系统包括液体、颗粒、细胞以及生物的操作比 如吸取、分配、混合、稀释、清洗、精确的体积传输；移液器吸头的取得和丢弃；以及由单次 样品吸取进行多次相同体积的重复吸取以供多次给液。这些操作均为无交叉感染的液体、 颗粒、细胞或者生物传输。在特定的实施方式中，使用对分析组分具有特异性的化学衍生的颗粒、平板、柱套 (cartridge)、小管、磁性粒子、或者其它固相基质。微孔板、小管或者任何固相基质的结合 表面包括非极性表面、高极性表面、改性葡聚糖涂布以提高共价结合性、抗体涂布、用于结 合融合蛋白或者肽的亲和性介质、表面固定的蛋白质如重组蛋白A或G、核苷树脂或涂层、 以及对本发明有用的其它基质。在特定的实施方式中，在可升级的�？榛教ㄉ献坝卸杂Χ嗫装�、多管、固定器、 柱套、迷你试管、深孔板、微量离心管、冻干管、方孔板、过滤器、芯片、光纤、珠子、及其它固 相基质的平台或者具有不同体积的平台以提供额外的处理能力。该�？榛教òㄒ桓霰� 速轨道振动器、提供样品来源的多位置工作台、样品和试剂稀释、分析平板、样品和试剂贮 液器、移液器吸头、以及一个活动的清洗站。在特定的实施方式中，带有一个或多个磁性探针、亲和性探针的可互换移液器头 (单道或者多道)或者吸液管可自动地操作液体、颗粒、细胞、以及生物。多孔或者多管磁性分离机或者平台以一个或者多个样品的形式来操作液体、颗粒、细胞、以及生物。用所公开的分析方法识别的化合物有潜力用于治疗多种疾病状态，包括过敏、自 体免疫以及瘤形成。此类化合物的用量应当是能对信号转导途径蛋白产生期望的抑制程度 的用量，通常在0.001和10000 μ M之间。试剂盒为方便使用，本发明所述方法可以以试剂盒的方式提供。这样的试剂盒是包装好 的组合，包括的基本要件有(a) —种泛激酶激活剂；(b)可与至少一种信号转导途径蛋白 相结合的至少一种捕捉分子；以及(c)关于如何使用这些试剂进行本发明方法的说明。在 特定的实施方式中，所述试剂盒包含能与至少两种信号转导途径蛋白结合的至少两种捕捉 分子。在特定的实施方式中，所述试剂盒包括能与至少三种信号转导途径蛋白结合的至少 三种捕捉分子。在一个实施方式中，所述试剂盒能进一步地提供信号转导途径蛋白的抑制剂。这 些抑制剂可用于确认该信号转导途径蛋白抑制剂对于目标蛋白的特异性，并且并不普遍地 抑制细胞内的多个功能。在特定的实施方式中，所述信号转导途径抑制剂是MAPK通路蛋白 抑制剂。多个MAPK通路蛋白抑制剂已有市售，包括但不局限于U0126、Ly294002、AZD6244、 PD0325901、XL518、寄端霉素、炭疽致死因子、RAF265、PLX4032、XL281、Bay 43-9006、和 ZarnestrBo在另一个实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于捕捉分子的固相支持物，该支 持物可以单独提供，也可以呈捕捉分子已固定化于其上的元件形式提供。因此，试剂盒中的 捕捉分子或者可以已经固定化在固相支持物上，或者可以变得固定化到试剂盒中所包含的 支持物上、或者从试剂盒外单独提供的固定物上。所述捕捉分子可标记有酶，所述试剂盒通 常包括该酶所需要的底物和辅因子，标记可以是荧光团、提供可检测发色团的染料前体，标 记也可以是单独的或者共轭于发色团的生物素、亲和素例如亲和素、链霉亲和素。所述试剂盒可以进一步包括一份说明书，描述如何用试剂盒进行分析。实施例实 施例1 全血样品中LPS激活MAPK信号的方案将100 μ 1的血样加入12X75mm的试管的地步。用棉签除去试管壁上的血以消除 可能由未固定细胞导致的潜在的样品污染。在激活管中加入IOOng脂多糖(LPS)(向对照 管中加入相同体积的磷酸盐缓冲液(PBS))，并把试管放入37°C水浴。经过不同的孵育时间后(例如1分钟到60分钟)，从孵育箱中取出第一管，向管中 加入65μ1的10%甲醛。混合试管，并放到试管架上，室温孵育。经过精确的10分钟甲醛 孵育后，向各管中加入Iml溶解/透化缓冲液(500ml PBS中加入585 μ ITriton Χ-100的 10%母液，成为0. 1165%的Triton Χ-100溶液，室温暗处存放，使用前预热至37°C )，剧烈 震荡后放回试管架。室温孵育15分钟。向各管中加入2ml冷的清洗缓冲液(加有4% FBS的含或不含Ca++/Mg++的PBS， 0.22 4!11过滤器无菌过滤，4°0。各管在500X g下离心4分钟。从离心机中取出各管，抽 出上清液。向各管中加入Iml冷的(4°C)50%甲醇并震荡。所有试管在冰浴中放置10分 钟。然后将各管在500X g下离心4分钟，抽出上清液。向各管中加入2ml冷(4°C )的 清洗缓冲液。各管在500X g下离心4分钟。从离心机中取出各管，抽出上清液。加入抗体和冷的清洗缓冲液至终体积为100 μ 1，室温孵育30分钟。加入2ml冷(4°C )的清洗缓冲液，混合后离心。将细胞重悬浮于Iml的清洗缓冲液，震荡并在流式细胞 仪上进行分析。使用上述技术，发现未被刺激的全血以基础水平表达MAPK通路的几个成员，包括 p38、SAPK/JNK、以及ERK(图2)。当相似样品经过LPS孵育时，与未刺激的对照相比，MAPK 通路的激活相当显著(图3)。使用本发明所述方法，追踪了 LPS刺激随时间变化的动力学 (图4-6)。在此，ERK于LPS在37°C刺激2分钟后显示了最早的激活，早于JNK或者p38的 激活(图4)。受LPS在37 °C刺激6分钟后，初始的ERK活性出现减弱(图5)。在此后的时 间点(约10分钟)，p38、JNK和ERK增加。在LPS激活60分钟后，所有3个MAPK通路的活 性都已减弱，但未回到基线水平(图6)。如果添加补充的LPS，不同的MAP激酶显示特殊的 标志性应答模式。LPS刺激还显示了抑制核糖体S6蛋白磷酸化的模式(图7)。核糖体S6蛋白的磷 酸化发生在氨基酸Ser235、Ser240、Ser244、以及Ser247上。磷酸化的抑制在同时添加ERK 通路抑制剂(例如U0126)和PI3K抑制剂(例如LY294002)后能观察到，表明必须同时抑 制ERK和Akt通路才能避免LPS诱导的核糖体S6蛋白激活(图8)。这些实验显示，全血的 LPS刺激能提供一个快速、实用的技术来监测所有3个MAPK通路，以及PI3K (Akt)和NF κ B 的激活。详细来说，本方法提供了一种测量用药物(例如分子靶向性信号通路抑制剂)在 体内和体外对这些通路进行抑制的手段，并提供了一种方法来监控接受特定信号转导途径 抑制剂的体内治疗的患者中单核细胞(作为替代目标)的功能活性。实施例2:基于流式 细胞术的脓毒分析本研究中，同时测量了 4个不同的信号磷酸一表位包括P-ERK、P_p38 MAP激酶、 P-SAPK(应激激活性蛋白激酶)、以及P-S6核糖体蛋白(新的多肽合成的一种度量)。本分 析方法在“未处理的”全血和先行暴露于LPS激活(“重激活”)的全血样品中采用了 LPS激 活的时间过程测量。本分析还使用了前面所述的固定和透化方法来测量细胞表面(以CD14 识别单核细胞)和胞质的或者核内的磷酸_表位(P-ERK、P-p38、P-SAPK和P-S6。本分析 还使用了内部阴性对照来分析数据，依赖于群体，而非同型对照，并且测量MFI (平均荧光 强度)的变化而不是阳性的百分比。下面为本研究的获得的各单独标记的结果，还有对本研究中标记的使用和所用分 析方法的改良。P-ERK 如图9所示，在正常样品(未先行暴露于LPS)中，LPS诱导了 ERKMAP激酶 的快速激活，特征为一个早期峰，P-ERK的降低，和LPS刺激10-15分钟后的第二峰。P-ERK 第二峰的出现与P-P38和P-SAPK达到最高水平的时间相同。可以相信，第一个P-ERK峰是 由PI3激酶推动，而第二峰则可能通过经典的由TLR4引起的MAPKKK > MAPKK > MAPK通路 推动。当再暴露于LPS时(图10)，P-ERK的MFI与0时刻的对照相比，直至LPS再刺激90 分钟内都没有显著的变化。P-p38 在来自正常供体的未刺激全血样品中约有10-15%的单核细胞(⑶14+)表 达P-p38(图11，左上)。经过初始LPS刺激后，全部单核细胞群体(约100% )显示了 MFI 的显著增强，应答在LPS刺激15分钟后达到MFI的最高值。P-p38的水平并不返回基准水 平，甚至持续到120分钟后，显示出了图11左下图所示的双峰分布。约有50%的单核细胞 保持了与初始应答15分钟后所见相同的MFI，而其余则显示了在未刺激样品中多数细胞的MFI，导致在阳性和阴性群体之间合计的MFI。LPS再度刺激后，MFI值增加，在刺激15-20分 钟后达到峰值，此后又回归到在初始LPS应答90-120分钟后所看到的双峰群。PzSg 在正常个体中，未刺激单核细胞中P-S6处于低水平，约10%的单核细胞显 示出不同种类的阳性P-S6表达(图12，左上)。LPS刺激15-30分钟后，P-S6水平达到峰 值，与其作为P-ERK激活的次级下游激活相一致。不同于P-ERK和P-p38，P-S6水平在LPS 刺激后持续了超过120分钟(图12，左下)。LPS再度激活后，P-S6群体的MFI几乎没有变 化，而MFI缓慢减弱，如图12右下图所示。P-SAPK =P-SAPK的水平在初始LPS激活后会提高，15分钟后达到峰值。与P_p38 的水平相似，直至刺激120分钟后，P-SAPK水平仍未回到基准水平，显示出还有30-40%的 P-SAPK阳性单核细胞，合计的MFI反应了阴性和阳性群体的百分值和荧光强度的综合值。前文描述了本发明的各种实施方式，应当理解，这些仅为提供的实施例，而不是用 于进行限制。相关领域的技术人员显然在不脱离本发明的实质和范围的情况下，就可以对 这些方式进行各种形式上和细节上的改变。因此，本发明的广度和范围不应当限定于上面 描述的示范性实施方式，而应当根据下列权利要求及其相同意义来确定。
权利要求
1.一种测定在含有白细胞的样品中信号转导途径信号蛋白的激活状态的方法，包括a)将含有白细胞的样品暴露于泛激酶激活剂，以激活该样品的白细胞中的至少一种信 号转导途径中的可激活蛋白；b)用保存剂保存激活后的样品；c)将所述样品中被保存白细胞的胞内表位解掩蔽；d)使被保存的白细胞中解掩蔽的胞内表位与多个经荧光标记的捕捉分子相接触，所述 多个捕捉分子包括至少两种不同的捕捉分子和至少一种对照捕捉分子，所述至少两种不同 的捕捉分子能结合至所述样品中被保存、被激活的白细胞中至少两个不同的解掩蔽的胞内 表位的激活态，其中所述对照捕捉分子可结合至位于被保存的白细胞上未被泛激酶激活剂 激活的表位上；e)检测由于所述捕捉分子结合至解掩蔽胞内表位的激活态而捕捉到的被保存、被激活 的白细胞的荧光性；f)检测因所述对照捕捉分子结合而捕捉到的被保存的白细胞的荧光性；以及g)比较由所述捕捉分子捕捉的被保存、被激活的白细胞所检测到的荧光性和由所述对 照捕捉分子捕捉的被保存的白细胞所检测到的荧光性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括h)将步骤g)中测得的荧光比较相对于在未激活的参比样品中测得的荧光比较进行评估。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述未激活的参比样品是所述样品的第 二个等分试样。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述未激活的参比样品是标准化的参比样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活持续进行约1分钟到约10分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述激活至少持续约30分钟。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品来自患者，当激活的和未激活的 样品的荧光性大致相当时，对荧光性的评估指示所述患者患有与信号转导相关的疾病或者 状况。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述与信号转导相关的疾病或者状况为 炎症、自体免疫、过敏、发热、脓毒、癌症、糖尿病、或者心力衰竭。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述与信号转导相关疾病或状况为脓毒。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，进一步包括对取自已经接受过治疗剂以 治疗炎症、发热、脓毒、癌症、糖尿病、或者心力衰竭的患者的样品重复所述步骤a)到g)，并 通过监控在激活的与未激活的样品之间所检测到的荧光的变化来监测所述治疗剂的效力。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述样品来自于接受激酶抑制剂的患者。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，当确定被检测的激活与未激活样品之 间的荧光性有变化时，所述荧光比较的评估指示所述激酶抑制剂对于治疗与信号转导相关 的疾病或者状况是有效的。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品已被暴露于推定的激酶抑制剂，并且所述方法进一步包括当被激活的样品不呈现所述至少一个信号转导途径的可激 活蛋白的荧光变化时，确定所述激酶抑制剂的效力。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述推定的激酶抑制剂为推定的ERK或 者PUK抑制剂，所述方法进一步包括监测核糖体S6的抑制，其中核糖体S6抑制所需的ERK 和PII的抑制通过下列方式实现i)将所述样品暴露于已知的ERK抑制剂和推定的PII抑制剂并监测核糖体S6的抑 制；或者 )将所述样品暴露于已知的PII抑制剂和推定的ERK抑制剂并监测核糖体S6的抑制。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括测量至少一个第二信号转导途径 的活性。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胞内表位包括磷酸化表位。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解掩蔽包括使被固定的细胞与醇和 清洁剂相接触。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述醇的添加浓度在约25%到约90% 之间。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述醇选自下组乙醇和甲醇。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保存剂为甲醛、多聚甲醛、或者福尔 马林。
21.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述清洁剂的浓度在约0.到约10% 之间。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述清洁剂选自下组=TritonX-100、 Nonidet P-40 (NP-40)以及 Brij-58。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测通过血细胞计数来完成。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号转导途径蛋白选自下组PI3K、 核糖体 S6 蛋白、p44/42 MAP 激酶、TYK2、p38 MAP 激酶、PKC、PKA、SAPK、ELK、JNK、cJun、RAS、 Raf、MEK 1/2、MEK 3/6、MEK 4/7、ZAP-70、LAT、SRC、LCK、ERK 1/2、Rsk 1、PI2、SYK、PDKl、 GSK3、FKHR、AFX、PLCg、PLCy, FAK, CREB, α ΠΙ β 3、Fc ε RI、BAD、p70S6K、STATU STAT2、 STAT3、STAT5、STAT6及它们的组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述信号转导途径蛋白是P38和ERK和 PI3K或核糖体蛋白S6。
26.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，所述信号转导途径蛋白是P38、ERK和 核糖体蛋白S6。
27.根据权利要求M所述的方法，其特征在于，其中第一蛋白是JNK，第二蛋白是核糖 体S6。
28.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述泛激酶激活剂是一个toll样受体 4(TLR4)激活剂或脂多糖(LPS)。
29.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕捉分子是抗体或其抗原结合片段。
30.根据权利要求四所述的方法，其特征在于，所述抗体对于所述信号转导途径蛋白 的磷酸化状态具有特异性。
31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于，所述磷酸化状态特异性抗体选自下组 抗-磷酸-p44/42 MAP 激酶(Thr202/Tyr204)、抗-磷酸-TYK2 (Tyrl054/1055)、抗-磷 酸-p38 MAP激酶CThrl80/Tyrl8》、磷酸-PKC-PAN底物抗体、磷酸-PKA-底物抗体、抗-磷 酸-SAPK/JNK(Thrl83/Tyrl85)、抗-磷酸-酪氨酸(P-tyr-100)、抗-p44/42 MAPK、抗-磷 酸-MEK1/2 (Ser217/221)、抗-磷酸-p90RSK (Ser381)、抗-p38 MAPK、抗-JNK/SAPK、抗-磷 酸-Rafl (Ser259)、抗-磷酸-Elk-I (Ser383)、抗-磷酸-CREB (Ser 133)、抗-磷酸-SEKl/ MKK4 (Thr261)、抗-磷酸-Jun (Ser 63)、抗-磷酸-MKK3/MKK6 (Ser 189/207)、抗-AKT、 抗-磷酸-FKHR、抗-FKHR、抗-磷酸 _Gsk3 alp21、抗-pAFX、抗-PARP、抗-BAD、抗-BADser 112、抗-BADser 136、抗-磷酸-BADser 155、抗-p27、抗-p21、抗-cFLIP、抗 MYC、抗-p53、 抗-顺1 、抗-11^0、抗-Ilck β、抗-磷酸-酪氨酸以及抗-磷酸-苏氨酸。
32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记选自下组化学发光标记 和FRET标记。
33.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为全血。
34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包括从全血样品中分离出的白 细胞。
35.一种用以监测信号转导途径的激活状态的试剂盒，其包括a)泛激酶激活剂；以及b)至少两种不同的捕捉分子，它们能和至少一个选自下组的信号转导途径蛋白相结 合P38、ERK、PI3K、JNK以及核糖体S6，其中至少一种捕捉分子可与PI3K、JNK相结合，或者 与核糖体S6相结合。
36.根据权利要求36所述的试剂盒，其特征在于，所述泛激酶激活剂是toll样受体4 激活剂或者LPS。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其特征在于，至少一个捕捉分子可与PI3K、JNK或 者P38结合，而另一个捕捉分子可与核糖体S6结合。
全文摘要
本发明提供了用于测定信号转导途径信号蛋白的方法和试剂。本领域需要一种能准确检测信号转导抑制剂在患者体内效率的测试方法，也需要其它检测和监控一些与信号转导途径信号蛋白的异常活化有关的疾病或紊乱的方法。本发明提供了一种高灵敏度的分析方法，该方法还可用于难以在其体内获得大量样品的患者群体例如新生儿。
文档编号G01N33/53GK102144161SQ200980135080
公开日2011年8月3日 申请日期2009年9月4日 优先权日2008年9月4日
发明者T·文森特·尚奇, 戴维·赫德利, 苏珊·乔 申请人:大学健康网络, 贝克曼考尔特公司
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