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专利名称：体液中人组织激肽释放酶的测定方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及脑缺血的诊断技术，特别是体液中人组织激肽释放酶的测定方法及在脑缺血诊断试剂盒中的应用。
背景技术：
组织激肽释放酶是在血液，其他体液和组织中发现的一种蛋白酶，它的活性代谢产物为激肽，激肽具有强烈的血管扩充活性；组织激肽释放酶可以以游离形式存在，或与它的天然抑制剂，如组织激肽释放酶抑制剂结合成复合物存在。脑组织中的组织激肽释放酶-激肽系统参与心血管功能的中枢调节(Madeddu P.et al.，Hypertension 1996；28980-989；Emanueli C.et al.，Br.J.Pharmacol.1999；1261769-1776)，组织激肽释放酶的产物激肽扩张脑血管网(Toda N.，Am.J.Physiol.，1997；222H267-H274)。脑组织中的组织激肽释放酶-激肽系统可由组织缺血激活。此系统通过诱导新生血管形成参与脑血流重建(Emanueli C.et al.，Circulation.2001；103125-132)。
中风是由于脑血流急性中断引起的脑血管事件，它是致死和致残的主要原因之一；脑中风通常由阻塞脑主要动脉的粥样硬化斑块进展，粥样硬化斑块破裂及其形成的栓子脱落引起。脑血管功能障碍是老年人的一个主要健康问题；随着人口老龄化进展，它越来越成为一个经济和社会问题；最近一项调查发现超过65岁的人口中10％的男性和7％的女性受到颈动脉狭窄的困扰。
流行病学研究发现高度颈动脉狭窄患者易发生中风，通过手术使梗阻动脉再通可以降低中风危险性；然而对于低度至中度颈动脉狭窄患者，综合考虑围手术期的危险性与动脉再通的好处，其手术指征不是很明显；而且颈动脉狭窄患者也可能发生急性或慢性缺血，从而发生进展性脑功能损伤。脑血流灌注情况不能够由脑血管造影准确估计。即使目前有比脑血管造影更精确的诊断技术，这种技术通常比较昂贵，不适合脑中风危险人群的普遍筛查。

发明内容
本发明的目的在于提供一种体液中人组织激肽释放酶的测定方法及在脑缺血诊断试剂盒中的应用，其测定成本低，在诊断脑缺血上的可行性好，是新的脑缺血生物标记物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为体液中人组织激肽释放酶的测定方法，具体操作过程如下1)将人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段特异性免疫球蛋白与生物样品中组织激肽释放酶反应形成免疫复合物；
2)检测生物样品形成的免疫复合物结果，将其与对照标准样品比较获得生物样品中组织激肽释放酶的含量；所述步骤2)中抗原抗体复合物的检测可以由酶联免疫方法、放射免疫方法、由酶底物生色反应或生成荧光的生物化学反应(颜色的深度或荧光的强度与组织激肽释放酶的浓度成正比)检测系统进行，检测系统指任何可检测抗原抗体复合物和定量抗原浓度的方法系统；所述的检测系统可以利用生物素-亲和素-过氧化物酶、生物素-亲和素-碱性磷酸酶、荧光素或其他本领域技术工人熟悉的复合物；所述人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段特异性免疫球蛋白可以利用本领域技术工人熟知的方法例如由人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段免疫异种动物产生并获得(产生的血清被用来制备抗体)；人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段(组织激肽释放酶片段也可以作为免疫原，如一段含有组织激肽释放酶表位的合成多肽与免疫原载体的结合物)，其作为免疫原的来源为合成的含有组织激肽释放酶表位的多肽、由从人尿液或其他体液提取纯化的组织激肽释放酶或由基因工程方法重组制备的人组织激肽释放酶；生物样品为被测定者的血液样品或其他体液样品；组织激肽释放酶可为游离形式或与其抑制剂结合形式；免疫异种动物可以为绵羊，山羊，兔子，驴，马，大鼠，猴子或其他动物；获得的抗体试剂可以为全部免疫球蛋白IgG，免疫球蛋白片段(Fab，F(ab’)2)，可以进行酶标记或固定化，如固定在微孔板，塑料或磁珠上，抗体试剂；组织激肽释放酶特异性免疫球蛋白可用于包括其自身和一个检测系统的免疫学检测程序；脑缺血诊断试剂盒，它包括人组织激肽释放酶特异性免疫球蛋白(抗体)或免疫球蛋白片段(Fab，F(ab’)2)；其中含有稀释，洗涤，维持最适酸碱度的缓冲系统；含有已知浓度组织激肽释放酶标准样品和检测系统。
以下列步骤诊断脑缺血方法(1)利用组织激肽释放酶与组织激肽释放酶特异性免疫反应测量生物样品中组织激肽释放酶含量；(2)脑缺血程度估计生物样品中组织激肽释放酶含量比正常人群组织激肽释放酶含量增高的程度与颈动脉梗塞程度成正相关，与脑血管功能障碍严重程度成正相关；其中步骤(1)为随时间收集的一系列生物样品的测定，在随时间对步骤(2)估计时，组织激肽释放酶水平升高表示梗塞程度恶化，水平降低表示梗塞程度改善。
本发明具有如下优点1.本发明揭示了血液中组织激肽释放酶是一种新的脑缺血生物标记物，通过与免疫球蛋白反应检测生物样品中组织激肽释放酶含量，以此制备了诊断试剂盒并创建了基于此试剂盒的检测方法进行脑缺血诊断和疾病进展监测；本发明的出现必然导致脑缺血诊断、治疗方案设计和疾病随诊的巨大进步。
2.检测成本低，本发明是用组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段免疫异种动物产生组织激肽释放酶特异性的免疫球蛋白，建立包括此免疫球蛋白及一种检测系统的诊断试剂盒及脑缺血免疫学诊断方法，它的应用特别有益于占人群大部分的低危险性脑阻塞患者。
3.本发明通过测量外周血中组织激肽释放酶的水平可以揭示颈动脉梗阻或狭窄患者的脑血流动力学情况(估计脑缺血程度生物样品中组织激肽释放酶与正常人群平均水平相比增加的程度直接与脑动脉梗塞程度成正比，即与脑缺血程度成正比)；揭示了脑动脉粥样硬化斑块梗阻患者组织激肽释放酶水平增高，增高水平与梗阻水平成正相关，因此衡量外周血血清或血浆中组织激肽释放酶可以说明脑缺血状态和进展情况，成为脑缺血患者是否进行颈动脉再通的衡量指标。
4.利用本发明试剂盒进行组织激肽释放酶测定是一种快捷简便的筛查方法，可以确定哪些患者急切需要颈动脉再通，哪些患者需要加强治疗和预防措施；利用此试剂盒可以衡量单个生物样品组织激肽释放酶与正常人群平均水平的偏离程度，从而获得一个脑血流灌注情况的间接指标。
5.随时间多次测量组织激肽释放酶水平可以估计其在血液样品中的变化，从而估计脑缺血程度变化，组织激肽释放酶增高说明脑缺血程度恶化，而组织激肽释放酶水平随时间或在再通术后减低则说明脑缺血改善，在双侧颈动脉阻塞患者单侧再通术后组织激肽释放酶持续不降低说明对侧颈动脉仍需要再通；利用此试剂盒进行组织激肽释放酶测定可以简单快速估计颈动脉手术再通的危险/益处比；增高的组织激肽释放酶表明需要手术干预重建脑灌流，正常的组织激肽释放酶表明可以延缓手术干预或进行损伤较小的处置。


图1为进展性颈动脉狭窄(CAS)(由血管造影发现的梗塞血管的百分比表示)患者组织激肽释放酶水平(TK单位pg/mL)分布曲线，虚线代表正常健康人群组织激肽释放酶上限。
图2为低/中度危险性(RISKS)(左侧)或高度危险性(右侧)患者组织激肽释放酶水平分布曲线柱形图。(纵坐标％patients with elevated TK)图3为内动脉切除术(简称CEA)颈动脉血管重建前，后患者组织激肽释放酶水平。(纵坐标内动脉切除术术后天数(Days after CEA))图4A为手术患者CEA术前和手术3个月后组织激肽释放酶水平。(横坐标，左侧为内动脉切除术术前(Base CEA)；右侧为内动脉切除术术后)图4B为图4A的柱形图。
图4C为双侧内动脉切除术第一次术前和手术3个月后组织激肽释放酶水平示意图。
图4D为图4C的柱形图。
图5A为2名发生围手术期缺血并发症患者CEA术前和术后组织激肽释放酶水平示意图。(横坐标左侧为内动脉切除术术前(Base CEA)；右侧为内动脉切除术术后)图5B为图5A的柱形图。
具体实施例方式
以下例作为本试剂盒应用参照。
实施例1人尿液中组织激肽释放酶的纯化利用亲和色谱方法可以从人尿液中提取组织激肽释放酶(ShimamotoK.，Chao，J.，Margolius H.S.(1980).J.Clin.Endocinology and Metabolism，51840-848)。收集12升尿液超滤浓缩至300毫升，贮存于-20度。反复冻融，经三层纱布和Nitex膜过滤，5000g离心30分钟，沉淀经35-80％硫酸铵盐析，离心收集沉淀，重溶解后透析，透析液经过DE-52纤维素层析柱，以0.1-0.5M氯化钠-0.1M磷酸盐缓冲液(pH 6.5)进行洗脱，收集具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰，对0.2M氯化钠-0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.5)进行透析，透析液经过以抑酶肽为配体的琼脂糖凝胶亲和柱，以透析缓冲液洗脱直至流出液中无蛋白，再以0.1M乙酸钠缓冲液(pH3.5)洗脱组织激肽释放酶，亲和洗脱的具有Tos-Arg-Ome酯酶活性的流出峰再经过Sephacryl S-200进一步纯化。由聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白纯度，经过上述过程由原尿到纯化的蛋白，组织激肽释放酶被纯化了2114倍。测量纯化蛋白的Tos-Arg-Ome酯酶活性和生成激肽的活性。组织激肽释放酶裂解低分子量激肽原产生激肽，激肽的量由放射免疫方法测定(Shimamoto K，Ando T，Nakao T，Tanaka，S，Sakuma M，Myyahara M.(1978)J Lab Clin Med.，91721-728)。
多克隆抗血清的制备和纯化以100毫克纯化组织激肽释放酶和氟氏完全佐剂乳液免疫雌性新西兰白兔，一个月后以50毫克上述乳液加强免疫一次，末次免疫后1-2月由耳缘静脉收集血样于玻璃试管中，立即离心(1500g/分钟，15分钟)，血清储存于-20度。将15-20毫升抗血清样品过蛋白A-cepharose凝胶柱，以0.5M磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱至基线，以0.1M甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱免疫球蛋白，洗脱条件为34滴/分钟，100滴/试管。洗脱液以0.5M Tris碱(pH9.0)中和，收集280nm吸光度大于0.15样品。
制备生物素标记的组织激肽释放酶抗体将2mg/ml纯化的兔抗人组织激肽释放酶免疫球蛋白对0.1M碳酸氢钠(pH9.5)于4度透析24小时后加入10毫升新鲜制备的生物素N-羟基琥珀酸亚胺酯，室温反应1小时后对磷酸盐缓冲液透析，加入等体积的双蒸甘油，贮存于-80度备用(197，J.Hischem Cytochem.271131-1139)。
人组织激肽释放酶特异性免疫反应以未标记的抗人组织激肽释放酶免疫球蛋白包被96孔板(2μg/ml，100μl/孔)，加入200μl含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(10mmol/L磷酸盐pH7.4 150mmol/L氯化钠)37度封闭1小时，以含0.1％Tween-20的磷酸盐洗涤液洗涤3次，每孔加入100微升纯化的人组织激肽释放酶标准品(0.4-2.5ng范围)或待测血清样品，37度反应90分钟，样品以稀释缓冲液配制，稀释缓冲液的成分为磷酸盐缓冲液加0.05％Tween-20和0.5％明胶。洗涤液洗板三次，每孔加入100微升稀释缓冲液稀释的生物素标记组织激肽释放酶抗体，(浓度为1μg/mL)，37度反应1小时，洗涤液洗板三次，每孔加入100微升稀释缓冲液稀释的亲和素-过氧化物酶(浓度为1μg/mL)，37度反应1小时，洗涤液洗板5次，磷酸盐缓冲液洗板1次，加入100微升新鲜配制的底物溶液(0.1mol/L柠檬酸缓冲液pH 4.3 0.03％ABTS，0.03％H2O2)室温反应30分钟，由酶标仪测定414或405纳米处吸光度，由组织激肽释放酶标准品对414纳米处吸光度值做标准曲线，样品组织激肽释放酶含量由与标准曲线对比获得。
本实施例中组织激肽释放酶的测定利用了双抗夹心ELISA方法，组织激肽释放酶特异性免疫球蛋白与生物样品中组织激肽释放酶形成复合物，此复合物可被连有检测系统的第二抗体识别；组织激肽释放酶的测定也可以利用放射免疫方法或其他物理，化学，色谱方法进行测定。
临床实验测定血管外科颈动脉狭窄实施血管重建或内动脉切除手术患者血清组织激肽释放酶水平，实验对象不包括患有心脏，肾脏，肝脏疾患，肿瘤或感染的患者。以年龄组配的健康人作为实验对照组。实验同时评价了吸烟，高血压，糖尿病，高胆固醇血症等危险因素。颈动脉狭窄严重程度由临床症状，Doppler PW评分和颈动脉造影确定。颈动脉造影图由两位有经验的神经放射学家来审阅，确定颈动脉梗阻严重程度。颈动脉梗阻严重程度分级由北美颈动脉内膜切除术试验合作者联合会(North AmericanSymptomatic Carotid Endarterectomy Trial Collaborators，NASCET)(N Engl JMed.，1991；325445-453)和依据Ozgur HT(Am J Neuroradiol.2001；22928-936)提出的分类重建的对侧血流模式确定，测定组织激肽释放酶的血液样品每日早8-9点由住院患者左气管静脉插管获得。采血前夜要求患者平卧。
血清样品储存于-20度，由一位不了解患者病情的研究者以上述ELISA方法平行测定组织激肽释放酶浓度。测定结果以平均数±标准差表示。以SigmaStat软件包对上述结果进行多参数和单参数统计学分析。
结果实验测定了53名患者(45名男性8名女性，年龄42-85岁，平均年龄69岁)和32名对照(29名男性3名女性，年龄40-78岁，平均年龄64岁)。其中21(40％)名患者无临床症状，17名(32％)患者经历过一过性缺血，余下15名(29％)患者患有中风，所有患者的血管造影均显示单测(N＝27)或双侧(N＝26)颈动脉梗阻。由下列标准对患者的阻塞严重程度进一步分级，(对双侧病灶患者，以狭窄严重一侧作为分级依据)
中度颈动脉狭窄50-69％狭窄(N＝10，19％)；重度颈动脉狭窄70-99％狭窄(N＝26，49％)；颈动脉阻塞(N＝17，32％)；患者对侧血流模式由血管造影检测。
由上述结果患者被分为1期(N＝2)2期(N＝6)3期(N＝16)4期(N＝4)；1期患者最轻，而4期患者最重。由Doppler检查发现32名患者斑块不稳定，Doppler检查结果由患者重建手术过程中检查得到确定，12名患者其他血管区域发现梗阻病灶。
血清组织激肽释放酶水平与颈动脉梗阻分级关系所有患者平均组织激肽释放酶水平为(1133±163pg/mL)。53名患者中有36名超过正常值(373±38pg/mL范围160-658pg/mL P＜0.05)可信上限。组织激肽释放酶水平随颈动脉梗塞分级提高而升高(参见图1)，50-69％狭窄患者组织激肽释放酶水平为(595±36pg/mL)，70-99％狭窄患者组织激肽释放酶水平为(1112±177pg/mL)，颈动脉阻塞患者组织激肽释放酶水平为(1534±426pg/mL)。上述结果显示组织激肽释放酶水平与颈动脉梗塞分级成明显正相关，检测外周血组织激肽释放酶水平是一种有效的中风危险性人群筛查手段。
血清组织激肽释放酶测定与脑缺血治疗指征患者按以下中风危险因素进行分级高危险性包括具有临床症状，70-99％程度颈动脉狭窄和颈动脉阻塞；中度危险性包括无临床症状的50-79％程度颈动脉狭窄或有临床症状的50-69％程度颈动脉狭窄。
在高危险组(参见图2，右侧)79％患者(N＝20)组织激肽释放酶水平升高。在中度危险组(参见图2，左侧)45％患者(N＝9)组织激肽释放酶水平升高。所有组织激肽释放酶水平升高的中度危险组患者中一人经历过一过性缺血，5人表现单侧颈动脉狭窄，4人表现双侧颈动脉狭窄，其余无临床症状。
由血清组织激肽释放酶水平确定危险程度的精确度达到72％。基于血管造影危险分级，62％患者需进行血管重建。但由组织激肽释放酶水平确定的需进行血管重建的患者数达到79％。
上述结果显示组织激肽释放酶升高水平与血管梗阻成正比。因此测定循环系统组织激肽释放酶水平是一种有用的脑血管功能障碍筛查方法，这种新的生物标记物对于发现有临床症状或无临床症状的中度颈动脉狭窄具有特殊意义，这种中度颈动脉狭窄需要加强目前治疗或需要血管重建手术。而目前临床上对这种中度颈动脉狭窄的治疗还存在争议，所以组织激肽释放酶对中度颈动脉狭窄的治疗具有特别意义。NASCET结果显示50-69％程度颈动脉狭窄患者接受颈动脉内动脉切除术比非手术治疗同侧脑中风中等减少。然而无症状性脑动脉狭窄发生中风危险性低，其中45％缺血性脑血管事件是由心脏栓子和其他原因引起。与上述研究不同，ACAS和VACS的两次大规模临床试验显示手术治疗比非手术治疗中风和死亡率年下降率为1.2％，从而导致实施颈动脉内动脉切除术患者数目大量增加。NASCET和VACS临床试验的一个重要缺陷是其过于依赖血管造影来进行危险性分级，而血管造影对脑血流动力学缺血的诊断能力有限，因此许多重度脑血管狭窄患者没有估计脑血流是否可由血管自然重建恢复而实施了脑血管重建手术。而中度脑血管狭窄患者被打发掉，没有充分考虑个体的血流动力学情况，事实上许多中度脑血管狭窄患者应该实施脑血流重建。最近可以通过SPECT估计脑灌流情况，但是筛查低危险人群发现严重脑血管功能障碍通常受到筛查费用和人数过多的限制。与之相比组织激肽释放酶作为脑缺血生物标记物的诊断方法费用低，简便，迅速，只需要少量实验室操作，安全性高，易于被患者接受。组织激肽释放酶作为诊断方法可以加强现有的预防措施，延缓疾病进展，改善生活质量。
组织激肽释放酶检验和脑血管功能障碍随诊在颈动脉内动脉切除术后前3天和3个月后测定组织激肽释放酶，20名患者颈动脉内动脉切除术成功，另两名患者，1名发生同侧中风，1名发生一过性脑缺血。
如图3所示，颈动脉内动脉切除术后脑灌流改善，循环系统组织激肽释放酶水平明显降低，手术后第一天，组织激肽释放酶水平下降，术后第三天达到术前一半水平，术后3个月，组织激肽释放酶水平由866±147下降到477±93pg/ml(n＝17 P＜0.02)如图4A、B所示，组织激肽释放酶水平在单侧颈动脉狭窄实施颈动脉内动脉切除术患者下降更明显。双侧颈动脉狭窄患者通常分两次实施颈动脉内动脉切除术，其第一次手术后可能不出现组织激肽释放酶水平下降(如图4C、D所示)，而第二次手术后所有患者均出现组织激肽释放酶水平下降。因此持续的组织激肽释放酶水平升高暗示残留的脑缺血病灶，需要对未手术的动脉实施血管重建。
在上述颈动脉内动脉切除术围手术期出现缺血症状的2名患者其组织激肽释放酶水平升高。
所有结果显示成功的脑血流再通总是伴随着组织激肽释放酶水平下降，，而围手术期缺血症状恶化总是伴随着组织激肽释放酶水平升高，组织激肽释放酶检验为脑血管功能障碍随诊提供了重要的信息。
总之专利申请人的研究证明了组织激肽释放酶作为一种新的生物标记物对脑血管功能障碍选择治疗措施具有指导意义。
与其他疾病诊断方法类似临床医生应将组织激肽释放酶生物标记物诊断方法与其他检验数据和临床发现相结合进行脑缺血诊断，制定治疗措施，组织激肽释放酶生物标记物检测为监测治疗效果提供了一定依据。
权利要求
1.一种体液中人组织激肽释放酶的测定方法，其特征在于1)将人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段特异性免疫球蛋白与生物样品中组织激肽释放酶反应形成免疫复合物；2)检测生物样品形成的免疫复合物结果，将其与对照标准样品比较获得生物样品中组织激肽释放酶的含量。
2.按照权利要求1所述体液中人组织激肽释放酶的测定方法，其特征在于所述步骤2)中检测是由酶联免疫方法、放射免疫方法、由酶底物生色反应或生成荧光的生物化学反应检测系统进行。
3.按照权利要求2所述脑缺血诊断试剂盒，其特征在于所述的检测系统是利用生物素-亲和素-过氧化物酶、生物素-亲和素-碱性磷酸酶、荧光素或其他复合物。
4.按照权利要求1所述体液中人组织激肽释放酶的测定方法，其特征在于所述人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段特异性免疫球蛋白由人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段免疫异种动物产生并获得。
5.按照权利要求4所述体液中人组织激肽释放酶的测定方法，其特征在于所述人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段，其作为免疫原的来源为从人尿液或其他体液提取的组织激肽释放酶或由基因工程方法制备的人组织激肽释放酶或合成的含有组织激肽释放酶表位的多肽。
6.一种脑缺血诊断试剂盒，其特征在于它包括人组织激肽释放酶特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
7.按照权利要求6所述脑缺血诊断试剂盒，其特征在于其中含有已知浓度组织激肽释放酶标准样品。
8.按照权利要求6所述脑缺血诊断试剂盒，其特征在于其中含有稀释，洗涤，维持最适酸碱度的缓冲系统。
全文摘要
本发明涉及脑缺血的诊断技术，特别是体液中人组织激肽释放酶的测定方法及在脑缺血诊断试剂盒中的应用。测定方法为首先将人组织激肽释放酶或组织激肽释放酶片段特异性免疫球蛋白与生物样品中组织激肽释放酶反应形成免疫复合物；然后检测生物样品形成的免疫复合物结果，将其与对照标准样品比较获得生物样品中组织激肽释放酶的含量；揭示了一种新的脑缺血生物标记物，其检测成本低，筛查快捷简便；以此制备包括人组织激肽释放酶特异性免疫球蛋白或免疫球蛋白片段脑缺血诊断试剂盒；其可以简单快速估计颈动脉手术再通的危险/益处比，衡量单个生物样品组织激肽释放酶与正常人群平均水平的偏离程度，从而获得一个脑血流灌注情况的间接指标。
文档编号G01N33/573GK1532549SQ0310812
公开日2004年9月29日 申请日期2003年3月20日 优先权日2003年3月20日
发明者伊曼纽李·康斯坦察, 唛德杜·保罗, 赵朱丽, 赵立, 宝库·保罗, 保罗, 伊曼纽李 康斯坦察, 保罗 申请人:赵立, 赵 立